kfas

(1)

152

서 론

염증반응은미생물감염

,

^내독소

,

^조직^손상과^같은^위해성^자 극에대한방어기능으로

,

이는생명체의구조와기능을정상적 으로유지시키기위한방어기능이다

.

염증반응은시간이지남 에따라염증촉진성매개체들의생성은감소되고

,

항염증성매 개체들이증가됨으로써스스로염증반응이억제되는조절기전 을가지고있다

(Libby and Hansson, 2015).

^대식세포

(macro-

phages)

는체내의염증반응에중요한역할을하는것으로알려

져있다

.

대식세포는

interferon-γ (IFN-γ), interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α)

와같은염증촉진성

cy-

tokines,

그리고세균세포막성분인

lipopolysaccharides (LPS)

등의자극에의해활성화된다

(Xie et al., 1994).

활성화된대 식세포는염증촉진성

cytokines

^이외에

inducible nitric oxide synthase (iNOS)

및

cyclooxygenase-2 (COX-2)

와같은효소 의발현을통해

nitric oxide (NO)

및

prostaglandin E

₂

(PGE

₂

)

와같은다양한염증매개분자들을생성하게되고

(Marks-Kon- czalik et al., 1998; Zhang and Ghosh, 2000),

이들매개체들의 지속적인생성은다양한만성염증성질환의주요한원인으로 알려져있다

.

부작용이적은항염증활성을지닌천연물의발견 은염증치료제개발을위한방편으로관심을끌고있다

.

대식세포의 염증촉진성

cytokines

및 단백질들의 발현은

LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에 대한 대황(Eisenia bicyclis) 헥산 분획물의 항염증 효과

김보운·최창근

¹

·김재일·김형락*

부경대학교 식품영양학과, ¹부경대학교 생태공학과

Anti-Inflammatory Effect of Hexane Fraction from Eisenia bicyclis on Lipopolysaccharides-Treated RAW 264.7 Cells

Bowoon Kim, Chang-Geun Choi¹, Jae-Il Kim and Hyeung-Rak Kim*

Department of Food Science and Nutrition, Pukyong National University, Busan 48513, Korea

1Department of Ecological Engineering, Pukyong National University, Busan 48513, Korea

Eisenia bicyclis is known to have secondary metabolites exhibiting various biological activities. In a preliminary study, the n-hexane fraction obtained from the ethanolic extract of E. bicyclis showed higher anti-inflammatory activ- ity than the ethyl acetate and butyl alcohol fractions based on the inhibition of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells. Using this fraction ( E. bicyclis hexane fraction, EHF), we inves- tigated the molecular mechanisms underlying its anti-inflammatory effect in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Pre- treatment of the cells with up to 50 µg/mL EHF significantly inhibited NO and prostaglandin E

₂

production as well as their responsible enzyme proteins and mRNAs, in a dose-dependent manner (P<0.05). Similarly, EHF markedly reduced the production of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin (IL)-1β, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α as well as their mRNA levels. Nuclear translocation of nuclear factor-kappa B (NF-κB) was strongly sup- pressed by EHF treatment. EHF significantly reduced the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt in LPS-stimulated cells. Moreover, EHF reduced ear edema in phorbol myristate acetate (PMA)-induced mice. These results indicate that EHF contains potent anti-inflammatory compounds, which may be used as a dietary supplement for the prevention of inflammatory diseases.

Keywords: Anti-inflammatory effect, Eisenia bicyclis , iNOS, NF-κB, Pro-inflammatory cytokines

*Corresponding author: Tel: +82. 51. 629. 5847 Fax: +82. 51. 629. 5842 E-mail address: [email protected]

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Received 29 January 2021; Revised 15 February 2021; Accepted 19 February 2021 저자 직위: 김보운(대학원생), 최창근(교수), 김재일(교수), 김형락(교수) https://doi.org/10.5657/KFAS.2021.0152

Korean J Fish Aquat Sci 54(2), 152-161, April 2021

(2)

nuclear factor kappa-B (NF-κB)

^에^의해^{전사수준에서}^조절된 다

(Marks-Konczalik et al., 1998; Rahman et al., 2006).

