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Nitric Oxide Synthase의 발현과 조직학적 변화
The Effect of Estrogen on Expression of Neuronal and Endothelial Nitric Oxide Synthase and on Histologic Composition in Rat Bladder and Urethra
Sung Woo Park, Jeong Zoo Lee
From the Department of Urology, College of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea
Purpose: We investigated the effects of estrogen on the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and on endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and furthermore elucidated its effect on the histologic composition of the rat bladder and urethra.
Materials and Methods: Forty-five mature female Sprague-Dawley rats (10-11 weeks, 235-250g) were randomly assigned to one of three groups:
control group (C), oophorectomy group (O), or hormone (estradiol) re- placement group (H). The degree of expression of nNOS and eNOS in bladder and urethral tissues was investigated using immunohistochemical staining, and tissue was described as mucosa, smooth muscle, or vessel.
We also investigated changes in histologic composition using Masson's trichrome stain.
Results: In bladder and urethra, the expression rates of nNOS and eNOS significantly increased in the O group, but decreased in the H group (p＜
0.05), except for nNOS in the mucosa and smooth muscle of the bladder.
The relative collagen ratios significantly increased in bladder and urethra in the O group, to 121.2±12.7% and 135.5±25.2%, respectively, but decreas- ed to 95.6±15.2% and 93.7±12.8% in the H group, respectively (p＜0.05).
Conclusions: These data suggest that estrogen replacement therapy decreases nNOS and eNOS expression and the collagen component in the urethra. (Korean J Urol 2008;49:533-539)
Key Words: Nitric oxide synthase, Collagen, Incontinence
대한비뇨기과학회지 제 49 권 제 6 호 2008
부산대학교 의과대학 비뇨기과학교실
박성우ㆍ이정주
접수일자：2007년 12월 10일 채택일자：2008년 4월 21일
교신저자: 이정주
부산대학교병원 비뇨기과 부산광역시 서구 아미동 1가 10번지
602-739
TEL: 051-240-7350 FAX: 051-255-7133 E-mail: toohotman@
pusan.ac.kr
서 론
고령의 여성에서 요실금의 가장 중요한 원인이 폐경이라 는 것은 이전의 여러 연구에서 증명되었다.1 그리고 폐경기 여성에서 에스트로겐을 보충하였을 경우, 요실금을 호전시 키는 기전으로는 요도내압을 증가시키고, 복압의 근위부 요도로의 전달을 증가시키고 방광의 감각역치를 올리는 것 으로 알려져 있다.2
근래 연구에 의하면 비아드레날린성 비콜린성 (non-adre- nergic non-cholinergic; NANC) 신경에서 nitric oxide (NO)가 분비되는 것이 여러 포유류 연구들에서 밝혀졌으며,3-5 에스
트로겐이 NO를 생성시키는 nitric oxide synthase (NOS)의 활 동성을 조절한다는 것이 여러 조직에서 증명되었다.6 이에 저자들은 에스트로겐보충요법이 방광과 요도 등의 하부요로에서 NO를 어떻게 조절하고 어떠한 조직학적 변 화를 일으키는지 알아보기 위해 난소 절제한 백서에서 호 르몬보충요법을 시행하여 방광과 요도 조직에서 neuronal NOS (nNOS)와 endothelial NOS (eNOS)에 대한 면역조직 화학적 연구를 시행하고, 더불어 조직학적 변화를 관찰하 였다.
Table 1. Study design
Weeks 0 2 4
Control group (n=15) Sham operation K* −
Oophorectomy group (n=15) Ox† K −
Hormone replace group (n=15) Ox HRT‡ K
*: killing time, †: oophorectomy, ‡: hormone replace (estradiol cypionate)
1) 난소절제와 호르몬 보충: 모든 실험 동물은 ketamine (25mg/kg)과 xylazine (5mg/kg)를 복강 내 주입하여 마취 시 킨 뒤 midline incision을 이용하여 개복하였으며 O군은 양 측 난소절제술 시행, C군은 가장 수술만 시행 및 H군은 난 소절제 후 2주 경과 후 estradiol cypionate (0.25mg/1week, Miro-depot inj., 한일약품)를 근주하였으며 O군은 sessame oil (0.25cc)만을 같은 방법으로 주사하였다 (Table 1).
