의
의
의학
학
학 석
석
석사
사
사학
학
학위
위
위 논
논
논문
문
문
정
정
정상
상
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및
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종
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양
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세
세포
포
포에
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서
서 녹
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녹차
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물
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방
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학
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양
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녹
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차 추
추
추출
출
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물
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방
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한
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살
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향
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지
지도
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교
교수
수
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학
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년
년 2
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월
월
아
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학
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교
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의 의
의
의
의학
학
학 석
석
석사
사
사학
학
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논
논문
문
문을
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인준
준
준함
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함.
.
.
심
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심사
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원장
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미
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선
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심
심 사
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오
오 영
영
영 택
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심
심
심 사
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사 위
위
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강
강
강 승
승
승 희
희
희
인
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국문요약
-정
정
정상
상
상 및
및
및 종
종
종양
양세
양
세
세포
포
포에
에
에서
서
서 녹
녹차
녹
차
차 추
추
추출
출
출물
물
물이
이
이 방
방
방사
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선
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의
의
의한
한
한 살
살
살상
상
상에
에
에 미
미
미치
치
치는
는
는 영
영
영향
향
향
녹차추출물의 항산화 및 항암 효과는 여러 논문에서 보고되고 있으며 또한 감마선에 의해 유도된 E-ColiDNA 절단에 대한 보호효과가 있음이 보고되었다. 일본에서 보고된 암 예방 및 암 재발 감소효과와 앞서 실행된 상당수의 실험연 구를 근거로 녹차추출물의 암 예방 물질로서의 가능성을 알아보기 위한 임상연 구가 진행중이다.본 연구에서는 방사선을 조사한 정상세포와 종양세포에서 녹차 추출물의 효과를 알아보고자 하였다. 본 실험에서는 마우스의 정상 소장 상피세포주인 IEC-6과 인간 대장암세포 주인 HCT-116을 사용하였다.방사선조사는 6MV 선형가속기를 이용하였고 실 온에서 0,2,4,6Gy의 선량으로 조사하였다.다양한 농도의 녹차추출물을 단독 으로 처리하거나 녹차추출물 처리 후 방사선을 조사하고 MTT assay,clonogenicassay,ROS assay를 시행하였다.
방사선과 함께 0.025및 0.05mM의 녹차추출물을 사용하였을 때 방사선만 을 조사받은 경우에 비해 정상 세포주인 IEC-6에서 방사선조사 후 세포생존율이 증가하였으며 방사선조사를 받지 않은 경우에도 같은 비율로 세포생존율의 증가 가 있었다.대장암 세포주인 HCT-116에서는 0.025및 0.05mM 녹차추출물 처 리로 방사선에 의한 세포살상이 증가하였다.0.05mM보다 높은 농도의 녹차추 출물은 정상세포와 종양세포 모두에서 방사선조사와 상관없이 세포살상을 증가 시켰다.0.05mM의 녹차추출물을 사용한 경우 방사선조사 단독군에 비해 IEC-6 세포주에서는 ROS 수치가 감소하였고 HCT-116 세포주에서는 수치의 차이가 없었다. 0.05mM 이하의 녹차추출물을 사용하였을 때 0,2,4Gy의 방사선조사 후에
정상세포주의 세포증식 및 ROS 감소효과가 있었으나 종양세포주에서는 같은 효 과가 없었다.즉,적절한 농도의 녹차추출물은 방사선에 의한 손상을 감소시키면 서 동시에 항암 효과도 나타낼 수 있는 양면성이 있음을 확인하였다.이는 종양 세포에 대한 보호효과 없이 방사선으로 인한 정상세포를 손상으로부터 보호할 수 있음을 보여 주는 결과이며 더 나아가 환자의 방사선치료 시에 응용할 경우 치료효과를 증강시킬 가능성을 시사하고 있다.