정상 상태의세포에서

NF-κB

는

inhibitor of kappa B (IκB)

와결합 한상태로불활성형태로세포질에존재한다

(D'Acquisto et al., 1997; Rahman et al., 2006). LPS, cytokines

과같은자극이주 어지는경우

IκB

^는

IκB kinase (Ikk)

^에^의해^인산화와^유비퀴 톤화

(ubiquitination)

를통해

proteasome

에의해분해되고

,

유

리된

NF-κB

는핵으로이동하여염증관련유전자의발현을유

도하게된다

(Elliott et al., 2003).

또한

extracellular signal-reg- ulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 ki- nase

^를^포함하는

mitogen-activated protein kinases (MAPKs)

와

PI3K/Akt (PKB)

와같은단백질인산화효소에의해

NF-κB

가활성화되어염증반응을촉진하게된다

(Marks-Konczalik et al., 1998; Kaminska, 2005).

갈조류는 다양한 종류의 생리활성물질을 함유하고 있으므 로 이들을이용하기 위하여광범위한 연구가 지속되고 있다

(Thomas and Kim, 2011).

대황

(Eisenia bicyclis)

^은^다시마과 에속하는갈조류로써우리나라와일본의해안에다량존재하 는것으로알려져있다

.

대황의주요한

2

차대사산물들은플로 로탄닌

(phlorotannin)

으로항염증

(Jung et al., 2013; Paudel et al., 2014; Yayeh et al., 2014)

^항산화

(Kim et al., 2011; Kwon et al., 2013),

간보호

(Choi et al., 2015a),

항균

(Eom et al., 2014;

Kim et al., 2018),

항치매

(Choi et al., 2015b),

항앨러지

(Sugi- ura et al., 2009),

항암활성

(Thomas and Kim, 2011)

등이보 고되고있다

.

대황주정추출물을이용한예비실험에서헥산

(hexane),

^에틸 아세테이트

(ethyl acetate)

및부탄올

(butanol)

획분으로분리하 여항염증활성을분석한결과헥산획분의항염증활성이가장 높은것으로확인되었다

.

본연구에서는대황의헥산분획물의 항염증효과및관련분자적기전을

LPS (lipopolysaccharide)

로자극한

RAW 264.7

^세포를^이용하여^{분석함으로써}

,

^염증성 질환의발병을예방또는지연시킬수있는건강기능성소재로 서의이용가능성을검토하였다

.

재료 및 방법

추출과 분획

독도 인근에서 채취한 대황

[Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell]

의건조분말

1 kg

을환류냉각기가부착된집기병에담 고주정

[95% ethanol (EtOH), v/v] 6 L

를넣어가열

, 2

회추 출하여

(72°C, 3

^시간

)

^얻은^추출액을^여과하여

rotary vacuum evaporator

로농축하였다

.

에탄올농축물

(122 g)

을

H

₂

O:EtOH (9:1, v/v)

의혼합용매로녹인후동량의

n-hexane

^을^넣어^분액 깔대기에 평형화시켜상층액의

n-hexane

가용부를 분리하였 다

.

분리된

n-hexane

^획분

(E. bicyclis hexane fraction, EHF)

^을 농축하여실험에사용하였다

.

세포 배양 및 처리

RAW 264.7

^세포

(ATCC, Rockville, MD, USA)

^는

10% fe- tal bovine serum (FBS) (GIBCO, Grand Island, NY, USA)

와

penicillin (100 units/mL), streptomycin sulfate (100 µg/mL)

을 첨가한

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Life Technology, Carlsbad, CA, USA)

을 사용하였고

, 5% CO

₂

, 37°C

^{배양기에서}^{배양하였다}

. Cell culture plate

^에

RAW 264.7 cell

이

70-80%

정도채워지면

phosphate-buffered saline (PBS)

로 한번씻어낸후

,

계대배양하였다

. EHF

는

100% dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

에 녹여사용하였고

,

세포처리전에배지에희석하여처리하였다

. 세포 독성 시험

RAW 264.7 cell

을

96-well plate

에

5×10

⁵

cells/well

로분주 하고

37C

에서

24

시간동안배양한후

, EHF

가

0, 10, 25, 50 µg/

mL

농도로희석된

DMEM (Life Technology, Carlsbad, CA, USA)

배지로교체하여

1

시간처리한후

LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1 µg/mL)

^를^함유한

DMEM

^배지에^다 시

24

시간배양하였다

.

