대한소화기학회지 2002;40:186-190
서 론
11)뮤신 단백항원은 아포뮤신 단백골격(apomucin protein
접수: 2002년 3월 23일, 승인: 2002년 7월 6일 연락처: 이수택, 561-712, 전북 전주시 덕진구 금암2동
전북대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (063) 250-1660, Fax: (063) 254-1609 E-mail: [email protected]
backbone)의 세린(serine), 트레오닌(threonine) 등의 아미노 산에12)당질이 결합한 고분자량의 당단백 물질이다.1 단백질 의 당화(glycosylation)는 단백질이 전사 후 변형되는 흔한
Correspondence to: Soo Teik Lee, M.D.
Department of Internal Medicine, Chonbuk National University Hospital
634-18, Keumam-dong, Jeonju-si, Jeonbuk 561-712, Korea Tel: +82-63-250-1660, Fax: +82-63-254-1609
E-mail: [email protected]
사람 췌장종양에서 점액 단백항원 발현에 관한 면역조직학적 연구
전북대학교 의과대학 내과학교실, 병리학교실*
김승수·김용성·이승옥·이수택·강명재*
An Immunohistochemical Study of Mucin Protein Antigens in Human Pancreatic Tumor
Seung Soo Kim, M.D., Yong Song Kim, M.D., Seung Ok Lee, M.D., Soo Teik Lee, M.D., and Myung Jae Kang, M.D.*
Departments of Internal Medicine and Pathology*, Chonbuk National University College of Medicine, Jeonju, Korea
Background/Aims: Mucins are high-molecular-weight glycoproteins. Aberrant and incomplete glycosylations of mucins have been associated with various human diseases. This study was performed to find the association between mucin protein expression and pancreatic tumors. Methods: Surgically resected, or radiologically obtained 20 specimens were stained using avidin-biotin-peroxidase methods. The patterns of mucin protein expression were compared between benign and malignant pancreatic tumors. Results: In the neoplastic cells from adenocarcinoma, high levels of MUC1 expression were observed mainly in the cytoplasm, but the expression of MUC2 protein antigens was low compared to MUC1 expression. In benign tumors, there were no differences in terms of staining site and intensity between two mucin protein antigens. The survival rate of the weakly staining group by anti-MUC1 Ab was higher than that of the strongly staining group. The expression of MUC1 protein antigens showed a striking contrast between benign and malignant pancreatic tumors. Conclusions: Antigens of MUC1 and MUC2 protein seem to be expressed differentially in benign and malignant pancreatic tumors, which may be useful in the diagnosis of malignant pancreatic tumors, especially in ambiguous states. (Korean J Gastroenterol 2002;40:186-190)
Key Words: Mucins; Pancreatic neoplasms
김승수 외 4인. 사람 췌장종양에서 점액 단백항원 발현에 관한 면역조직학적 연구
과정으로 단백질의 물리적 성질을 변형시키는 중요한 요인 이다.1,2 당단백은 O-linked 당단백, N-linked 당단백의 2가 지 유형으로 분류되며, O-linked 당단백은 세포 표면과 분 비물에서 주로 발견되고 아미노산 중 세린과 트레오닌 및 탄수화물이 많이 포함된다.3 O-linked 당단백 중 대표적인 것이 점액인데, 분비된 점액이 이황화(disulfide) 결합으로 중합체(polymer)를 이루게 되면 점도가 높아져서 상피세포 가 마찰이나 소화효소, pH 등에 저항하는 데 기여를 하게 된다.3 조직의 성상이 염증, 종양 등에 의하여 병적인 상태 로 바뀌게 되면 점액 단백항원의 변화가 일어나게 되어서 각각의 질병에 적합한 특이 항원이 발생하게 된다.4-6 현재 까지 뮤신 단백항원을 생산하는 유전자는 모두 9종류가 알 려져 있는데,7 뮤신 단백항원1 (이하 MUC1)은 주로 유방조 직 및 췌장조직에서, 뮤신 단백항원2 (이하 MUC2)는 대장, 소장, 기관지 내에서, 뮤신 단백항원4는 기관지 및 대장에 서, 뮤신 단백항원5 및 뮤신 단백항원6는 기관지 및 위에 서, 뮤신 단백항원7은 이하선에서 주로 발현한다. 본 연구 에서 연구된 두 종류의 항원, 즉 MUC1은 주로 침윤성 종 양에서 발현되는 항원으로 비정상적으로 고농도로 발현될 때 좋지 않은 예후를 갖지만, MUC2는 비침윤성 종양에서 주로 발현되는 분비성 항원으로 비교적 좋은 예후와 관련 되어 있다고 알려져 왔다.3
본 연구는 위의 사실에 착안하여 사람 췌장종양에서 뮤 신 단백항원의 발현 정도 및 그에 대한 이해가 환자 진단 및 예후와의 관련성을 규명하는 데 도움을 주는가에 대해 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대상
1995년 1월부터 2001년 5월까지 파라핀 포매 조직의 보관 상태가 양호한 20예를 추출하였는데 이들은 각각 초음파 또는 컴퓨터단층 촬영 유도하에 침생검으로 얻은 조직 6예 와 수술을 통해 얻은 조직 14예였다. 이들을 각각 분류하면 췌장선암 11예와 유두상 고형 상피종양 2예, 장액성 희발 낭성 선종 2예, 관내 유두상 점액종양 5예로 남자 10명, 여자 10명이었고 평균 나이는 55.3세(13-67)였다(Table 1).