2) 조직채취 및 혈류량 측정: 조직은 O군의 경우 난소절 제 2주 후, H군은 난소절제 2주 경과 뒤 호르몬 보충 2주 후 ketamine (25mg/kg)과 xylazine (5mg/kg)를 복강 내 주입하 여 마취시킨 뒤 조직을 채취하였다 (Table 1). 모든 조직은 주위의 지방조직과 결체조직을 제거하고 생리 식염수에 세 척 후 10% 포르말린에 고정하였다.
난소절제와 가장 수술 시에 doppler를 이용하여 신정맥, 대정맥, 대동맥 및 장골정맥의 혈류량을 각각 3회씩 측정하 였으며 조직 채취 시에 측정한 혈류량에 대한 비를 구하였 다.
3) 혈중 호르몬의 측정: 혈액 채취는 조직 채취 시에 대정 맥을 통해 5cc 정도 채취하여 DPC's Coat-A-Count RIA kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA)를 이용 하여 혈중 17-베타 에스트라디올 (17β-estradiol)을 측정하 였다.
4) 면역조직화학적 검사: 파라핀 포매되어진 백서의 방광 및 요도 조직을 4μm 두께로 잘라서 면역조직화학 염색을
면역조직화학적 염색 결과의 판정은 무작위로 선정된 400배 확대시야 열군데에서 대안격자 안에 보이는 전체 세 포 수에 대한 세포질과 핵막이 적색으로 염색되는 양성 세 포 수의 비율을 방광과 요도 각 조직의 점막, 평활근 및 혈 관부위로 나누어 측정하였다.
5) 평활근과 콜라겐 함량의 변화 관찰: 방광과 요도의 평 활근 성분과 콜라겐 성분의 상대적인 구성비의 변화를 보 기 위해 파라핀 포매조직을 4μm의 절편으로 만들어 masson's trichrome 염색을 하여 무작위로 400배 확대시야 열군데를 선정하여 격자 안에 보이는 콜라겐 세포의 수를 백분율로 환산하여 평균하였다.
6) 통계 분석: 혈중 에스트로겐의 농도의 변화는 Mann- Whitney U test로, 세 군에서 NOS의 발현도 변화와 조직학 적 변화는 Kruskall-Wallis test를 이용하여 비교 분석하였으 며, p값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의하다고 하였다.
결 과
1. 혈류량 변화
술 중 대정맥 및 장골 정맥에서 측정한 혈류량은 각 군에 서 의미있는 변화를 나타내지 않았다 (p＞0.05).
2. 혈중 호르몬 변화
17β-estradiol은 O군에서 3.47±2.42pg/ml로 16.27±15.49 pg/ml인 C군에 비하여 유의하게 감소하였으며, H군에서는 28.68±10.51pg/ml로 유의하게 증가하였다 (p＜0.05).
3. 면역조직화학염색 소견
1) nNOS의 면역조직화학염색 소견: C, O 및 H군에서 nNOS의 발현율이 방광의 점막 및 평활근에서는 의미있는 차이를 보이지 않았으나 (p＞0.05), 혈관에서는 C군에 비해 O군에서 의미있게 증가하였으며, O군에 비해 H군에서 의 미있게 감소하였다 (p＜0.05) (Fig. 1A, 2). 요도의 점막, 평활
Fig. 1. The mean expression percentage of neuronal nitric oxide synthase (nNOS). A: bladder, B: urethra. Control: control group, Ox:
oophorectomy group, HRT: hormone replacement group, *: p＜0.05 vs control group, †: p＜0.05 vs oophorectomy group.
Fig. 2. Immunoreactivity pattern for neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in rat bladder and urethra. (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200).
근 및 혈관 모두에서는 C군에 비해 O군에서 의미있게 증가 하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 감소하였다 (p＜
0.05) (Fig. 1B, 2).
2) eNOS의 면역조직화학염색 소견: 방광에서의 eNOS의 발현은 점막, 평활근 및 혈관 모두에서 C군에 비해 O군에 서 의미있게 증가하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 감소하였다 (p＜0.05) (Fig. 3A, 4). 요도의 점막, 평활근 및 혈관에서도 eNOS의 발현은 C군에 비해 O군에서 의미있게 증가하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 감소하였다 (p＜0.05) (Fig. 3B, 4).