이후

CellTiter96

^Ⓡ

Aqueous One Solu- tion Cell Proliferation Assay [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo- lium; MTS]

키트

(Promega, Madison, WI, USA)

를사용하여 제조사의방법에따라세포생존율을분석하였다

. MTS

^용액은

FBS-free DMEM (Life Technology)

에

5% (v/v)

의농도로섞 어

100 µL

씩처리하였다

. 1

시간후에

microplate reader (Glo- max Multi Detection System, Promega, Madison, WI, USA)

를이용하여

490 nm

의파장에서흡광도를측정하여세포독성

을분석하였다

.

NO 및 염증성 cytokines 생성 억제 효과

EHF

의항염증효과비교를위해

RAW 264.7

세포에서의

NO

생성에대한억제효과를분석하였다

. EHF

를

1

시간동안전처 리한다음

LPS (1 µg/mL)

로

24

시간동안자극하고

,

원심분리

(2,000 g, 4°C, 10

^분

)

^하여^배지를^{회수하였다}

. NO

^의^농도는^배 지

(100 µL)

와

Griess

시약

(0.1% naphthylethylene diamine di- hydrochloride+1% sulfanilamide+5% phosphoric acid)

을동 일한비율로반응시켜

microplate reader

로

540 nm

의파장에 서흡광도를측정하였다

.

배지중의

IL-1β, IL-6, TNF-α

의양 은

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (R&D Sys- tems, Minneapolis, MN, USA) kit

를이용하여제조사의방법 에따라측정하였다

.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

RAW 264.7

^세포

(1×10

⁶

cells/well)

^에

EHF

^를

0, 10, 25, 50

µg/mL

의농도로

1

시간동안처리한후

, LPS 1 µg/mL

의농도

(3)

로

6

^시간^동안^{자극시켰다}

.

^이후

Quiazol

^시약

(Quiagen Sci- ence, Valencia, CA, USA)

을 이용하여

total RNA

를 분리하 였다

(Kim et al., 2009). Total RNA

로부터

RT-PCR

분석에의 한

mRNA

발현양의분석은이전의보고

(Joung et al., 2012)

에 서사용한방법을이용하였고

,

유전자발현양의상대적인비교 를위해서

β-actin

^또는

glyceraldehyde-3-phosphate dehydro- genase (GAPDH)

를함께분석하였다

. PCR

반응에이용된각 각의

primer

는

Table 1

에나타내었다

.

전기영동상

band

의정 량분석은

cooled CCD camera system EZ-Capture II (ATTO

& Rise Co., Tokyo, Japan)

와

CS analyzer ver. 3.00 software (ATTO and Rise Co., Tokyo, Japan)

^를^이용하여^최소

3

^번의^반 복실험을통해얻었다

.

세포질 및 핵 단백질 추출물의 제조

NF-κB

의활성화정도를분석하기위해

EHF

및

LPS

를각

각처리한

RAW 264.7

세포로부터세포질단백질과 핵단백

질을각각분리제조하였다

(Kim et al., 2009).

^즉

, EHF

^로^처 리된 세포

(2×10

⁶

cells/dish)

를

PBS

로 세척하여 회수하고

, 180 µL

의

hypotonic buffer [10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

₂

, 0.02% NaN

₃

, 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.4]

를넣 고

, 20 µL

^의

5% nonidet NP-40

^을^첨가하여

5

^분^동안^방치하 였다

.

이후원심분리

(1,800 g, 4°C, 5

^분

)

한후상층액을세포질 추출물로이용하였다

.

침전물은

hypotonic buffer

로한번세척 하고

, hypertonic buffer [20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piper- azineethanesulfonic acid, 25% glycerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

₂

, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.02%

NaN

₃

, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7.4]

^를^넣고

1

^시간^동안 얼음위에방치시킨다음원심분리

(13,000 g, 4°C, 10

^분

)

하여상 층액을회수하여핵단백질추출물로이용하였다

.

Western blot에 의한 단백질 분석

염증관련 단백질과신호전달 단백질의인산화정도는세포 를

EHF

^로^전처리^한^후

LPS

^로^처리하여^세포^단백질을^시료 로

, NF-κB

및

IκB

의활성화및인산화정도는상기의핵및 세포질추출물을 시료로이용하였고

,

단백질양은이전의보 고

(Joung et al., 2017)

와마찬가지로전기영동으로분리된단 백질을

nitrocellulose

막에이전시켜

Western blot

으로분석하 였다

.