핵심되는 말 : 녹차,Green Tea Extract,IEC-6,HCT-116, MTT assay,
차
차
차 례
례
례
국문 요약 ……… ⅰ 차 례 ……… ⅲ 그림 차례 ……… ⅳ I.서론 ……… 1 II.재료 및 방법 ……… 3 A.시료 ……… 3 B.세포배양 ……… 3 C.약물처리 및 방사선 조사 ……… 3 D.MTT assay ……… 3 E.Clonogenicassay ……… 4 F.ROS assay……… 4 III.결과 ……… 5 A.MTT assay 결과……… 5 B.Clonogenicassay 결과 ……… 9 C.ROS assay 결과 ……… 12 IV.고찰 ……… 15 V.결론 ……… 18 참고 문헌 ……… 20 영문 초록 ……… 31그
그
그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig.1-1.MTT assay.Therelationship between radiation doseand cell
survivalinIEC-6andHCT-116celllines.……… 6
Fig.1-2.MTT assay.Theeffectofradiation and Green TeaExtracton
IEC-6cellline.……… 7
Fig.1-3.MTT assay.Theeffectofradiation and Green TeaExtracton
HCT-116cellline.……… 8
Fig.2-1.Clonogenicassay.TheEffectofradiationandGreenTeaExtracton
IEC-6cellline.……… 10
Fig.2-2.Clonogenicassay.TheEffectofradiationandGreenTeaExtracton
HCT-116cellline.……… 11
Fig.3-1.ROS assay.FACS analysisofIEC-6stainedwithDCF/DA.… 13
I
I
I.
.
.서
서
서 론
론
론
최근 암 치료는 치료결과의 향상을 위하여 방사선 조사를 비롯한 수술 및 항암화학요법들을 동시에 혹은 순차적으로 병용하는 방법들이 보편화되었다.또 한 방사선량의 증가 및 여러 항암제의 복합사용 및 용량의 증가 등으로 보다 집 중적인 치료법들이 개발되고 있어 이전에 비해 부작용의 정도 및 빈도를 증가시 킬 것으로 예상된다.그러나 아직까지 치료성적을 향상시키기 위한 노력에 비해 부작용으로 인한 환자의 불편이나 문제들을 해결하기 위한 연구는 매우 미약하 다. 방사선치료는 암이 발생한 원발부위 및 인접 림프절을 포함하는 부위에 방 사선을 조사하게 되는데 이 과정에서 암세포뿐 아니라 정상조직도 방사선을 조 사받게 된다.삼차원입체조형치료,강도조절방사선치료 및 정위적 방사선수술 등 과 같은 최신 치료법의 도입으로 정상조직에 대한 방사선량을 최소화할 수 있게 되었지만 일정부분의 정상조직 손상은 피할 수 없다.따라서 이러한 방사선치료 기술의 획기적인 진보와 함께 생물학적으로 방사선 부작용을 감소시키거나 예방 할 수 있는 방법을 찾을 수 있다면 보다 효과적인 방사선치료가 가능할 것이다. 그러나 이에 대한 연구는 매우 제한적이며 임상적으로 이용할 수 있는 약제로까지 개발된 것은 Amifostine밖에 없다.따라서 대개의 경우 발생한 부작용의 증
상을 감소시키기 위한 대증적인 치료에 머물고 있다. 많은 암 환자들이 암의 치료를 위하여 개인적인 차원에서 민간요법을 사용 하고 있는데,이러한 물질들 중에 암 치료효과를 증진시키거나 부작용을 경감시 킬 수 있는 가능성을 갖고 있는 물질들이 있을 것으로 예상된다.특히 흔히 사용 하고 있는 천연자원물질들의 효능을 과학적으로 규명하고 이를 통해 방사선에 의한 손상을 감소 혹은 억제시킬 수 있는 물질을 발굴할 수 있다면 저비용으로 환자들의 치료에 대한 순응도를 증가시킬 수 있다고 판단된다.즉,플라보노이드 계 물질에 의한 항산화 및 항염증 작용이 방사선조사로 생기는 산소 라디칼의 감소 및 그에 의한 손상을 감소시킬 수 있는지를 연구함으로써 새로운 방사선
방어제의 개발이 가능할 것이다.
따라서 본 연구에서는 항산화 및 항염증 작용이 있는 것으로 알려진 녹차 추출물을 사용하여 방사선을 조사한 암세포 및 정상세포에 미치는 영향을 조사 하고자 하였다.
Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ.
.