4. 평활근과 콜라겐 성분 함량의 변화
조직학적 검사에서 O군은 방광 및 요도의 혈관 분포의 감소, 상피세포의 위축 및 근육층 감소 등이 관찰되었으며, H군은 방광 및 요도의 혈관 분포 증가, 상피세포의 증식 및 근육층 증가 등이 관찰되었다 (Fig. 5). Masson's trichrome 염색으로 조직 내 평활근 성분과 콜라겐 성분의 변화를 알 아보면, O군에서 상대적 콜라겐 성분비의 변화는 방광 및 요도에서 각각 121.2±12.7% 및 135.5±25.2%로 의미있게 증 가하였으며, H군에서는 95.6±15.2% 및 93.7±12.8%로 O군
Fig. 3. Mean expression percentage of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). A: bladder, B: urethra, Control: control group, Ox:
oophorectomy group, HRT: hormone replacement group, *: p＜0.05 vs control group, †: p＜0.05 vs oophorectomy group.
Fig. 4. Immunoreactivity pattern for endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in rat bladder and urethra. (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200).
에 비해 유의한 감소를 보였으며 C군과는 차이가 없었다.
고 찰
복압성요실금에서 에스트로겐의 역할에 대해서는 논란 이 있으나, 월경 중이나 임신 시에 에스트로겐과 프로겐스 테론의 혈중농도는 매우 유동적이며 이런 현상은 배뇨증상 의 발현에 영향을 미칠 수 있으며 더 나아가 불가역적 변화 인 폐경에 따른 에스트로겐의 결핍도 요실금의 발현에 원 인적인 요소가 된다고 하였다.7
에스트로겐 수용체는 하부요로, 특히 요도 점막 및 방광 삼각부 (trigone)에 높은 농도로 존재하고, 골반저를 구성하 는 치골미골근 (pubococcygeous muscle)에도 존재하여 다른 여러 분자 수준의 기전을 매개하여 요저장 (continence)에 중요한 역할을 한다.1,8 Hextall과 Cardozo9는 에스트로겐의 하부요로에 대한 역할을 네 가지 정도로 요약하였을 때, 첫 번째 방광과 요도에서 세포주기를 활성화시키고, 둘째로 요도 점막과 괄약근에 혈류량을 증가시키고, 셋째로 요도 괄약근의 α-아드레날린성 수용체를 감작 (sensitization)시 키며, 마지막으로 요도 주위 결체조직의 대사를 자극하여
Fig. 5. Masson's trichrome staining of rat bladder and urethra (x200). (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200).
노화방지를 시킬 수 있다고 하였다.
그러나 에스트로겐이 수용체를 통해 직접적인 작용으로 효과를 나타내기보다는 하부요로에서 여러 호르몬 및 신경 전달물질 수용체들의 농도와 민감도, 그리고 신경전달물질 의 대사와 같은 약리학적 상호반응에 간접적인 작용에 의 해 효과를 나타낸다. 그러한 매개 기전으로 첫 번째로 NANC 신경 자극에 의한 요도이완 반응이 있는데, Rand와 Li10는 NANC 신경에서 NO가 분비된다고 하였으며, Bennett 등11은 NO가 백서의 요도이완을 일으킨다고 하였으며, 이 런 기전을 Leone 등5은 인체에서 증명하였다. Takahashi 등2 은 가토의 요도에서 호르몬보충요법시에 NOS의 감소를 증 명하고 이로 인해 NO를 감소시켜 NANC 자극에 의한 요도 이완을 억제한다고 하여 본저자들과 같은 결과를 얻었다.
그밖에 Al-Hijji와 Batra12는 가토에서 하부요로뿐 아니라 상 부요로인 신장, 신우 및 요관에서도 NOS의 농도를 조사하 였는데, 방광 및 요도 등 하부요로에서만 에스트로겐 농도 에 따라 유의한 변화를 보였다.
그 외 다른 기전으로 Shapiro13는 가토에서 호르몬보충요 법 시 하부요로에서 무스카린성 신경수용체가 감소한다고 하였으며, Larsson 등14은 가토의 요도에서 후신경접합부 α2- 아드레날린성 수용체의 수를 증가시켜 가토의 요도에서 α 2-아드레날린성 신경자극에 의한 요도수축을 증가시킨다
는 것을 증명하였다.