^검출된

band

^의^정량^분석은

mRNA

^분석과^{마찬가지로}

cooled CCD camera system EZ-Capture II (ATTO and Rise Co., Seoul, Korea)

와

CS analyzer ver. 3.00 software (ATTO and Rise Co., Seoul, Korea)

를이용하여최소

3

번의반복실험 을통해얻었고

,

그결과를각

blot

의하단에수치로표기하였다

. 면역형광분석

RAW 264.7

세포를

glass coverslips (SPL Lifesciences Co., Pocheon, Korea)

위에

24

시간배양한뒤

, EHF

로

1

시간전처리 하고

, LPS (1 µg/mL)

로

30

분자극시켰다

.

세포를

4.0% para- formaldehyde

가 첨가된

PBS

로 실온에서

15

분 동안반응시 켜고정시키고

, 0.5% Triton X-100

^이^첨가된

PBS

^를^넣어

10

분동안반응시켰다

. PBS

로세척한뒤에

3% BSA/PBS

를넣 고

30

분 동안

blocking

시킨후

, anti-NF-κB polyclonal anti- body (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)

가희 석된

3% BSA/PBS

를넣어

2

시간동안반응시켰다

.

그다음

,

Table 1. Primer sequences for RT-PCR Primers Sequences

iNOS Forward 5'-TCTTTGACGCTCGGAACTGT-3‘

Reverse 5'-CCATGATGGTCACATTCTGC-3‘

COX-2 Forward 5'-TGGGCAAAGAATGCAAACAT-3‘

Reverse 5'-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3’

TNF-α Forward 5'-CAAGGGACAAGGCTGCCCCG-3'

Reverse 5'-GGTCAGAGTGGGGGCTGGGT-3‘

IL-1β Forward 5'-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3'

Reverse 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'

IL-6 Forward 5'-GTATGAACAACGATGATGCACTTCCAG-3'

Reverse 5'-GCATTGGAAATTGGGTAGGAAGG-3'

β-Actin Forward 5'-CCTCATGAAGATCCTGACCG-3'

Reverse 5'-TCCACATCTGCTGGAAGGTG-3’

GAPDH Forward 5'-TGGCACAGTCAAGGCTGAGA-3'

Reverse 5'-CTTCTGAGTGGCAGTGATGG-3’

RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; iNOS, inducible nitric oxide synthase; COX-2, cyclooxygenase-2; TNF-α, tumor necrosis factor- α; IL-1β, interleukin-1β; IL-6, interleukin-6; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

(4)

Alexa Fluor

^Ⓡ

488-conjugated secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

가희석된

3% BSA/PBS

를넣고

1

시간 동안반응시킨뒤

, 2 µg/mL

^의

4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

로핵을염색하 고

LSM700 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

로관찰하였다

.

NF-κB Promoter 활성

RAW 264.7

^세포

(2×10

⁵

cells/well)

^가 ^들어있는

24-well plate

의각

well

에

1 µg

의

pNF-κB firefly luciferase DNA

와

20 ng

의

pRL-TK renilla luciferase DNA

를

Lipofectamine/Plus reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

와함께처리하여

40

시간동안

transfection

시켰다

.

그다음

, EHF

를

1

시간전처리하 고

, LPS (1 µg/mL)

^로

6

^시간^{자극시켰다}

.

^이후

PBS

^로^세척하 고

100 µL

의

lysis buffer (0.5 mM HEPES, pH 7.8, 1% Triton N-101, 1 mM CaCl

₂

, and 1 mM MgCl

₂

)

로

lysate

를만들고

, luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA)

를사용하 여

luciferase

활성을측정하였다

.

귀 부종 억제 효과

동물시험방법과과정은부경대학교동물윤리위원회의승인

을받아수행하였다

. ICR

생쥐

(

수컷

, 25-30 g)

는샘타코바이오 코리아

(Osan, Korea)

에서구입하였다

.

구입된생쥐들은

1

주일 간동물사육실에적응시킨후그룹별로

6

^마리씩^{할당하였다}

.

귀 부종은

phorbol 12-myristate 13-actate (PMA) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)

를

0.2 μg/mL

농도로아세톤에 녹여사용하여유도하였다

.

대조군은생리식염수로처리하고

, PMA

처리군

, PMA+0.5 mg EHF

처리군

, PMA+1.0 mg EHF

처리군및

PMA+indomethacin (Indo)

^{처리군으로}^나누었다

.