.재
재
재료
료
료 및
및
및 방
방
방법
법
법
A.시료
녹차추출물 (GreenTeaExtract,DrFujikii공급)
(95% (-)-Epigallocatechingallate(EGCG)from greentea)
B.세포배양
마우스의 정상 소장상피세포주 IEC-6와 인간 대장암세포주 HCT-116는 한국
세포주은행에서 분양받아 10％ fetalbovineserum (GibcoBRL,USA)과 항생제
(penicillin(100units/ml),streptomycin(100ug/ml),Gibco BRL,USA)가 포함된
DMEM (GibcoBRL,USA)와 RPMI1640(GibcoBRL,USA)배지를 각각 사용
하여 37℃,5％ CO2조건 하에서 배양하였다. C.약물처리 및 방사선 조사 직경 100mm dish에 2×105개의 세포를 분주하여 사용하였고 10회 이하로 계대 배양하였다.실험에 사용된 세포는 90％ 이하로 융합된 배양세포만을 사용 하였다.24시간 배양된 세포에 녹차추출물을 다양한 농도로 24시간동안 처리한 후,6MV 선형가속기를 이용하여 상온에서 방사선을 조사하였다.0.5％ 트립신을 처리하여 세포를 회수하였다. D.MTT assay 직경 100mm dish에 2×105개의 세포를 분주하였다.배양기(37℃,5％ CO 2) 에서 24 시간동안 배양한 후,녹차추출물을 각각 0,0.025,0.05,0.1,0.2 mM의 농도로 처리 하였다.다시 배양기(37℃,5％ CO2)에서 24시간동안 배양한 다음 트립신 처리하여 세포를 획득한 후 0,2,4,6Gy의 선량으로 방사선을 조사하였
다.방사선이 조사된 세포를 96-wellcultureplate에 5×103/well로 분주한 후,
층액을 제거한 다음 3-(4,5)-Dimethylthiazol-2-yl-diphenyltetrazolium bromide
(MTT)를 처리하였다. 배양기(37℃, 5％ CO2)에서 1 시간동안 배양한 다음
DMSO를 처리하였고,배양기(37℃,5％ CO2)에서 4시간동안 배양하여 580nm
에서 흡광도를 측정하였다.
E.Clonogenicassay
직경 100mm dish에 2×105개의 세포를 분주하였다.배양기(37℃,5％ CO
2)
에서 24시간동안 배양한 후,녹차추출물을 0,0.05,0.25,0.5,1.0mM의 농도로
처리 하였다.다시 배양기(37℃,5％ CO2)에서 24시간동안 배양한 다음 트립신
으로 처리하여 세포를 획득한 후,방사선을 조사(4 Gy)하였다.이를 6-well
cultureplate에 분주한 후,배양기(37℃,5％ CO2)에서 배양하였다.10일후 배
지를 제거하고 70％ 알코올로 고정한 다음 1％ crystalviolet으로 염색하였고,물
로 세척한 다음 건조하여 집락수를 세었다.
G.Reactiveoxygenspecies(ROS)assay
직경 100mm dish에 2×105개의 세포를 분주하였다.배양기(37℃,5％ CO 2) 에서 24시간동안 배양한 후,녹차추출물을 0,0.25,0.5,1.0mM의 농도로 처리 하였다.다시 배양기(37℃,5％ CO2)에서 24 시간동안 배양한 다음 트립신으로 처리하여 세포를 획득한 후,방사선조사(4Gy)를 실시하였다.이를 배양기(37℃, 5％ CO2)에서 1시간동안 배양한 후,DCF/DA를 처리하여 37℃에서 10분간 배 양하였다.트립신 처리하여 세포를 획득한 후,PBS로 2번 세척한 다음 Coulter
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
.