본 연구에 포함된 관내 유두상 점액종양은 침윤성 부분이 전혀 없는 증식증 혹은 선종만을 포함한 조직으로 한정하 였다.
2. 방법
면역염색은 전체 20예의 파라핀 포매 조직으로부터 4 μm 두께의 조직절편을 얻어 MUC1 단백항원(DAKO, Glostrup,
Table 1. Demographic and Baseline Characteristics Case
No. Sex Age Diagnosis Methods of diagnosis 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
M F F M M F F M M M M F F F F F F M M M
56 67 61 60 59 54 63 50 64 62 59 13 46 45 59 57 53 60 61 57
Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Adenocarcinoma Serous oligocystic adenoma Serous oligocystic adenoma Solid papillary epithelial tumor Solid papillary epithelial tumor
IPMT*
IPMT IPMT IPMT IPMT
Operation Operation Operation Needle biopsy Needle biopsy Needle biopsy Needle biopsy Needle biopsy Operation Operation Needle biopsy
Operation Operation Operation Operation Operation Operation Operation Operation Operation
* IPMT, Intraductal papillary mucinous tumor.
Denmark) 및 MUC2 단백항원(PharMingen, San Diego, CA, USA)에 대한 단클론항체를 면역염색용 1차 항체로 사용하 였으며, microbe detection system을 이용하여 avidin-biotin- peroxidase complex법으로 다음과 같이 시행하였다. 전과정 을 간단히 기술하면 다음과 같다. 먼저 슬라이드에 부착시 킨 4 μm두께의 조직절편을 xylene과 Histoclear (National diagnostics, Manvill, NJ, USA)를 1:3의 비율로 혼합한 용액 을 이용하여 1분씩 4번 반복하여 탈파라핀하였으며, 3번 째까지는 60℃에 두고 마지막 한 번은 실온에서 두었다.
실온에서 무수알콜을 이용하여 탈수시킨 후 automation buffer (Biomeda, Foster, CA, USA)로 수세하고, 10 mM citrate 완충액(pH 6.0)에 담근 후 항원 복원성을 높이기 위해 microwave oven에서 MUC1 항원만 15분간 처리하 였다. 조직내 내인성 과산화효소의 작용을 억제하기 위 하여 Endo/Blocker (Biomeda)에 40℃에서 2분간 둔 후 automation buffer로 수세하였다. 조직항원과 항체의 비특 이적인 결합을 억제하기 위하여 tissue conditioner (Dako, Carpinteria, CA, USA)에 40℃에서 2분간 두었다. 이후 187
The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 40, No. 3, 2002
1:50으로 희석한 1차 항체를 실온에서 25분간 반응시킨 후 automation buffer로 수세하였다. Biotin이 부착된 2차 항체(Dako)를 실온에서 4분간 반응시킨 후 automation buffer로 수세하고 과산화효소의 역가를 증대시키기 위하여 peroxidase enhancer (Biomeda)를 적용하였다. Chromogen (concentrated 3-amino-9-ethycarbazole) 한 방울, 2% hydrogen peroxide 한 방울, chromogen buffer 두 방울과 증류수 5 mL 혼합용액으로 40℃에서 두 번 반복하여 발색시킨 후 증류수로 수세하였다. 헤마톡실린으로 대조염색하여 crystal mount로 봉입한 후 검경하였다. 환자의 생존에 대 해서는 직접 저자가 전화연락을 통해 생존 여부 및 사망 시점 등을 기록하였고 SPSS프로그램을 사용하여 통계 처리하였다.