왼쪽귀

(reference)

는

30 µL

의 아세톤으로 처리하였다

. EHF (0.5 mg, 1.0 mg)

와

Indo (1 mg)

는

30 µL

의아세톤에녹여오 른쪽귀안쪽에처리하고

, 1

시간후에동일부위에

PMA 6 µg

을

30 µL

의아세톤에녹여처리하였다

. PMA

처리

6

시간후에생

쥐를희생시켜

6 mm

^구경의^{금속펀쳐로}^{부종부위를}^절취하여

무게를재었다

.

귀부종무게는오른쪽귀의무게에서왼쪽귀무 게를뺀값으로하였다

.

저해퍼센트

(inhibition percentage, IP)

는

PMA

처리군에대한상대적인무게를나타낸값이다

. 통계 처리

본연구의모든실험은세번이상반복하였으며

,

^얻어진^결

과들을평균값과표준편차

(mean±SD)

를계산하여나타내었

다

.

실험군간의유의성검증은

Student’s t-test

로검증하였다

.

Fig. 1. Effect of EHF on cell viability, nitric oxide (NO) and prostaglandin E₂ (PGE₂) production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) Cell viabilities were measured with MTS assay. Cells pretreated with various concentrations of EHF for 1 h were stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. (B) The culture media of the treated cells were used to measure the amount of nitrite to evaluate NO level, or (C) the amount of PGE₂. All data are presented as mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.001 compared to non-treated group. *P<0.05 and **P<0.01 compared to LPS-only group.

(A) (B)

(C)

(A) (B)

(C) (D)

(5)

결 과

EHF에 의한 NO와 PGE

₂

생성 억제 효과

RAW 264.7

세포에대한

EHF

의세포독성을측정하기위하 여

0-50 µg/mL

^{농도범위로}

EHF

^를

24

^시간^처리한^다음^세포생 존율의변화를

MTS assay

로분석하였다

. Fig. 1A

에나타난바

와같이세포의생존율은

EHF

처리에의해뚜렷한변화가없었

다

.

따라서이후의실험은

EHF

를

50 µg/mL

이하의농도에서 행하였다

. LPS

로자극된세포에서생성되는

NO

에대한

EHF

의억제효과를확인하기위하여세포를

EHF (0-50 µg/mL)

^로

1

시간전처리한후

LPS

로

24

시간자극하여배지에방출된

ni- trite

생성량을측정하여

NO

생성량을분석하였다

. LPS

처리에 의해증가된

NO

는

EHF

의전처리에의해농도의존적으로현 저하게감소하는것으로나타났고

,

특히

25 µg/mL

이상의농 도처리군에서는

50%

^이상의^{감소효과가}^나타났다

(Fig. 1B).

EHF

에의한

PGE

₂생성억제효과또한

NO

생성억제효과와유 사한결과를나타내었다

(Fig.1C).

EHF에 의한 iNOS와 COX-2 발현 억제 효과

NO

는

iNOS

에의해그리고

PGE

₂는

COX-2

에의해생성되므 로

,

^{거식세포에}

EHF

^를^전처리한^다음

LPS

^로^처리^후에^세포^단 백질을분리하여

iNOS

와

COX-2

단백질발현수준을

Western blot

으로분석하였다

. LPS

처리에의해생성된

iNOS

단백질

은

EHF

처리에의해농도의존적으로감소하는경향을나타내

었다

(Fig. 2). COX-2

단백질역시

EHF

에의해감소하는경향 을보였다

(Fig. 2). iNOS

^와

COX-2

^단백질^발현이^{전사수준에} 서조절되는것을확인하기위하여

iNOS

와

COX-2 mRNA

발 현을

RT-PCR

로분석하였다

.

단백질과마찬가지로두유전자의

mRNA

발현양상이유사하게나타났고

, 25 µg/mL

이상의농 도처리군에서는감소경향이보다현저하였다

(Fig. 2).

따라서

EHF

^에^의한

iNOS

^와

COX-2

^단백질의^발현^감소는^전사수준 에서효과적으로조절되고있음을보여주었다

.

LPS로 유도되는 염증성 cytokines의 생성에 대한 EHF의 억제효과

LPS

로자극된

RAW 2645.7

세포에서생성되는염증촉진성

cytokines

^의^생성에^대한

EHF

^의^효과를

ELISA

^방법으로^분석 하였다

. LPS

자극에의해

TNF-α (Fig. 3A), IL-1β (Fig. 3B)

및

IL-6 (Fig. 3C)

와같은염증촉진성

cytokines

의생성량은크게 증가하는것으로나타났고

,

이러한증가는다소차이는있지만

EHF

처리에의해농도

-

의존적으로현저하게감소하는것으로 관찰되었다

(Fig. 3A, 3B, 3C).