.결
결
결 과
과
과
A.MTT assay MTT assay를 이용하여 세포생존에 대한 방사선 및 녹차추출물의 효과를 알 아보았다.적절한 방사선 조사량을 알아보기 위해서 0,2,4,6,Gy를 조사한 결 과,IEC-6과 HCT-116둘 다 방사선량이 증가함에 따라 세포생존율이 감소하였 다(Fig.1-1).정상세포주 및 종양세포주 모두에 세포살상효과가 있는 4 Gy 를 사용하여 녹차추출물이 방사선에 의한 세포살상에 미치는 영향을 조사하였다. IEC-6에서 0.025,0.05mM의 녹차추출물은 단독 사용시에도 세포의 증식능을 증 가시켰을 뿐만 아니라 방사선조사 후에도 세포생존율을 증가시켰다.이러한 효과 는 0.05mM에서 더 크게 나타났다.반면 0.1mM 이상에서는 오히려 세포의 생 존율이 방사선 단독군보다 감소하였다(Fig.1-2). HCT-116의 경우,모든 농도 의 녹차추출물에서 단독 혹은 방사선과 함께 사용하였을 때 세포생존율이 농도 에 비례하면서 감소하였다(Fig.1-3).F F Fiiiggg...111---111..M.MMTTTTTT aaassssssaaayyy...TTThhheeerrreeelllaaatttiiiooonnnssshhihiippp bbbeeetttwwweeeeeennn rrraaadddiiiaaattitiiooonnn dddooossseeaeaannnddd ccceeellllll s s suuurrrvvviiivvvaaallliiinnnIIIEEECCC--6-66aaannndddHHHCCCTTT---111111666ccceeellllllllliiinenneesss...
Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in
"materialandmethods".Thedosewas0,2,4,6Gyforradiation.
0 00 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.8 0.8 0.8 0.8 1 11 1 1.2 1.2 1.2 1.2 0 Gy 0 Gy 0 Gy 0 Gy 2 Gy2 Gy2 Gy2 Gy 4 Gy4 Gy4 Gy4 Gy 6 Gy6 Gy6 Gy6 Gy IEC-6 IEC-6 IEC-6 IEC-6 1 1 1 1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.2 1.2 1.2 1.2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.4 1.4 1.4 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.6 1.6 1.6 1.6 0 Gy 0 Gy 0 Gy 0 Gy 2 Gy2 Gy2 Gy2 Gy 4 Gy4 Gy4 Gy4 Gy 6 Gy6 Gy6 Gy6 Gy HCT-116 HCT-116 HCT-116 HCT-116 A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e A b s o rb a n c e
F F Fiiiggg...111---222...MMMTTTTTT aaassssssaayayy...TTThhheeeeeeffffffeeeccctttooofffrrraaadddiiiaaatttiiiooonnnaaannndddGGGrrreeeeeennnTTTeeeaaaEEExxxtttrrraaaccctttooonnn I I IEEECCC---666ccceeellllllllliiinnneee...
Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in "materialand methods".The dose was 0,4 Gy forradiation,0,0.025,0.05,
F F Fiiiggg...111---333...MMMTTTTTT aaassssssaayayy...TTThhheeeeeeffffffeeeccctttooofffrrraaadddiiiaaatttiiiooonnnaaannndddGGGrrreeeeeennnTTTeeeaaaEEExxxtttrrraaaccctttooonnn H H HCCCTTT---111111666ccceeellllllllliiinnneee...
Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in "materialand methods".The dose was 0,4 Gy forradiation,0,0.025,0.05,
B.Clonogenicassay MTT assay에서 얻어진 결과를 확인하고 녹차추출물의 효과가 방사선 조사 량에 따라 다르게 나타나는지를 알아보기 위해 clonogenicassay를 시행하였다. 녹차추출물 처리와 방사선조사를 시행한 세포를 분주한 후 10 일 동안 배양액 교체 없이 유지시키고 이후에 집락수를 계수하여 세포생존분획을 계산하였다. IEC-6의 경우,방사선만을 조사하였을 때 세포생존율이 방사선 조사량에 따라 비례적으로 감소하였다.녹차추출물 0.05 mM 처리군은 녹차추출물을 처리하지 않은 군보다 0,2,4 Gy에서 세포생존분획이 증가하였다.녹차추출물 0.25,0.5 mM 처리군은 모든 방사선 조사량에서 녹차추출물을 처리하지 않은 군과 차이를 보이지 않았고 1.0mM 처리군은 0,2,4Gy에서 녹차추출물을 처리하지 않은 군 보다 세포생존분획이 감소하였다.6Gy를 조사한 경우 모든 농도의 녹차추출물 처리군에서 세포생존분획이 감소하였다(Fig.2-1). HCT-116 세포주에서 방사선만을 조사한 경우 IEC-6과 마찬가지로 방사선 조사량에 따라 세포생존분획이 감소하였다.그러나,녹차추출물을 처리한 군의 경우 고농도에서뿐만 아니라 0.05,0.25 mM의 낮은 농도에서도 방사선에 의한 세포살상을 증가시켰다(Fig.2-2).
