한국방사선산업학회

서

론

Isoquinoline은 벤젠과 피리딘이 합쳐진 형태의 헤테 로 고리 화합물로 topoisomerase를 저해하여 항종양 효

과를 나타낸다고 알려져 있다. Topoisomerase는 α와 β

isoform이 존재한다. 이 중 α-isoform은 doxorubicin, m-AMSA, mitoxantrone, etoposide와 같은 Anthracycline계 항암제의 표적으로 작용하여 항암치료에 있어 중요한 역할을 담당한다. 또한 topoisomerase는 세포 주기에서 세포 분열 준비기인 G0에는 작용하지 않고 세포 분열기 인 G1, S, G2, M기에만 발현되어 대장암, 위암, 유방암, 림프종, 전립선암, 중추신경계 별아교세포종과 같은 악성 종양의 세포증식력을 예측할 수 있는 인자로써도 중요 한 의미를 가진다(Brian et al. 1999; Joseph et al. 2000).

이러한 DNA topoisomerase를 억제하게 되면 DNA 복 제에 영향을 미쳐 세포가 사멸하게 된다 (Giovanella et al. 1989; Bolognese et al. 2004; Webb et al. 2004). 세포분 열이 활발한 종양세포에서는 정상세포보다

topoisome-rase의 발현이 활발하며 이때 이 효소의 억제제를 주입

하게 되면 정상세포보다 종양세포로의 집적이 높아진다. Topoisomerase 억제제에 양전자 방출 동위원소를 표지 하게 되면 양전자방출단층촬영술 (Positron Emission To-mography: PET)에 이용할 수 있는 종양 영상용 방사성

─ ─ 1 ──

PET

영상용

_F

_표지

_{Isoquinolinium Salt}

_{의 합성}

허민구1_∙최상무1_∙양승대1_∙유국현2,_*

1_{한국원자력연구원,} 2_{동국대학교 화학과}

Synthesis of

_{F Labelled Isoquinoline Salt for PET Imaging}

Hee Jung Kim1,2_{, Dong Yeon Kim}2_{, In Jong Kim}1_{, Jeong Hoon Park}1_{, Heung Nae Lee}1_,

Sang Wook Kim1_{, Min Goo Hur}1_{, Sang Moo Choi}1_{, Seung Dae Yang}1_{and Kook Hyun Yu}2,_*

1_{Korea Atomic Energy Research Institute, Daejeon, Korea} 2_{Department of Chemistry, Dongguk University, Seoul, Korea}

Abstract -- The purpose of this study is to synthesize the radio fluorine labelled isoquinoline salt derivative as new radiopharmaceutical for imaging tumors using positron emission tomography (PET). The planarity of isoquinoline allows to inhibit topoisomerase or intercalate between adja-cent DNA base pairs, which result in producing double strand breaks in the DNA and a cell dea-th. Therefore, the isoquinoline has seemed to have a potential anticancer activity. In order to obtain 2-(5-[18_{F]fluoropentylisoquinolinium salt with good radiochemical yield, tosylated}

precur-sors have been synthesized. The labelling reaction was carried out for 30 minute in HMPA at 120��C. The radiochemical yield was about 50~~60%.

Key words : Isoquinoline, Positron emission tomography (PET), Cancer imaging, 18_F

* Corresponding authors: Kook Hyun Yu, Tel. +82-2-2260-3709, Fax. +82-2-2268-8204, E-mail. [email protected]

추적자를 개발할 수 있을 것이다. PET은 양전자 방출 핵종을 표지한 방사성의약품을 체내에 주입한 후 양전자 소멸 현상에 의해 발생한 511 keV의 감마선 쌍을 고리모양의 감마선 검출기로 측정 하는 영상의학기기로써 양전자 방출 핵종의 체내 분포 에 대한 공간적 위치 정보를 제공한다 (Muehllehner and Karp 2006). PET용 방사성의약품은 특정 장기나, 종양 등에 잘 집적되는 대사물질이나 항암제 등의 화합물에 방사성 동위원소를 표지하여 사용하며, 영상의 목적에 따라 목적 화합물, 전구체, 방사성동위원소, 동위원소 표 지방법을 적절히 선택해야 한다. 방사성 동위원소 표지 방법은 원소에 따라 다르나, 반응이 간단하고 반응시간 이 짧으며 가능한 반응의 마지막 단계에 표지가 되도록 한다. 본 연구에서는 topoisomerase의 활동을 저해하여 항종 양효과를 나타낸다고 보고되어 있는 isoquinoline에 양 전자방출 동위원소인 18_{F을 도입한 isoquinoline 유도체} 를 합성하여 PET에서 종양을 영상화를 할 수 있는 방 사성 의약품을 합성하는 것을 목표로 하였다 (Antony et al. 2005).