^또한^처리된^{세포로부터}

mRNA

를분리하여

RT-PCR

로분석한결과

ELISA

결과와유사하게 나타났다

(Fig. 3D).

LPS로 유도되는 NF-κB의 활성화에 대한 EHF의 억 제 효과

염증촉진성

cytokines, iNOS

및

COX-2

의발현은전사인자 인

NF-κB

에의해조절된다

. LPS

로자극된

RAW 264.7

세포를 이용하여

NF-κB

의활성화에대한

EHF

의효과를분석하였다

.

먼저면역형광법으로염색을하고

confocal microscopy

로분 석한결과를

Fig. 4A

^에^{나타내었다}

.

^자극이^가해지지^않은^상태 에서

NF-κB/p65 subunit (

녹색

)

는주로세포질에분포하는것 이관찰되었다

. LPS

로처리된세포의경우녹색인

NF-κB p65

의대부분은핵에분포하는것으로나타났고

,

이는

NF-κB

가 활성화되어핵으로이동했음을보여주는결과이다

.

그러나세 포에

EHF (50 µg/mL)

^를^전처리한^경우

NF-κB/p65

^는^핵^주변 의세포질에대부분분포하는것으로관찰되었다

.

이러한결과 는

EHF

에의해

NF-κB

의활성화가현저하게억제되고있음을 보여주고있다

(Fig. 4A). NF-κB

의활성화에영향을미치는단 백질을

Western blot

으로분석한결과를

Fig. 4B

에나타내었다

. LPS

^에^의해^과도하게^인산화된

IKK-β

^와

IκBα

^는

EHF

^처리에 의해인산화정도

(p-IKK-β

및

p-IκBα)

가농도의존적으로감 소함을보여주었다

. LPS

에의해핵으로이동된

NF-κB p65

또 한

EHF

처리에의해감소됨을보여주고있다

.

다음은

LPS

로 자극된대식세포주에있어

NF-κB

의

promoter activity

에대한

EHF

^의^효과를^{분석하였다}

(Fig. 4C).

^이를^위해

RAW 264.7

^세 포에

NF-B promoter

를가진

luciferase construct

를일시적으 Fig. 2. Effect of EHF on LPS-stimulated inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) protein and mRNA expressions in RAW 264.7 cells. Cells pretreated with various concentrations of EHF for 1 h were stimulated with or without LPS (1 μg/mL) for 16 h. Whole proteins were separated with SDS-PAGE.

The expression of iNOS, COX-2, and β-actin was analyzed by Western blot using corresponding antibodies. Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 6 h. Total RNA was prepared for RT-PCR.

The results presented are representatives of three independent experiments.

(A)

(B)

(C)

(6)

대황 헥산 분획물의 항염증 효과

157

로

transfection

^하고

,

^이^세포를^다양한^농도의

EHF

^로

2

^시간^전 처리하고이어서

LPS

로

6

시간동안자극하였다

. Fig. 4C

에나 타내었듯이

luciferase

활성은

LPS

자극에의해현저하게증가 하였으며

,

이는

LPS

자극에의해활성화된

NF-κB

가

NF-κB

의

promoter

를가진

luciferase

의발현을크게증가시켰음을의 미한다

.

^이에^대한

EHF

^의^{억제효과는}

10 µg/mL

^의^낮은^농도

뿐만아니라

50 µg/mL

농도에이르기까지유의적으로감소하

는것으로나타났다

.

이들결과는대식세포에서

LPS

자극에의 해유도되는

NF-κB

의활성화가

EHF

에의해효과적으로억제 되고있음을보여주고있고

,

이는

EHF

에의한상기의염증성

cytokines

^및

iNOS

^의^발현^억제는^{부분적으로}

NF-κB

^활성화 경로에의해조절되고있음을의미하고있다

.

