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0
2017년 2월
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석사학위논문
2 년 8 월
타크로리무스로 유발된 급성 신독성 흰쥐에서 녹차 추출물과 제미글립틴의
신보호 효과
문
전 신 성 반 낭 창
조선대학교 대학원
의 학 과
윤 영 민
tjr 2 0 1 7 년
2 월
석 사 학 위 논 문
타 크 로 리 무 스 로 유 발 된 신 독 성 흰 쥐 에 서
G T E 와 제 미 글 립 틴 의 신 보 호 효 과
윤 영 민
석타크로리무스로 유발된 급성 신독성 흰쥐에서 녹차 추출물과 제미글립틴의
신보호 효과
Renoprotective Effects of Green Tea Extract and Gemigliptin on Acute tacrolimus-induced Nephropathy in Mice
2017년 2월 24일
조선대학교 대학원
의 학 과
윤 영 민
석타크로리무스로 유발된 급성 신독성 흰쥐에서 녹차 추출물과 제미글립틴의
신보호 효과
지도교수 김현리
이 논문을 의학 석사학위신청 논문으로 제출함
2016년 10월
조선대학교 대학원
의 학 과
윤 영 민
윤영민의 박사학위논문을 인준함
위원장 조선대학교 교수 정 종 훈(인)
위원 조선대학교 교수 김 현 리(인)
위원 조선대학교 교수 신 병 철(인)
2016년 12월
조선대학교 대학원
-i-
목 차
ABSTRACT∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙iv I. 서론∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙1 II. 연구재료 및 방법∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙3
1. 연구 재료∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙3 2. 흰쥐 실험 준비 및 처치∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙3 3. 생화학적 분석∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙4 4. Western Blot 분석∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙4 5. 신장 조직의 형태학적 분석∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙5 6. 통계학적 분석∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙5
III. 결과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙6
1. 신장 기능에 미치는 효과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙6 2. 24 시간 단백뇨 양에 대한 효과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙7 3. 신장 조직학적 변화 ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙8 4. Mouse kidney western blot 결과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙8
IV. 고찰∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙21
V. 결론∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙24
참고문헌∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙25
-ii-
표목차
표 1. Creatinine, BUN결과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙10 표 2. 24 hour urine protein amount∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙11
-iii-
도목차
그림 1. BUN 변화∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙12 그림 2. Creatinine 변화∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙13 그림 3. 24 hour urine protein amount∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙14 그림 4. 신장조직검사 결과∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙17 그림 5. 신장조직검사 대조군, 타크로리무스군∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙14 그림 6. 신장조직검사 GTE군, Gemigliptin군∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙15 그림 7. 신장조직검사 GTE+저용량Gemigliptin군, GTE+고용량Gemigliptin군
∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙16 그림 8. Western blot 결과 p53∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙18 그림 9. Western blot 결과 bcl-2∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙19
-iv-
ABSTRACT
RenoprotectiveEffects ofGreen Tea Extract and Gemigliptin on Acute tacrolimus-induced
Diabetic Nephropathy in Mice
Yoon Young MIn
Advisor: Prof. Kim Hyun-Lee M.D.
Department of Medicine,
Graduate School of Chosun University
Background : It has been reported that the proteinuria is an early predictive marker in detection of tacrolimus (TAC) nephrotoxicity. The aim of this study was to
investigate the renoprotective effects of green tea extract (GTE) and dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) inhibitor gemigliptin on TAC-induced acute nephrotoxicity in mice.
Methods : The mice (n=30) were divided into 5groups (n=5/group); control group were intraperitoneally (IP) injected 0.9% saline, TAC group were IP injected TAC2 mg/kg, DPP IV inhibitor group were given inadditiongemigliptin20 mg/kg (G20) by oral gavage. TAC-GTE group were given TAC by IP injection and GTE 100 mg/kg by
-v-
subcutaneous injection. TAC-GTE-G20 group were given with same dosages.
Results : The 24 hours urine protein amounts were significantly increased in TAC group compared to control group and significantly decreased in TAC-GTE- G20group compared to TAC group. The nitric oxide (NO) production by TAC was significantly suppressed by EGCG and gemigliptin in management. Renal tissue malondialdehyde level was significantly increased in TAC group compared to control group and significantly decreased in TAC-EGCG-G20 group compared than that of TAC group. The renal function and antioxidant enzyme activities were significantly suppressed in TAC group compared with control group and restored in EGCG and gemigliptin treatment group.