재료 및 방법

실험에서 사용된 1,5-pentanediol (96%), tosyl chloride

(ReagentPlus®_{, ›99%), tetrabutylammonium fluoride} (98%), isoquinoline (97%), Pyridine (anhydrous, 99.8%), hexamethylphosphoramide (HMPA, 99%) 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane (Kryptofix 222, puriss., ›99.0%)과 potassium carbonate (anhydrous, powder, 99.99% trace metals basis)는 Sigma-Aldrich (Mil-waukee, Wi, USA)사로부터 구입하여 정제 없이 사용하 였다. Acetonitrile (for DNA synthesis (max. 10 ppm H2O)), TLC silica gel 60 F254(25 Glass plates 20×20 cm), silica gel 60 (0.063~0.200 mm, for column chromatography (70~230 mesh ASTM))은 Merck (Darmstadt, Germany)사 에서 구입하여 사용하였다. 무담체 18_{F는 GE PET trace}

사이클로트론에서 생산하였다. 1_{H nuclear magnetic} re-sonance (NMR) spectra는 tetramethyl silane (TMS)을 기 준으로 500 MHz JEOL ECA-500 FT-NMR Spectrometer 를 이용하였으며, Mass spectra는 JEOL JMS-AX505WA 를 사용하여 얻었다. Radio TLC 검출기로는 Bioscan사의 BIOSCAN FC-3200을 사용하였다.

1. 2-(5-Fluoropentyl)isoquinolinium salt의 합성 18_{F 표지 화합물의 비교물질인} 2-(5-Fluoropentyl)iso-quinolinium salt는 아래 Fig. 1과 같이 3단계를 거쳐 합 성하였다.

1) 1,5-Pentylditosylate의 합성 (Yu et al. 2003)

아르곤 분위기 하에서 1,5-pentanediol 0.52 g (5 mmol, 1 eq)에 pyridine 10 ml에 녹인 tosyl chloride 2.9 g (15 mmol, 3 eq)를 넣는다. 0�C에서 30분 동안 반응한 뒤 TLC를 이용하여 반응 완결을 확인한 후 증류수를 5 ml 가하여 반응을 중지시켰다. 이 반응 혼합물을 dichloro-methane 20 ml와 1 M HCl 30 ml를 사용하여 추출하였다. 무수 Na2SO4로 물을 제거하고 필터 후 모액을 감압 증 류한 뒤 남은 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하 였다. 합성의 확인은1_{H NMR을 이용하였다.} 수율: 92.1%, Rf==0.56 (Hexane : CH2Cl2: Acetone==10 : 9 : 1), 1_{H-NMR (CDCl3, 500 MHz):} δ 7.76 (d,4H), 7.35 (d, 4H), 3.96 (t,4H), 2.44 (s,6H), 1.59 (m,4H), 1.34 (m,2H) 2) 5-Fluoropentyltosylate의 합성

Tetrabutylammonium fluoride 0.52 g (2 mmol, 1 eq)을 CH3CN 3 ml에 녹인 뒤 감압 증류하여 수분을 제거했다. 잔여 수분을 제거하기 위해 이 과정을 2회 반복했다. CH3CN 5 ml에 녹인 1,5-Pentylditosylate 0.82 g (2 mmol, 1 eq)을 넣었다. 환류 장치를 이용하여 90�C로 2시간 동안 반응시켰다. TLC로 반응이 종결됨을 확인한 후 용매를 감압 증류한 후 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리 하여 1_{H NMR을 이용하여 5-fluoropentyltosylate가 합성} 되었음을 확인하였다. 수율: 47.6%, Rf==0.65 (Hexane : CH2Cl2: Acetone==50 : HO OH N F TsCl Pyridine TsO TsO TsO OTs TBAF CH3CN CH3CN F F N