또한 에스트로겐은 여성 요자제에 중요한 부분인 요도벽 의 혈관 및 평활근을 증식시키고 점막의 두께 역시 증가시 키며 이런 변화들이 요도내압을 유지시키는 데 중요한 역 할을 한다고 하였다.2 이와 관련된 몇몇 임상연구들이 시행 되었는데, 그 결과 에스트로겐은 위약군과 비교하여 객관 적인 효과는 없었고 단지 주관적인 증상의 완화를 가져왔 으며 이는 에스트로겐이 전체적인 삶의 질의 향상을 가져 오기 때문인 것으로 보고되고 있다.15,16
이처럼 임상에서 폐경기 여성의 요실금에 에스트로겐 단 독요법은 크게 효과를 보지 못했으나, 몇몇 연구에서 α-아 드레날린성 효현제인 phenylpropanolamine 등과 병용요법 시에는 효과가 인정되어 수술에 적응이 되지 않는 경한 복 압성요실금 환자의 치료에 유용하게 쓰일 수 있다고 하였 는데 실제로 뇌혈관 등에 대한 부작용으로 실제 사용엔 한 계가 있어 보이고 현재 ephedrine 또는 pseudoephedrine 등의 약물을 이런 목적으로 사용할 수 있다.17
NOS의 분획 중에 eNOS, nNOS 및 iNOS가 있으며 염증이 없는 하부요로 조직에서 요도수축을 조절하는 데 NO의 농 도는 주로 eNOS 및 nNOS가 주역할을 한다.18 본 연구에서 nNOS는 방광 및 요도의 평활근에 가장 많이 분포하였으며 eNOS는 혈관 외에 방광의 점막에 높은 농도를 보였다. 그
nNOS 및 eNOS가 증가하여 이형성된 세포의 고사를 조장 한다고 하였다. 즉, 저자들의 실험모델은 약 2주간의 비교 적 짧은 실험기간과 iNOS 및 세포고사를 측정하지 않아 이 러한 연관성을 증명하기에는 미흡하지만 방광의 점막과 평 활근에서는 각 군별로 의미있는 변화를 관찰하지 못했으 나, 혈관에만은 의미있는 변화를 보인 것은 일차적인 혈류 량의 증가를 위해 나타난 변화라고 생각되며, 기존의 가설 가 같은 맥락이라고 볼 수 있을 것이다. 특히 체내 estrogen 의 변화에 따른 혈류량의 변화에 있어 NO가 중요한 역할을 한다는 것은 증명되어져 있으며, 나아가 방광의 수축력이 나 방광내압에도 변화를 시킬 수 있다고 하였다.20 요도에서는 α1 수용체를 통한 아드레날린성 자극 및 콜 린성 자극을 통한 요도의 수축이 일어나며, 반대로 NO를 통한 이완이 일어난다. 즉, 난소절제 후 요도의 점막 및 평 활근에 증가하는 NO는 요도의 이완을 증가시키며, 나아가 nNOS와 eNOS의 증가로 세포고사의 증가를 도모하여 요도 의 위축이 발생하게 될 것이다. 즉, 수축력 및 탄력성이 감 소하는 요도의 위축이 발생하여 요실금이 발생할 수 있는 조건을 만들게 되는 것이다.
결 론
난소 절제한 백서 모델에서 증가하였던 요도 조직 내 nNOS 및 eNOS의 발현율은 에스트로겐보충요법으로 감소 하였으나, 방광 조직 내에서는 혈관에서만 이러한 변화가 관찰되었다. 그리고, 난소 절제 후 에스트로겐보충요법으로 방광 및 요도 조직 내 증가하였던 콜라겐은 감소, 감소하였 던 평활근은 다시 증가하였다.
폐경으로 인해 요도의 조직은 위축되는 양상을 보이고, 수축력은 감소하여, 요실금 발생을 증가시키는 조건으로 변화하게 된다고 할 수 있을 것이다. 그러나 이러한 변화는 호르몬 요법으로 인해 감소시킬 수 있을 것이라 생각한다.
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