F F Fiiiggg...222---111...CCClllooonnnoooggegeennniiiccc aaassssssaaayyy...TTThhheee EEfEfffffeeecccttt oooff rfrraaadddiiiaaatttiiiooonnn aaannnddd GGGrrreeeeeennn TTTeeeaaa E E ExxxtttrrraaacctcttooonnnIIIEEECC-C--666ccceeellllllllliiinnneee...
Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in
"materialand methods".The dose was 0,2,4,6 Gy forradiation,0,0.05,
0.25,0.5,1.0mM forGreenTeaExtract.
Radiation Dose
Radiation Dose
Radiation Dose
Radiation Dose
F F Fiiiggg...222---222...CCClllooonnnoooggegeennniiiccc aaassssssaaayyy...TTThhheee EEfEfffffeeecccttt oooff rfrraaadddiiiaaatttiiiooonnn aaannnddd GGGrrreeeeeennn TTTeeeaaa E E ExxxtttrrraaacccttotoonnnHHHCCCTTT---111111666ccceeellllllllliiinnneee...
Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in
"materialandmethods".Thedosewas0,2,4,6Gyforradiation,0,0.05,0.25
mM forGreenTeaExtract.
Radiation Dose
Radiation Dose
Radiation Dose
Radiation Dose
C.ROS assay
방사선이 조사된 세포에서 녹차추출물이 세포내 ROS 수치에 미치는 영향을 알아보기 위하여 DCF/DA를 사용하여 ROS 수치를 측정하였다.IEC-6의 경우
녹차추출물 0.05 mM 처리군은 방사선 단독 조사군보다 ROS 수치가 낮았으며, 0.1 mM 처리군은 방사선 단독 조사군과 거의 비슷한 수치를 보여주었다.반면 0.2mM 처리군의 경우 ROS 수치가 더 높게 나타났다(Fig.3-1).HCT-116에서 는 방사선 단독 조사군과 녹차추출물 0.05,0.1mM 처리군 간에 ROS 수치에 차 이가 없었고 0.2 mM 처리군은 방사선만을 조사한 군보다 ROS 수치가 높았다 (Fig.3-2).
F F
Fiiiggg...333---111...RRROOOSSS aaassssssaaayyy...FFFAAACCCSSS aaannnaaalllyyysssiiisssooofffIIIEEECCC---666ssstttaaaiiinenneedddwwwiiittthhDhDDCCCFFF///DDDAAA... Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in "materialand methods".Thedosewas0,4Gy forradiation,0,0.05,0.1,0.2 mM forGreenTeaExtract.
F F
Fiiiggg...333---222...RRROOOSSS aaassssssaayayy...FFFAAACCCSSS aaannnaaalllyyysssiiisossoofffHHHCCCTTT---111111666ssstttaaaiiinnneeedddwwwiiittthhhDDDCCCFFF///DDDAAA... Experiments performed in triplicate.Cells were measured as described in "materialand methods".Thedosewas0,4Gy forradiation,0,0.05,0.1,0.2 mM forGreenTeaExtract.
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ.
.