Conclusion : GTE and gemigliptin treatment has beneficial antiproteinuric and renoprotective effects on TAC-induced acute renal injury in mice.
Key word : Tacrolimus, Dipeptidylpeptidase IV inhibitor, Renoprotective, Green tea extract
-１- I. 서론
타크로리무스는 신장이식을 받은 환자에서 면역억제 치료제로 널리 사용되고 있는 약이다. 하지만 몇몇 환자에서 이식신의 기능저하 더 나아가서 이식신의 기능을 잃게 한다. 몇몇 연구에서 타크로리무스가 신장의 간질의 섬유화를 일으 키고, 세관의 위축을 가져오고, 들세동맥에 면역세포의 축적과 유리질증을 일으 켜 신장기능을 점차적으로 악화시킨다고 알려져 있다. [Shihab FS et al.,1997].
비록 타크로리무스 유발 신독성의 병리학적 기전은 밝혀지지 않았지만 일부는 타크로리무스가 직접적으로 신장세포에 독성을 나타내고 일부는 타크로리무스 에서 유발된 산화성 스트레스가 신기능 저하와 세포 손상을 일으킬 것이라고 생각하고 있다.[Han D et al., 2010; Hwang H et al., 2012; Piao S et al., 2014]
Dipeptidylpeptidase (DPP) IV 억제제는 최근 개발된 당뇨병 약제로 glucagon-like peptide-1(GLP-1)과 같은 인크레틴 호르몬의 생물학적 영향을 증가시켜 효과를 나타낸다. [Neumiller J et al.,2010; Shih C-M et al., 2014]
몇몇 연구에서 DPP IV 억제제는 또한 시스플라틴치료 후 발생한 허혈성-재관 류로 발생한 신기능을 개선 시키고 [Neumiller J et al.,2010; Shih C-M et al., 2014]한쪽 신장을 절제한 경우와 당뇨 신장병증에서 신장기능 개선 시키는 효 과를 나타내는 것으로 알려져 있다. [Glorie LL et al., 2012; Joo KW et al., 2013;
Katagiri D et al., 2013]
이런 연구들에서는DPP IV 억제제가 신보호작용을 하는 기전을 GLP-1 증가로 생각 하고 있다.
-２-
녹차는 안전하고 널리 보급되어 있으며 항산화 기능이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 녹차는 superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxyl radical등 반응성 산화 물질들을 포집하여 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. [Zaveri NT., 2006]. 또한 몇몇 연구에서 신장질환에서 녹차의 항산화 작용이 신장을 보 호하는 역할을 하는 것으로 생각되어 진다. [Yokozawa T, et al., 2012].
그러나, 타크로리무스에서 유발된 급성 신손상에서 DPP IV 억제제와 녹차 추 출물의 작용기전 및 신보호 역할에 대해 아직 명확히 밝혀지지 않았다.
본 연구는 타크로리무스 유발 급성 신손상 흰쥐에서 녹차추출물과 DPP IV 억 제제인 Gemigliptin이 신장을 보호하는 시너지 효과가 있는지를 확인하고 그 기 전을 밝히고자 한다.
-３-
II. 연구 재료 및 방법
1. 연구 재료
Tacrolimus는 종근당 (서울, 한국)에서 구입하였고 녹차 추출물(green tea extract, GTE)은 Maity 등에 의한 hot-water 추출법을 사용하였다 [Maity et al., 1998]. 제미글립틴(gemigliptin tartrate sesquihydrate)는 LG 생명과학 (서울, 한국)에서 구입하였다.