3. 면역염색의 판정 및 평가
판정 오차를 줄이기 위해 1인의 병리학자가 결과를 해석 하였는데, 광학현미경 100배 및 200배에서 염색 강도가 선 명한 염색상을 보이면 강으로, 약하게 염색되면 약으로 판 정하였고, 이외에 염색 부위 및 염색 범위(퍼센트화) 등도 기술하였다.
결 과
1. 악성 췌장종양에서의 뮤신 항원의 발현
췌장선암에서는 82% 환자에서 MUC1이 강양성으로, 91%
환자에서 MUC2는 약양성으로 염색되었고 종양세포의 세 포질 전체에 균등하게 염색되었다(Table 2, Fig. 1)
Table 2. Expression of Mucin Protein Antigens in Malignant Pancreatic Tumors
Case No. MUC1 (%) MUC2 (%) 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
S (100) S (100) S (100) S (100) W (100) S (100) S (100) S (100) W ( 60) S (100) S ( 70)
W (80) W (50) W (50) W (40) W (40) S (100) W (80) W (60) W (30) W (50) W (20) W, weak stain; S, strong stain.
Fig. 1. The expression of mucin-protein antigens in malignant pancreatic tumors. (A) It shows strong expression of MUC1 protein antigens in malignant pancreatic tumors when the anti-MUC1 antibody was used for staining (immunohistochemical stain, ×400). (B) It shows weak expression of MUC2 protein antigens when the anti-MUC2 antibody was used for staining.
Their staining sites were mainly in the cytoplasms (immuno- histochemical stain, ×400).
2. 양성 췌장종양에서의 뮤신 단백항원의 발현
유두상 고형 상피종양, 장액성 희발 낭성 선종, 관내 유두상 점액종양과 같은 양성 췌장종양에서는 MUC1과 MUC2의 염색 강도는 모든 환자에서 약양성 반응을 보 여 두 단백의 염색성에 차이가 없었고 종양세포 핵 주위 또는 세포질의 첨단부에서 양성 반응을 보였다(Table 3, Fig. 2)
3. 뮤신 항원의 발현과 생존율
악성 종양에서 MUC1에 약양성을 보인 환자들은 평균 52주, 강양성을 보인 환자들은 평균 18주로 생존기간의 차 이를 보였다(Fig. 3). 그러나 양성 종양군은 모두 생존하여 특별한 차이를 볼 수 없었다.
188
A
B
Kim, et al. An Immunohistochemical Study of Mucin Protein Antigens in Human Pancreatic Tumor
Table 3. Expression of Mucin Protein Antigens in Benign Pancreatic Tumors
Case No. MUC1 (%) MUC2 (%) 12
13 14 15 16 17 18 19 20
W (20) W (40) W (60) W (20) W (70) W (100) W (60) W (20) W (80)
W (<5) W (10) W (10) W (30) W (60) W (100) W (70) W (10) W (70) W, weak stain.
Fig. 2. The expression of mucin-protein antigens in benign pancreatic tumors. (A) It shows weak expression of MUC1 protein antigens in benign pancreatic tumors when the anti-MUC1 antibody was used for staining (immunohisto- chemical stain, ×400). (B) It shows weak expression of MUC2 protein antigens in using anti-MUC2 antibody. Their staining sites were mainly in the apical membranes (immuno- histochemical stain, ×400).
Fig. 3. Survival curves of patients with pancreatic malignancy.
Patients with tumors showing strong expression for MUC1 demonstrate significantly worse survival than those with tumors showing weak expression for MUC1. Data were analyzed by the Kaplan-Meier method.