LPS로 유도되는 MAPKs의 인산화에 대한 EHF의 억 제 효과

EHF

에의한

NF-κB

신호경로에어떠한신호단백질들이관여

하는지를확인하기위하여

MAPKs (ERK, JNK, p38 MAPK)

와

Akt

의인산화를

Western blot

으로분석하였다

. Fig. 5

에나타 내었듯이

, LPS

로유도된세포에서

EHF

처리에의하여

ERK, JNK, p38 MAPK

및

Akt

의인산화가농도의존적으로감소하

였다

.

^이러한^결과는

EHF

^가

IKK-β

^의^인산화는^물론

NF-κB

^의 상위단백질의인산화를조절함으로써염증억제효과를나타낸 다는것을의미한다

.

부종에 대한 EHF 효과

생쥐의귀에

PMA

를처리하여귀부종을유도한결과

6

시간 후

PMA

^에^의해^귀^부종의^무게가^현저히^{증가하였다}

(Fig. 6).

Indo

는비스테로이드성항염증제

(nonsteroidal anti-inflamma- tory drug, NSAID)

로써부종의치료효능을평가하기위하여 양성대조약물로사용하였다

. Fig. 6

에나타난바와같이부종 은

EHF

처리에의해감소하는경향이나타났고

,

특히

1 mg

의

EHF

^처리에^의해^유의적인^차이가^{확인되었다}

(P<0.05).

^이러 한결과에서

EHF

의부종억제효과를확인할수있었다

.

고 찰

NO

는

NOS

에 의해

L-arginine

으로부터 생성되며

,

세균의

endotoxin

또는염증성

cytokines

에

iNOS

가급격하게유도되 어

NO

생성량이급증한다

(Guha and Mackman, 2001).

병리적 인조건하에서

iNOS

에의한

NO

의현저한증가는다른염증성 Fig. 3. Effect of EHF on the production of pro-inflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells pretreated with various concentrations of EHF were stimulated with or without LPS (1 μg/mL) for 24 h. TNF-α (A), IL-1β (B), and IL-6 (C) in the culture media were measured by ELISA. (D) Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 6 h. Total RNA was prepared for RT-PCR. The results presented are representatives of three independent experiments. Data represent mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.01 compared to LPS-only group.

(C)

(A) (B)

(C) (D)

(7)

김보운

ㆍ

최창근

ㆍ

김재일

ㆍ

김형락

158

매개체들과함께과도한염증을유발하게되고조직의손상을 유발하는것으로알려져있어염증성손상의주요매개체이다

(Pan et al., 2011). PGE

₂는

COX-2

의작용에의해

arachidonic acid

로부터생성된다

(Sil and Ghosh, 2016).

체내의염증작용 이 증가함으로써생성되는

PGE

₂^는^통증

,

^염증

,

^체온상승

,

^혈 소판응집등의작용을한다

(Park et al., 2006).

따라서

iNOS

와

COX-2

의발현을억제하거나활성을억제함으로써

NO

와

PGE

₂의생성을억제할수있는화합물은항염증물질로이용

Fig. 4. Inhibitory effect of EHF on the activation of NF-κB in LPS- stimulated RAW 264.7 cells. A, celluar distribution of p65 subunit of NF-κB (green) protein was analyzed by immunofluorescence staining with confocal microscopy. Cells were pretreated with EHF (50 μg/mL) for 1 h, followed by LPS stimulation for 30 min. DAPI (blue) was used for nuclear staining; B, nuclear localization of NF- κB and the regulation of IκB-α phosphorylation was analyzed by Western blot. Cells pretreated with EHF for 1 h were stimulated with LPS for 30 min; C, effect of EHF on NF-κB promoter activity.

Cells were transfected with 1 μg of NF-κB promoter-containing luciferase DNA for 40 h. Transfected cells pretreated with EHF for 1 h were stimulated with LPS for additional 6 h. The results presented are representatives of three independent experiments; AU, arbitrary unit. ^#P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.01 compared to LPS-only group.

(A)

(B)

(C)

(A)

(B)

(C)

Fig. 6. Effect of EHF on ear edema induced by phorbol 12-myristate 13-actate (PMA) in mice. EHF or indomethacin (Indo) were topically administered on inner surface of the right ears of mice 1 h before application of PMA. 6 h after application of PMA, ear edema and the inhibition percentage (IP) of the ear edema by the treatment were calculated. ^#P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.05 compared to PMA-only treated group.

Fig. 5. Effect of EHF on the phosphorylations of MAPKs and Akt in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 30 min. Whole cell lysates were prepared and analyzed by Western blot for phosphorylated proteins of Akt, JNK, p38 MAPK or β-actin using corresponding antibodies. The results presented are representatives of three independent experiments.