2. 흰쥐 실험 준비와 처지
실험동물은 생후 8주된 BALB/C계 수컷 흰쥐(바이오코리아, 대전)를 구입하여 사용하였으며 조선대학교 동물실험실에서 사육하였다. 흰쥐 30마리를 대조군 (control 군, 5마리), 타크로리무스 투여군(TAC 군, 6마리), 타크로리무스와 GTE 투여군(GTE 군, 5마리), 타크로리무스와 제미글립틴 투여군(DPP4 군, 5마리), 타크로리무스와 GTE와 저농도 Gemigliptin 병합투여군(GTE+dpp4 군, 5마리)그 리고 타크로리무스와 GTE와 고농도 Gemigliptin 병합투여군 (GTE+DPP4 군, 6 마리)으로 분류하였다. 대조군은 생리식염수를 복강으로 투여하였다. 그 외 5군 의 실험군은 타크로리무스 2mg/kg을 복강으로 3일 간격으로 총 4회 투여하고 급성 신부전을 유발시켰다. GTE투여군은 타크로리무스 2 mg/kg을 투여하고부 터 100mg/kg를 경구 투여하였고 DPP4-억제제투여군은 제미글립틴을 20 mg/kg 경구로 투여하였고, GTE 와 저농도Gemigliptin 병합투여군GTE 100mg/kg 제미글립틴 2mg/kg 를 경구로 투여하였으며, GTE 와 고농도
-４-
Gemigliptin병합투여군은 GTE 100mg/kg 제미글립틴20 mg/kg 를 경구로 투여 하였다. 대조군, 타크로리무스군, 타크로리무스와 제미글립틴투여군, 타크로리무 스와 GTE 와 고농도 Gemigliptin병합투여군에서 3주 뒤 24시간 단백뇨 검사하 였으며 쥐들은 4주째에 희생하여 혈액을 채취하고 즉시 양측 신장을 적출하였 다.
3. 생화학적 분석
혈중 요소질소(blood urea nitrogen, BUN), 혈청과 소변 크레아티닌 (creatinine)은 AVIDA 1650 (Siemens, NY, USA)를 이용하여 측정하였으며 24시 간 단백뇨양은 Cobas Integra 800 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 녹십자 의료재단(서울)에 의뢰해서 측정하였다.
4. Western Blot 분석
쥐들은 4 주째에 신장을 적출하여 한쪽 신장을 즉시 드라이아이스와 알코올을 섞은 용액에 급속 냉동시키고 처음 단백질을 SDS polyacrylamide gel 전기영동에 의하여 분획한 다음 영동된 분획을 위치를 유지시킨 그대로 filter paper 에 옮겨 immuneradioassay 법에 의하여 Bcl-2, P53 을 확인하였다.
5. 신장 조직의 형태학적 분석
쥐들은 4 주째에 신장을 적출하여 이를 절반씩 분할하여 10% buffered formaline
-５-
(0.1M phosphate buffer, pH 7.4)를 사용하여 4℃에서 24 시간 정도 고정하였다. 고 정된 조직은 통상의 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 파라핀 조직 처리(Tissue-Tekk, Sakura, Japan)를 시행한 후, 회전식 미세박절기를 이용하여 4 mm 두께로 연속 절편 을 제작하였다. 절편은 Hematoxylin and eosin (HE) 염색을 시행하였다.
6. 통계학적 분석
통계학적 분석은 SPSS(Statistical Package for Social Science v 22.0)를 이용 하였으며, 모든 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 기술하였다. 각 군간의 평 균치의 비교는 Mann-Whitney test와 Kruskal-Wallis test를 이용하였고, 통계적 유의성은 p < 0.05 유의수준으로 검정하였다.