.고
고
고 찰
찰
찰
방사선에 의한 손상을 감소시킬 수 있는 약제 개발을 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다.그러나.약제 자체의 부작용,불확실한 효능 등으로 인해 현재까
지 상용화되어 있는 약제는 Amifostine밖에 없는 실정이다.비타민 E,비타민 C
등 비타민제의 방사선 손상 억제작용에 대한 연구가 있으며 Rooibostea는 전신
방사선조사에 의한 골수,비장의 지질과산화(lipid-peroxidation)의 감소에 효과가
있다는 보고가 있다 (ShimoiK,etalMutationResearch350,1996.,Yoshioka
H etalBiosci.Biotech.Biochem.60(1),1996).다른 보조제로 Selenium 역시 방사선에 의한 조직 손상을 감소시키는 효과가 있음이 보고되고 있다 (Turkoglu UM etal.LifeScience66(20),2000).이와 같이 다양한 항산화물질들의 방사선 조직 손상 감소효과가 발표되었다.그러나 이러한 방사선방어제로써의 기능을 보 여준 물질들이 종양세포에서 어떠한 영향을 나타내는 지를 정상세포와 동시에 연구한 결과는 없다. 본 연구에서는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 여러 천연물질 중 항암효 과를 나타내는 녹차추출물을 사용하여 방사선방어제로써의 효능을 살펴보았다. 지난 20여 년간 녹차추출물을 사용한 in vitro,in vivo 연구들이 진행되었으며 특히 일본의 Dr.Fujiki등은 많은 긍정적인 연구결과들을 발표하였다.녹차 추출 물은 산소라디칼을 제거하고 금속이온을 격리(sequestration)시킴으로써 항산화,
항염증 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Varelik GW etal.J Nutr131,
2001.,KatiyarSK.Carcinogenesis 22(2),2001.,SerafiniM etal.European
JournalofClinicalNutrition50,1996).또한 위암세포,폐암세포,혈액암세포 등 의 증식 억제효과는 NF-κb,Cox-2및 VEGF 의 억제,TNF-α의 생성억제,그리
고,세포자멸사(apoptosis)의 증가에 의한다고 보고하였다.역학조사에 의하면 녹
차를 마신 사람들에서 평균 수명이 증가하였으며 초기 유방암 환자에서 재발이
감소하였다 (FujikiH,etalNutrition Reviews54(11),1996.,Jung YD etal.
KormoriA etal,Jpn J Clin 23,1993.,FujikiH etalP.S.E.B.M.220, 1999). 본 연구에 의하면 방사선과 함께 0.025및 0.05mM의 녹차추출물을 사용하 였을 때 방사선만을 조사받은 경우에 비해 정상 세포주인 IEC-6에서 방사선조사 후 세포생존율이 증가하였고,대장암 세포주인 HCT-116에서는 방사선에 의한 세포살상이 증가하였다.즉,적절한 농도의 녹차추출물은 방사선에 의한 손상을 감소시키면서 동시에 항암 효과도 나타낼 수 있는 양면성이 있음을 확인하였다. 이는 종양세포에 대한 보호효과 없이 방사선으로 인한 정상세포를 손상으로부터 보호할 수 있음을 보여 주는 결과이며 더 나아가 환자의 방사선치료 시에 응용 할 경우 치료효과를 증강시킬 가능성을 시사하고 있다. 방사선을 조사받은 정상 및 암세포에 대한 녹차추출물의 영향이 세포내 ROS 수치와 관련된 것인지를 알아보기 위한 실험을 시행하였다.0.05mM의 녹 차추출물을 사용한 경우 방사선조사 단독군에 비해 IEC-6세포주에서는 ROS 수 치가 감소하였고 HCT-116세포주에서는 수치의 차이가 거의 없는 결과를 보여 주었다.반면에 세포살상을 증가시켰던 농도의 경우 두 세포주 모두에서 ROS 수
치가 증가하였다.이를 MTT assay와 clonogenic assay의 결과와 함께 분석해
보았을 때 녹차추출물이 나타낸 양면효과(dualeffect)는 부분적으로 녹차추출물 이 정상세포에서 ROS를 세포로부터 제거하는 능력을 증가시켰거나 ROS 생성을 감소시켰기 때문일 것으로 생각된다. IEC-6세포주에서 0.025및 0.05mM의 녹차추출물을 단독으로 사용하였을 때 세포생존율이 증가하였다.이는 녹차추출물이 세포의 증식능을 향상시켰기 때 문으로 생각된다.이러한 효과는 방사선을 조사받은 IEC-6 세포주에도 일어날
포손상에 미치는 녹차추출물의 영향을 규명하는 첫 in vitro 연구이다.향후 본 연구에서 확인된 양면효과의 기전을 밝히기 위한 연구가 필요하며 정상세포의 방사선에 의한 손상을 감소시킬 수 있는 농도와 세포살상효과가 있는 농도의 차 이가 크지 않음을 고려할 때 단순히 녹차추출물의 농도를 증가시키기 보다는 여 러 항산화제와 병용하는 실험이 임상적으로 더 유용할 것으로 판단된다.항산화 및 항염증 효과를 갖고 있는 여러 플라보노이드계 물질들 중에서 방사선 손상을 감소시킬 수 있는 대상물질을 찾아내고,나아가 이들을 병용하여 사용함으로써 보다 강력하게 방사선에 의한 손상을 개선할 수 있는 지를 규명하는 연구가 진 행되어야 할 것이다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
.