49 : 1), 1_{H-NMR (500 MHz, CDCl} 3) :δ 7.79 (d,2H), 7.35 (d,2H), 4.40 (dt,2_J HF==47 Hz, 3JHH==6.0 Hz,2H), 4.04 (t,2H), 2.45 (s,3H), 1.67 (m,4H), 1.45 (m,2H) 3) 2-(5-Fluoropentyl)isoquinolinium salt의 합성

5-fluoropentyltosylate 0.26 g (1 mmol, 1 eq)을

Isoquino-line 0.13 g (1 mmol, 1 eq)을 5 ml CH3CN에 녹인 플라스

크에 넣고 이 반응 혼합물을 환류 장치 설치 후 90�C에 서 24시간 동안 반응 시켰다. TLC로 반응의 종결을 확 인한 후 용매를 감압 증류하여 제거하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리한 후, 1_{H NMR와 GC-Mass} spec-tromerter를 이용하여 화합물을 확인하였다. 수율: 64.9%, Rf==0.35 (CH2Cl2: MeOH==4 : 1), 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) :δ 10.57 (s,1H), 9.03 (d,1H), 8.48 (d,1H), 8.19 (d,1H), 8.10~7.80 (m,3H), 5.07 (t,2H) 4.50 (dt,2_J HF==47.3 Hz, 3JHH==6.0 Hz,2H), 2.00~1.50 (m,6H),

FAB-HRMS Observed m/z==218.1288 (Calculated for

C14H17NF requires 218.1292).

2. (2-(5-[18_{F]Fluoropentyl)isoquinolinium salt의 합성}

Fig. 2와 같은 단계를 거쳐 (2-(5-[18

F]fluoropentyl)iso-quinolinium salt을 합성하였다.

1) 5-[18_{F]Fluoropentyltosylate의 표지}

무담체 18_{F는 GE PET trace 사이클로트론의 16.4 MeV}

의 양성자빔을 이용해 H218O를 표적으로 하는 18_O(p,n)18_{F 핵반응을 통해 생산하였다. 무담체} 18_F를 reaction vessel에서 취한 후 K2CO33.5 mg를 0.1 ml 증류 수와 Kryptofix 2,2,2 15 mg을 0.9 ml의 CH3CN에 녹인 용액에 넣어 질소 분위기 하에서 120�C에서 1 ml의 무 수 CH3CN을 세 번에 걸쳐 가하여 불변 끓음 증류에 의 해 무수의 18_{F을 얻었다. 1,5-Pentylditosylate 10 mg을} CH3CN 1 ml에 녹인 후 무수 18F과 섞었다. 이 혼합물을 90�C로 가열하고 3 분간 반응시켰다. 표지 결과를 Radio TLC를 통해 확인하였다.

Radio TLC Rf==0.65 (Hexane : CH2Cl2: Acetone==10 : 9 :

1), Radiochemical yield: 86.1% 2) (2-(5-[18_{F]Fluoropentyl)isoquinolinium salt의 합성} 5-[18_{F]Fluoropentyltosylate가 합성되었음을 TLC를 통} 해 확인한 후, 120�C에서 질소 기체를 흘려주면서 첫 번 째 반응의 용매인 CH3CN을 제거하였다. Isoquinoline 3 mg을 hexamethylphosphoraminde (HMPA) 0.7 ml에 녹여 가하고 120�C에서 30분간 반응시켰다. Radio TLC를 통 해 반응 여부를 확인하고 Solid phase cartridge (Sep-Pak®

Plus Silica cartridge, Waters)를 이용하여 미 반응한 18_F

를 흡착시켜 제거하였다.

Radio TLC Rf==0.35 (CH2Cl2: MeOH==4 : 1),

Radioche-mical yield: 89.5%

결과 및 논의

hydroxyl를 가지고 있는 1,5-pentanediol과 tosyl chloride 를 1 : 3 당량으로 반응시켜 합성하였다. 두 번째 단계는

1,5-pentylditosylate와 TBAF를 이용하여

5-fluoropen-tyltosylate를 합성하는 반응으로 이 반응은 1,5-pen-tylditosylate 양쪽대칭 화합물인 관계로 한쪽에만 선택적 으로 불소 치환반응을 할 수 없다. 그래서 한쪽에만 불 소화가 된 5-fluoropentyltosylate와 양쪽 모두 치환된 1,5-difluoropentane이 생성됨으로써 5-fluoropentyltosy-late의 수율이 낮아졌다. 이렇게 합성된