-６- III. 결과
1. 신장 기능에 미치는 효과
타크로리무스투여군은 대조군에 비하여 혈중요소질소가 유의하게 증가하 였다. (24.88±3.30 mg/dL vs. 92.52±16.74 mg/dL, p = 0.08). GTE 투여군 (43.74±5.02 mg/dL p = 0.08 )과 Gemigliptin 투여군(33.04±5.57 mg/dL p
= 0.08), GTE + 저용량Gemigliptin 투여군(30.10±5.63 mg/dL p = 0.08 ) GTE + 고용량Gemigliptin 투여군(25.6±1.98 mg/dL p = 0.08 )로 GTE 와 gemigliptin 투여 군 모두 Tacrolimus 군에 비하여 혈중요소질소가 유의하게 감소하였다. (Table 1)
혈청 크레아티닌 값은 타크로리무스군에서 대조군에 비하여 유의하게 증가하 였다. (0.17±0.01 mg/dL vs. 1.49±0.26 mg/dL, p = 0.08). GTE 투여군 (0.35±0.07 mg/dL p = 0.08), Gemigliptin 투여군(0.26±0.03 mg/dL p = 0.08), GTE + 저용량Gemigliptin 투여군(0.26±0.04 mg/dL p = 0.08), 고용량 Gemigliptin 투여군(0.23±0.05 mg/dL p = 0.08 ) 모두 혈청 크레아티닌 값이 타크로리무스군에서 대조군에 비하여 유의 하게 감소하였다. (Table 1)
GTE 투여군과 비교하였을 때 Gemigliptin 투여군의 BUN은 (43.74±5.02 mg/dL vs 33.04±5.57 mg/dL p = 0.032) 로 BUN 호전에 유의하게 효과 있었 고 혈청 크레아티닌은 (0.35±0.07mg/dL vs. 0.26±0.03mg/dL p = 0.056)으로 크레아티닌은 감소는 더 많이 하였으나 유의하지 않았다. GTE + 저용량 Gemigliptin 투여군은 GTE 단독 투여군과 비교하여 BUN과 크레아티닌은 모두
-７-
유의하게 감소 하였다 (BUN 43.74±5.02 mg/dL vs 30.10±5.63 mg/dL p = 0.016, Creatinine 0.35±0.07mg/dL vs 0.26±0.04mg/dL p = 0.032) GTE + 고 용량Gemigliptin 투여군도 GTE 단독 투여군과 비교하여 BUN과 크레아티닌은 모두 유의하게 감소 하였다 (BUN 43.74±5.02 mg/dL vs 24.88±3.30 mg/dL p
= 0.008, Creatinine 0.35±0.07mg/dL vs 0.23±0.05 mg/dL p = 0.032)
Gemigliptin 투여군과 비교하였을 때 GTE + 저용량Gemigliptin 투여군은 BUN과 크레아티닌이 더 많이 감소하였으나 둘 다 유의하지 않았다. (BUN P value = 0.421, Creatinine P value = 0.690) GTE + 고용량Gemigliptin 투여군은 BUN이 유의하게 감소하였다. (33.04±5.57 mg/dL vs 24.88±3.30 mg/dL p = 0.032) 크레아티닌은 감소하였으나 유의하게 감소하지는 않았다.
(00.26±0.03mg/dL vs 0.23±0.05 mg/dL p = 0.151). GTE + 저용량Gemigliptin 투여군과 비교하여 GTE + 고용량Gemigliptin 투여군은 BUN과 크레아티닌 모두 거 많이 감소하였으나 둘 다 유의하지 않았다 (BUN P value = 0.0.222, Creatinine P value = 0.421)
2. 24시간 단백뇨 양에 대한 효과
24시간 소변 단백뇨 양은 대조군, 타크로리무스 투여군, Gemigliptin 투여군, GTE + 고용량Gemigliptin투여군에서 metabolic cage에서 24시간 유지하며 검 사하였으며 타크로리무스투여군은 대조군에 비하여 24시간 단백뇨 양이 증가하 였으나 유의하지는 않았다. (171±30.10 mg/dL vs. 535.3±105.08 mg/dL, p =
-８-
0.1). Gemigliptin 투여군(258.33±47.01 mg/dL p = 0.1), 고용량Gemigliptin 투 여군(144±19.80 mg/dL p = 0.2) 모두 24시간 단백뇨 양이 증가하였으나 타크 로리무스 군에서 대조군에 대하여 증가하였으나 유의하지는 않았다.(Table 2)
3. 신장 조직학적 변화
6군의 신장 조직 검사결과(Fig4) 대조군에 비하여 타크로리무스투여군에서는 surface bleb과 tubular epithelial cell의 swelling을 보이고 eosinophil이 증가하 고 tubule의 necrosis가 보이고 있었다.(Fig 5) GTE투여군과 Gemigliptin투여군 에서는 surface bleb과 epithelial cell의 swelling 이 보이고 있었고(Fig 6) GTE + 저용량 gemigliptin투여군과 GTE + 고용량 gemigliptin 투여군에서는 대조군 과 차이가 없었다. (Fig 7) 타크로리무스 신부전은 tubular epithelial swelling과 eosinophil 의 축적과 tubule의 necrosis를 일으키고 GTE와 gemigliptin을 투여 하면 타크로리무스 유발 신부전이 호전되었으며 두 개를 같이 투여하였을 때 효과가 증대 되었다.