.결
결
결 론
론
론
마우스의 정상 소장상피세포주인 IEC-6와 인간 대장암세포주인 HCT-116을 이용하여 녹차추출물이 방사선에 의한 세포살상에 어떤 영향을 미치는지 알아보
기 위하여 MTT assay,clonogenicassay,ROS assay를 실시하였고 다음과 같
은 결과를 얻었다. 정상 세포주인 IEC-6의 경우에 0.025및 0.05mM의 녹차추출물을 단독 혹은 2,4Gy의 방사선과 함께 사용하였을 때 세포생존분획이 증가하였다.이러한 증 가는 0.05mM에서 현저하였다.그러나 대장암세포주인 HCT-116에서는 정상세 포주와는 달리 세포보호효과는 관찰되지 않았고 오히려 세포생존율이 감소하였 다. 즉, 적정농도의 녹차 추출물은 IEC-6의 세포생존을 증가시키는 반면, HCT-116에서는 세포살상을 증가시키는 양면성이 있음을 관찰하였다.이러한 양 면효과는 방사선에 의해 생성된 ROS를 세포로부터 제거하는 능력 및 생존세포 들의 증식능의 차이에서 기인할 것으로 생각된다. 환자들은 방사선치료 중이나 후에 장 또는 그 외 장기의 염증성 변화,섬유 화로 인해 다양한 증상을 경험하게 되고 질병 발생 전보다 삶의 질이 저하되는 경우가 많다.따라서 실생활에서 손쉽게 얻을 수 있는 물질들을 사용하여 방사선 으로 인한 염증반응을 감소시키고 체내 항산화효소 수치를 증가시킬 수 있다면 환자들의 삶의 질 향상에 도움을 줄 수 있을 것이다.그러나 천연자원물질에 대 한 연구는 주로 암세포 사멸에 관련된 연구가 대부분이며 항산화효과를 이용한 방사선방어제로써의 효능을 검증하는 연구는 거의 없었다.따라서 본 연구를 통 해 손쉽게 임상에 적용할 수 있는 저비용의 방사선 방어제의 개발이 가능할 것
참
참
참 고
고
고 문
문
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ABSTRACT
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JeongHyeHwang TheGraduateSchoolofMedicine AjouUniversity(SupervisedbyProfessorMisonChun)
Many studieswith Green teaextract(GTE)showedboth antioxidantand
anticancereffects.Also ithas been shown to haveprotectiveeffectagainst
gamma-ray induced scission of E-ColiDNA.Recently,it is even under
clinicaltrialto evaluate the possibility as a chemo-preventive agent.This
study was undertaken to evaluate the effectofdifferentdoses ofGTE on
normalandcancercells.
Inthisstudy,weperformedinvitrostudywithmouseintestinalepithelial
cellline,IEC-6 and human colon cancer cellline,HCT-116.Cells were
irradiatedwith asinglefraction (0,2,4and6Gy)atroom temperature.We
used varied concentration of GTE. The effect of GTE on IEC-6 cells
(unirradiated/irradiated) and HCT-116 cells (unirradiated/irradiated) were
evaluatedwithMTT assay,clonogenicassay,andROS assay.
This study confirmed a dualeffectoflow concentration ofGTE (≤0.05
mM)on normaland cancercells(unirradiated/irradiated):protectiveeffecton
effectofGTE with higherconcentration (≥0.1 mM)on both ofIEC-6 and HCT-116(unirradiated/irradiated).
TheseresultssuggestthattreatmentwithproperconcentrationofGTE is
able to protectnormalcells from radiation induced damage by decreasing
ROS levelandenhancing proliferativeactivityofsurviving cellswhileitdose
nothavetheeffecttoincreasecancercellsurvival.
Key words : Green Tea Extract, GTE, IEC-6, HCT-116, MTT assay,