5-fluoropentylto-sylate와 isoquinoline을 반응시켜 quaternary ammonium

salts인 2-(5-fluoropentyl)isoquinolinium salt을 합성하였 다. 이 반응은 친핵성 치환반응으로 isoquinoline의 2번 위치에 있는 질소의 비공유 전자쌍이 이탈기인 tosylate 를 공격한다. isoquinoline과 5-fluoropentyltosylate를 1 : 1 당량으로 반응 용매는 CH3CN과 HMPA을 사용하였다. CH3CN으로 90�C조건에서의 반응은 18시간에서 24시간 정도 소요되었다. 반응 시간을 줄이기 위해 CH3CN보다 친핵성 치환반응의 반응 속도를 빠르게 하는 HMPA를 18_F 18_F 18_F K18_F/K[2,2,2] HMPA TsO TsO TsO OTs CH3CN N N

사용하여 실험했다. HMPA는 끓는점이 230�C 정도로 높아서 반응 온도를 CH3CN보다 높게 올릴 수 있다는 장점이 있으나 높은 끓는점으로 인해 용매를 제거하기 가 어려워 추출 후 컬럼 크로마토그래피 과정을 거쳐야 했다. 방사성동위원소인 18_{F을 표지하기 위해 친핵성 치환} 반응을 이용하며, 친핵성 치환반응은 기질의 공간적 제 한, 친핵체의 친핵성, 이탈기의 안정성, 용매 등이 전이 상태와 반응전의 에너지에 변화를 주어 반응의 속도와 수득율에 영향을 미친다. 이러한 사항을 고려하여 Fig. 3 과 같이 이탈기로서의 적합한 요소를 갖춘 tosylate를 가진 전구체를 합성하고18_{F 표지 반응을 하였다.} 각각 CH3CN, DMSO, DMF를 용매로 18F 표지 실험한 결과를 Table 1에 나타내었다. CH3CN 용매에서 85�C로 반응을 보냈을 때 20분 이 상에서 18_{F이 표지되었음을 라디오 크로마토그램으로} 확인할 수 있었으나 결과에 재현성이 없었다. 온도를 100�C로 올려 실험하였으나 반응이 전혀 진행되지 않았 다. CH3CN 용매에는 전구체가 녹지 않아서 반응 저해요 소로 작용했을 것이라 추측되어 전구체가 용해되는 용 매인 DMSO, DMF를 이용하였으나 반응이 진행되지 않 았다. DMSO의 경우 150분 이상이 경과한 후 2% 미만 의 수율로 18_{F 표지를 확인했으나 반감기가 110분인} 18_F 의 경우 반응시간이 60분 이내이어야 하므로 이 표지방 법은 적합하지 않았다. 방사성동위원소의 표지반응은 동위원소에 반감기가 있기 때문에 합성 마지막단계에 표지가 되도록 하여야 하지만 앞선 실험 결과들로 보아 전구체를 이용한 반응 이 용이하지 않아 1,5-pentylditosylate의 한쪽을 18_F로 치환한 5-[18_{F]fluoropentyltosylate를 합성한 뒤, 이 표지} 화합물을 isoquinoline과 반응시키는 2단계 합성법을 이 용하여 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium salt을 합성} 하였다(Hara et al. 2002). 18_{F의 표지반응에서는 무수 상태의 반응조건이 중요} 하다. 18_{F이 가속기에서 생산될 때 H} 218O와 같이 존재하 기 때문에 H218O를 완전히 제거하여야 한다 (Cai et al. 2008). 수분 함량이 0.001% 미만인 단백질 합성용 무수 CH3CN을 가해 질소가스를 주입하면서 수차례 건조를 시켜 수분을 제거하는데 건조 시간이 지나치게 길어지 거나 필요이상의 높은 온도는 18_{F이 반응용기에 흡착되} 게 하므로 실험을 통해 적당한 건조시간과 온도를 알아 야 한다. 1,5-pentylditosylate와18_{F의 표지반응은} Krypto-fix 2,2,2를 이용하여 80�C에서 수행하였으며 최적 반응 시간은 3분이었다. Fig. 4는 5-[18_{F]fluoropentyltosylate의} radio TLC chromatogram이다. 반응 최적시간인 3분에 TLC를 확인한 결과이며 55 mm에서의 피크로 반응여부 를 확인 할 수 있었다. 반응시간에 따라 부반응물이 경 쟁적으로 생성되었으며, 20분 이상 반응시키면 부반응물 이 주생성물보다 많아졌다. N TsO OTs OTs OTs 18 F K18F/K[2,2,2] (A) (B) CH3CN N N N

Fig. 3. Synthesis of 2-(5-tosyloxypentyl)isoquinolinium salt (A) and radiosynthesis of 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium salt using}

precursor (B).