4. Mouse kidney western blot 결과
Western block을 통하여 타크로리무스로 유발된 apoptosis에 대한 GTE와 Gemigliptin의 효과를 보았는데, 사람의 p53유전자는 17번 염색체 단완 (17p13.1) 에 존재하는 tumor suppressor gene으로. 세포분열에서 G1기가 끝 날 무렵, p53유전자에 의해 생성된 단백질은 세포의 DNA가 손상을 입었는지
-９-
점검하는 역할을 한다. DNA손상이 없으면 p53은 세포분열을 진행시키고 손상 된 DNA를 발견할 경우에는 DNA를 활성화시켜 수선하기 위한 다른 단백질을 유도한다. 만약 수선하기에 너무 치명적이면 p53 단백질은 세포자멸을 유도한 다. 이번 실험에서 타크로리무스 군은 control군에 비하여 p53 발현이 현저히 감소하였으며 제미글립틴군, GTE 군에서 저명하게 p53발현이 증가하였으며 GTE+고용량 Gemigliptin 투여군에서는 control 군과 비슷한 정도의 p53이 발현 하였다 (Fig 8)
Bcl-2는 세포가 분화와 조직항상성, 면역반응에 핵심적인 세포사멸을 일으 키도록 만든다. 적게 일어나면 암이나 자가면역질병을 촉진하여 반대로 너무 많 이 일어나면 국소빈혈상태를 증가시켜 조직의 퇴화를 유도한다. 우리 실험에서 대조군에 비하여 타크로리무스군은 BCL-2발현이 증가하였으며 GTE군과 GTE + 저용량 Gemigliptin군은 타크로리무스군에 비하여 BCL-2 발현이 적었으며 GTE + 고용량 Gemigliptin 군은 대조군 정도의 Bcl-2 발현이 있었다. (Fig 9)
-１０-
Table 1. Creatinine, BUN 결과
BUN Creatinine
Control (n=5) 24.88±3.30 0.17±0.01
tacrolimus (n=5) 92.52±16.74* 1.49±0.26*
GTE (n=5) 43.74±5.02** 0.35±0.07**
Gemigliptin (n=5) 33.04±5.57**† 0.26±0.03**
GTE
+ 저용량 Gemigliptin (n=5) 30.10±5.63**† 0.26±0.04**†
GTE
+ 고용량 Gemigliptin (n=5) 25.6±1.98**†‡ 0.23±0.05**†
* P = 0.008 Compared to control group
** P = 0.008 Compared to Tacrolimus group
† p < 0.05 Compared to GTE group
‡ P = 0.032 Compared to Gemigliptin group
-１１-
Table 2. 24hr urine total protein amount
Groups 24hr total protein amount Control (n=5) 144±19.80
Tacrolimus (n=5) 535.3±105.08 Gemigliptin (n=5) 258.33±47.01 GTE + 고용량 Gemigliptin (n=5) 171±30.10 P= 0.1로 유의하지는 않았음
-１２-
Figure 1. Blood urea nitrogen level in mice. TAC, tacrolimus; TG, tacrolimus + green tea extract;
TD, tacrolimus + DPPIV inhibitor; TGd, tacrolimus + green tea extract + low dose DPPIV inhibitor; TGD, tacrolimus + green tea extract + high dose DPPIV inhibitor.
0 20 40 60 80 100
Control TAC TG TD TGd TGD
BUN (mg/dL)
-１３-
Figure 2. Serum creatinine level in mice. TAC, tacrolimus; TG, tacrolimus + green tea extract; TD, tacrolimus + DPPIV inhibitor; TGd, tacrolimus + green tea extract + low dose DPPIV inhibitor; TGD, tacrolimus + green tea extract + high dose DPPIV inhibitor.
0 0.5 1 1.5 2
Control TAC TG TD TGd TGD
Creatinine (mg/dL)
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Figure 3. 24hr urine protein amount in mice. TAC, tacrolimus; TD, tacrolimus + DPPIV inhibitor;
TGD, tacrolimus + green tea extract + high dose DPPIV inhibitor.