고 찰
MUC1 단백항원은 막성 관련 당단백으로 그 유전자는 1q21-24에 존재하며 3개의 독특한 영역으로 이루어져 있 다. 즉, 69개의 아미노산으로 이루어진 세포질내 영역 (cytoplamsic tail) 및 아미노산 20개의 반복적인 서열로 이 루어진 세포외 영역(extracellular domain), 세포막에 걸친 영역(transmembrane domain) 등이 있다. 주로 정상 췌장조 직에서 발현되나 췌장암, 유방암, 위암 등에서도 비정상적 으로 높게 발현될 때 좋지 않은 예후를 갖게 된다고 알려져 있다.8,9 MUC1 단백항원의 과도한 발현은 악성 세포와 세 포독성 림프구 사이의 상호작용을 방해할 뿐 아니라, 세포 외 기질과 인테그린(integrin) 사이의 상호작용을 감소시켜 악성 세포의 전이가 많이 일어나게 되어 나쁜 예후와 관련 되어 있다고 알려져 왔다.10 한편, MUC2 단백항원의 유전 자는 11p15에 존재하며, 주로 정상 대장, 소장, 기관지 및 비침윤성 종양에서 발현되는 분비성 항원으로 이황화 결합 에 중합체로 구성된다. 분비성 MUC2 항원은 췌장조직에서 높게 발현될 때 비교적 좋은 예후를 갖게 된다고 알려져 있 다.3 MUC2 항원은 수용성 용액에서 높은 점도를 갖는데, 이는 전이 및 주변 조직으로의 침윤을 적게 일어나게 하고, 특히 시스테인(cysteine)성분이 풍부한 영역이 낮은 정도의 전이 및 침윤에 관여한다고 알려져 있다.4,11-13
지금까지 MUC1 및 MUC2 단백항원에 대한 항체를 사 용하여 다양한 형태의 면역염색에 대한 연구가 있었다. 그 중 한 연구2에서는 췌장선암 46예 중 45예(98%)에서 MUC1 189
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대한소화기학회지: 제40권 제3호, 2002
양성 반응을 보인 반면 MUC2는 전원 음성 반응을 보였고, 16예의 관내 유두상 점액종양 중 4예(25%)에서 MUC1 양 성 반응을 보인 반면 MUC2 항원은 13예(81%)에서 양성 반응을 보였다고 하였다. 그러나 본 연구는 상기 연구와 다 소 차이가 나는 결과를 얻었다. 즉, 유두상 고형 상피종양, 장액성 희발 낭성 선종, 관내 유두상 점액종양과 같은 양성 췌장종양에서는 MUC1과 MUC2의 염색 강도는 대부분 약 양성 반응을 보여 두 단백의 염색성에 있어 큰 차이가 없었 고, 종양세포 핵 주위 또는 세포질의 첨단부에서 양성 반응 을 보였다. 반면, 췌장선암에서는 MUC1이 강양성, MUC2 는 약양성으로 대부분 염색되었고 종양세포의 세포질 전체 에 균등하게 분포하였다. 뮤신 단백항원 발현과 생존율과 의 관계를 비교하면 양성 종양군은 모두 생존하였으며, 악 성 종양군에 있어서는 비교적 적은 수이기는 하나 MUC1 항원에 약양성을 나타낸 사람들이 강양성을 보인 사람들보 다 생존기간이 길었다.
결론적으로 MUC 항원은 양성 및 악성 췌장종양에서 유 의한 발현 차이를 보였으며, 특히 MUC1 항원 염색상은 악 성 췌장종양에서 예후와 관련이 있었다. 이러한 뮤신 단백 항원의 발현차이를 이해하는 것은 앞으로 환자의 진단 및 예후 추정, 분자생물학적 면역요법과 같은 치료에 많은 도 움을 줄 수 있을 것이다. 하지만 본 연구는 제한된 수를 대 상으로 실시되었으므로 보다 많은 수를 대상으로 하는 전 향적인 연구가 필요할 것으로 생각한다.
요 약
목적: MUC1 및 MUC2 단백항원에 대한 항체를 사용한 면역조직화학염색법을 이용하여 사람의 췌장종양에서 뮤 신 단백항원의 발현 양상을 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 1995년 1월부터 2001년 5월까지 파라핀 포매 조직의 보관 상태가 양호한 조직 20예를 추출하였는데 이들은 각 각 침생검으로 얻은 조직 6예와 수술을 통해 얻은 조직 14 예였다. 이들 조직을 MUC1 단백항원및 MUC2 단백항원에 대한 단클론항체를 사용하여 염색 부위 및 범위를 기술하 였고, 또한 염색 정도와 생존율과의 상관관계를 알아보았 다. 결과: 췌장선암에서는 MUC1이 강양성, MUC2는 약양 성으로 주로 염색되었고 종양세포의 세포질 전체에 균등하 게 분포하였다. 양성 췌장종양에서는 MUC1과 MUC2의 염 색강도는 대부분 약양성 반응을 보여 두 단백의 염색성에 큰 차이가 없었고 종양세포 핵 주위 또는 세포질의 첨단부 에서 양성 반응을 보였다. 또한 악성 종양에서 MUC1에 약 양성을 보인 환자들에서 강양성을 보인 환자들보다 생존기 간이 길었다(p<0.05). 결론: MUC 항원은 양성 및 악성 췌 장 종양에서 유의한 발현 차이를 보였으며, 특히 MUC1 항
원 염색상은 악성 췌장종양에서 예후와 관련이 있는 것으 로 생각한다.
색인단어: 뮤신 단백항원1, 뮤직 단백항원2, 췌장종양
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