Table 1. Fluorinations of tosylate under various reaction condi-tions

Solvent Temp. (�C) Time (min) Reaction

1 CH3CN 85 60 No reproducibility

2 CH3CN 100 60 NR

3 CH3CN 120 60 NR

4 DMF 120 60 NR

5 DMSO 150 60 NR

Fig. 4. Radio TLC chromathogram of 2-[18_{F]fluoropentyltosylate.} 8000 6000 4000 2000 0 0 20 40 60 80 100 Position (mm)

2-(5-[18_{F]Fluoropentyl)isoquinolinium salt를 합성하기} 위해 5-[18_{F]fluoropentyltosylate에 isoquinoline을 가하고} CH3CN을 용매로 하여 85�C에서 반응을 시켰다. 5분 간 격으로 TLC를 확인한 결과 150분 이상 반응시켰을 때 F-18이 표지 되었으며, 이때의 표지 수율은 10% 미만이 었다. 이러한 결과는 비교물질을 합성하는 과정에서도 알 수 있듯이 CH3CN 용매에서 85�C로 12시간 이상 되 어야 반응이 50% 이상 진행된다. 18_{F의 반감기를 고려하} 여 반응 시간을 줄이기 위해 반응 조건을 바꾸었다. CH3CN 용매에서 반응온도를 높이게 되면 끓는점이 82 �C이므로 85�C보다 높은 온도에서 반응을 하게 되면 용 매가 증발하여 5분 이상 시간이 지나면 반응 혼합물이 굳어버렸다. 그래서 CH3CN보다 치환반응을 빠르게 해 주며 끓는점이 높은 HMPA로 바꾸어 120�C에서 반응 을 한 결과 초반 5분에는 거의 반응이 진행되지 않았으 나 10분에서 40~60%의 표지수율을 보였고, 30분에서 거의 80~90%의 표지수율을 나타내었다. Fig. 5는 반응 시간 30분에서의 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium}

salt의 radio TLC chromatogram으로 30 mm 지점의 피크 가 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium salt의 피크이다.}

결

론

PET을 이용하여 종양을 영상화를 할 수 있는 방사성 의약품 개발을 위해 topoisomerase의 저해와 삽입성 물 질로서 항암 활성을 가진 isoquinoline을 quaternary

am-monium salts으로 만들고, 양전자방출 동위원소인 18_F을 치환하여 방사성 의약품 2-(5-[18 F]fluoropentyl)isoquino-linium salt를 합성하였다. 비교물질인 2-(5-fluoropentyl)isoquinolinium salt는 64.9%의 수율로 합성하였다. 18_{F 표지반응의 첫 번째 단} 계에서 1,5-pentylditosylate에 18_{F 표지반응을 한 결과} 5-[18_{F]fluoropentyltosylate를 80~90%의 방사 화학적 수율} 로 합성하였다. 그 다음 5-[18_{F]fluoropentyltosylate와} isoquinoline을 HMPA 용매 하에서 30분간 반응하여 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium salt를 89.5%의 방사} 화학적 수율로 합성하였다. 두 단계를 합한 전체 합성 수율은 70%였다. 앞으로 암영상용 진단 시약으로 이용하기 위해서 2-(5-[18_{F]fluoropentyl)isoquinolinium salt의 세포섭취와 체} 내분포에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.

사

사

참 고 문 헌

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Fig. 5. Radio TLC chromathogram of 2-(5-[18

F]fluoropentyl)iso-quinolinium salt. 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 20 40 60 80 100 Position (mm)

Muehllehner G and Karp JS. 2006. Positron emission tomo-graphy. Phys. Med. Biol. 51:117-137.

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Manuscript Received: December 24, 2009 Revision Accepted: January 7, 2010