0 100 200 300 400 500 600
Control TAC TG TGD
24hr proteinuria (mg/day)
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Figure 4. Morphologic findings of mice kidney (H&E, X400). Mice were subjected to saline injected group (Control, A), tacrolimus injected group (TAC, B), tacrolimus plus green tea extract group (TAC+G, C), tacrolimus plus Gemiglipin group (TAC+DDP, D), tacrolimus plus green tea extract plus low dose Gemiglipin group (TAC+G+ddp, E), and tacrolimus plus green tea extract plus high dose Gemiglipin group (TAC+G+DDP, F)
-１６-
Figure 5. Morphologic findings of mice kidney (H&E x 400) A : control group, B : Tacrolimus group. Tacrolimus group: Reversible injury showing surface blebs, swelling of tubular epithelial cells, increased eosinophilia, and occasional necrosis (loss of nuclei, arrow)
-１７-
Figure 6. Morphologic findings of mice kidney (H&E x400) A : GTE group, B : Gemigliptin group. A and B Reversible injury showing surface blebs and swelling of occasional epithelial cells
-１８-
Figure 7. Morphologic findings of mice kidney (H&E x 400) A : GTE+low dose Gemigliptin group, B : GTE+high dose Gemigliptin group. A and B No significant pathologic changes compared with the control group
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Figure 8. Western blot analysis of p53 protein expression.TAC, tacrolimus; TG, tacrolimus + green tea extract; TD, tacrolimus + DPPIV inhibitor; TGd, tacrolimus + green tea extract + low dose DPPIV inhibitor; TGD, tacrolimus + green tea extract + high dose DPPIV inhibitor. In Tacrolimus group (TAC) group, p53 protein expression was lower than that of control group(C). In TD group, TG group, TGd group, and TGD group, p53 protein expression was increased than that TAC group.
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Figure 9. Western blot analysis of BCL-2 protein expression.TAC, tacrolimus; TG, tacrolimus + green tea extract; TD, tacrolimus + DPPIV inhibitor; TGd, tacrolimus + green tea extract + low dose DPPIV inhibitor; TGD, tacrolimus + green tea extract + high dose DPPIV inhibitor. In Tacrolimus group (TAC) group, BCL-2 protein expression was highrer than that of control group(C). In TD group, TG group, TGd group, and TGD group, BCL-2 protein expression was decreased than that TAC group.
-２１- IV. 고찰
타크로리무스 유발 급성 신손상은 신장이식환자에서 이식 신부전을 일으키는 중요한 질환이다. 이번 연구를 통해서 DPP IV 억제제인 Gemigliptin이 타크로리 무스 유발 급성신손상에 보호작용을 하는 것을 알 수 있었다. Gemigliptin이 타 크로리무스 유발 신손상에서 산화 스트레스와 세포자멸을 막아 신기능악화를 약화시키는 것으로 나타났다.
우리의 실험에서는 타크로리무스를 투여하면 tumor suppression gene인 p53 이 억제됨을 알 수 있었으며 GTE와 DPP-IV 억제제 각각 p53의 억제를 호전시 켰으며 GTE와 DPP-IV 억제제를 같이 투여하였을 때 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한 BCL-2는 세포사멸을 일으키는데 타크로리무스를 투여하면 BCL-2가 대조군에 비하여 활성화 되며 그로 인하여 세포사멸이 활성화 되어 급성 신손상이 발생하는 것을 알 수 있었다. GTE와 DPP-IV 억제제 각각 BCL- 2 활성화를 억제를 호전시켰으며 GTE와 DPP-IV 억제제를 같이 투여하였을 때 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
타크로리무스 치료를 하게 되면 염증세포들과 사이토카인들이 모여든다고 가 정할 수 있는데 이번 실험의 신장조직검사 결과를 보면 tacrolimus를 투여할 경 우 신장 조직에 eosinophil등의 증가를 보이고 있으며 사이토카인 증가 및 epithelial cell의 swelling과 bleb이 발생하고 tubule의 necrosis가 발생하였다.
DPP IV 억제제가 타크로리무스 유발 급성 신손상에서 대식세포가 축적되고 염 증세포들이 축적되는 것에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 많은 연구들에서
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DPP IV 억제제가 염증 사이토카인의 생산을 억제하고 nuclear factor-κB를 활 성시킴으로써 항염증작용을 하는 것이 증명되었다 [Joo KW et al., 2013; Park C et al 2007; Marques C et al 2014]. DPP IV 억제제가 손상지역으로 대식세포 의 이동을 막고 그로 인하여 면역전단계의 사이토카인의 생산을 감소시켜 항염 증 작용을 일으키는 것을 알 수 있다.