(B)

(C)

(8)

될수있다

.

염증촉진성

cytokines

들은체내에서다양한면역및염증반 응을조절하는역할을한다

.

세균의

LPS

에의해자극된대식 세포는

TNF-α

를생성하고분비된

TNF-α

는

IL-1

와

IL-6

의생 성을유도함으로써염증반응을증폭시키게된다

(Minnich and Moldawer, 2004). LPS

^에^의해^유도된

TNF-α

^는^{염증반응의}^개 시를촉진하며지속적인생성은만성염증을유발하며결국에 는패혈성쇼크

,

염증등의다양한생리적과정에관여하고있다

(Scheller et al., 2011). IL-1β

는대식세포에서생성되는주요염 증촉진성

cytokine

으로

,

세균감염에대한염증응답의개시및 강화에중요한

cytokine

^이다

(Li and Verma, 2002). IL-6

^도^대식 세포에서생성되는중요한염증성

cytokine

으로서급성면역반 응에작용한다

(Bonizzi and Karin, 2004).

본연구에서관찰된 결과는

EHF

가

LPS-

자극에의해유도되는

IL-1β, IL-6, TNF-

의생성을억제시키는것으로나타났고

,

이는

EHF

가

LPS-

자극 에의한염증성응답의초기단계를억제하고있음을의미한다

.

NF-κB

의활성화를억제하는단백질인

IκBα

는

IKKβ

의인산

화에의하여

IκBα

가인산화됨으로써유비퀴틴화되어프로테

아좀에의해분해된다

(Nguyen et al., 2003).

따라서

IκB-α

로

부터유리된

NF-κB

는핵으로이동하여염증성유전자들의발

현에기여하게된다

.

^또한

NF-κB

^활성화^경로는^세포내^다양 한신호전달에관여하는

MAPKs

나

Akt

와같은

protein kinase

들에의해조절된다

(Liu et al., 2017; Tian et al., 2017).

많은연 구들에서

p38, JNK, ERK

와같은

MAPKs

가설치류의대식세 포에서

LPS

에인한

NF-κB

의활성화에중요한역할을한다고 밝히고있다

(Guha and Mackman, 2001; Joung et al., 2017).

그리고

Akt

또한

NF-κB

의활성화를조절함으로써여러염증 성유전자의발현을조절하는것으로알려져있다

(Joung et al., 2015).

본연구에서

LPS

자극에의해유도되는

NF-κB

의활성 화에대한

EHF

의억제효과는

MAPKs

및

Akt

와같은

kinase

의 인산화과정과관련되어있음을나타낸다

.

앞서설명한것처럼모자반류에서분리된

sargaquinoic acid (Gwon et al., 2015; Joung et al., 2015), fucosterol (Jung et al., 2013; Gwon et al., 2017), sargachromenol (Gwon et al., 2017)

과같은화합물들의항염증활성에대해활발한연구가진행되 었다

.

^본^실험에^사용된

EHF

^를

HPLC

^로^분석한^결과

sargahy- droquinoic acid, sargaquinoic acid

및

sargachromenol

은발견 되지않았다

.

따라서이들항염증활성을나타내는유효성분을 분리동정하기위한후속적인연구가필요하다

.

이상의결과에서

, LPS

로자극한

RAW 264.7

세포에있어

NO

와같은염증성매개체뿐만아니라염증촉진성

cytokines

^의^생 성및발현이

EHF

에의해억제된다는것을증명하였다

.

이러 한

EHF

의억제효과는

IκB

의분해를저해함으로써

NF-κB

활 성화경로를억제시키는것으로나타났다

.

또한

EHF

는

NF-κB

활성화의상위신호전달경로인

MAPKs

및

Akt

에도영향을미 치는것으로확인되었다

.

^여러^{만성염증성}^질환에^과도한^염증

성매개체들의발현및생성이중요한병인적역할을하고있 음을고려했을때

,

본연구결과는

EHF

가항염증효능을가진 기능성식품의소재로이용될수있다는가능성을제시하고있 다

.

향후

EHF

의항염증효과를나타내는유효화합물의분리^.동 정및활성분석에대한연구가진행되어야할것으로판단된다

.

사 사

이논문은부경대학교자율창의학술연구비

(2019

년

)

에의하 여연구되었음

.

References

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