녹차의 polyphenolic catechin는 epigallocatechin-3-gallate(EGCG)가 많이 함유되어 있다. 많은 연구들에서 EGCG가 동물 모델에서 보호작용을 하는 것으 로 나와있다 [Miwa et al., 2004; Nobrega MA et al., 2004; Sahin K et al., 2010]. 몇몇 연구에서 EGCG의 공급이 아급성기와 만성의 신장손상을 효과적 으로 줄여준다는 연구가 있었다. Sahin 등은 nuclear factor eythroid 2-related factor 2-mediated 인 HO-1이 산화 스트레스나 염증반응에서 항산화효소를 만 드는데 이 HO-1이 신장을 보호하는 중요한 작용을 하는 것을 알아내었다.
[Sahin K et al., 2010].
이번 실험결과에서 우리는 Green tea extract와 DPP-IV억제제가 타크로리무 스 유발 급성신부전에 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그리고 DPP-IV 억제제의 농도가 높을수록 급성 신부전에 효과적임을 알 수 있었다.
타크로리무스 유발 만성 신부전에서는 간질의 섬유화 같은 특징적인 조직학적 소 견이 나타난다. 이것은 신장이식을 받은 환자에서 매년 말기신부전으로 진행할 위험을 높인다. [de Mattos AM. Et al., 2000] TGFβ1이 타크로리무스 유발 섬유화 에 주된 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 실제로 neutralizing anti-TGFβ1
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antibody 을 주자 시스플라틴 관련 구조적 손상이 호전되었다. [Islam M et al., 2001]. DPP-IV 억제제도 타크로리무스 유발 신장 섬유화의 악화를 막는 작용을 하는 것으로 생각된다. 실제 동물 모델에서 이런 결과들을 보였다. [Joo KW et al., 2013].
Reactive oxygen species(ROS)에 의해 산화스트레스가 발생하는 것은 cyclosporine 유발 신장손상의 common pathway로 알려져 있다. [Yoon HE et al., 2009]. 단기간 또는 장기간 타크로리무스 치료를 하게 된 경우 신장의 free radical 생산이 증가하고 세포 자멸을 유발하고 신장의 구조적 기능적 손상을 발 생시킨다. 이번 연구를 통하여 DPP IV 억제제가 타크로무스 유발 신손상과 세포 자멸사에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
DPP-IV 억제제가 인슐린 민감도를 올려서 신보호 작용을 하였을 가능성도 있 을 것으로 보인다. 그리고 몇몇 논문에서 DPP-IV 활성은 hypoxia를 유발하고 이 것을 타겟 유전자인 hypoxia-induced factor-1를 통해 확인하였다. [Eltsching H et al., 2006; Dang D et al., 2008] 또한 DPP-IV 억제제로 인하여 GLP-1의 bioavailability가 증가하게 된다. 그리고 GLP-1은 시스플라틴 유발 신장 손상에 서 DPP-IV 억제제를 사용하였을 때 GLP-1 이 antiapoptotic effect를 나타나게 하였다.
-２４- V. 결론
타크로리무스 유발 급성 신부전은 신장이식을 받은 환자에서 급성 신부전이 발생하였을 때 반드시 원인으로 생각해야 하는 질환이나 아직 발생 기전이 아 직 명확인 밝혀지지 않았고 치료 방법 또한 확립되어 있지 않아 새로운 치료 법의 개발이 절실히 요구된다.
DPP-IV 억제제인 Gemigliptin은 타크로리무스로 유발된 급성 신손상 흰쥐에 서 신기능을 회복시켜주고 단백뇨를 줄였다. 또한 손상된 신장 조직을 회복시켰 고 그 작용기전으로 타크로리무스 유발 급성신손상 병태생리에 중요한 역할을 하는 산화 스트레스와 세포자멸을 억제하는 것으로 밝혀냈다. 특히, 단독 투여 보다는 GTE와 함께 투여했을 때 신장보호 효과가 더 좋았다.
본 연구를 토대로 특히 당뇨가 있는 타크로리무스 유발 급성 신손상 환자에 서 DPP-IV 억제제와 함께 녹차추출물을 함께 사용하면 신기능 회복과 단백뇨 감소 효과를 기대할 수 있으며, 추후 타크로리무스 유발 급성 신손상의 치료와 질환의 진행을 억제하는 자료로서 이용할 수 있는 가능성을 제시하였다고 할 수 있다.
-２５- 참고 문헌
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