Vibrio 대한

대한임상병 리사회지

:

제 19권 제 1 ^호 1987

Vibrio vulnificus 의 면역혈청에 대한 연구

원광보건전문대학 임상병리과 오 재세， 김 신무， 박 선희

A Study on the Immune Sera of Vibrio vulnificus , Serogroups

Oh Ja e- Se , Kim Shin-Moo , Park Sun-Hee

Dept. 01 Clinical Pathology , Won Kwang Piμblic Health Junior College

= ^Abstract =

For preparation and serogrouping of the O-antisera, V. vμln힘cus strains (serogroup 01, 02, 04 , and 05) were inoculated into BHI broth (1 % N aCl). After overnight incubation at 36.C incubator , the cultures were heated at 100.C for 2 hours. the heated organisms were then washed twice with N-saline , after final centrifugation , the packed cells were resuspended in N-saline.

The density of the cell suspension was adjusted to that of the MaFarland N o. 4. Two rabbits per serogroup strain were each injected intravenously with 0.5, 1.0, 2.0, and 3. Oml amount of the suspension at intervals of 3 to 4 days.

The animals were bled on 6th day after completion of the course of immunization and serum was separated for titration of O-agglutinins of V. vμlηificus .

For diagnostic purpose of clinical microbiology, this study was performed for the preparation and absorption of O-antiserum of V. vμlη쩌'cus. The results are as follows.

O-agglutinin titers of the immunized rabbit sera that injected with four serogroup strains of V. vμlηificus were determined from 1 : 640 to 1 : 1 , 280 by bacterial agglutination test.

For absorption of the non-specific agglutinin of each O-serogroup antisera , 6ml of 1 : 8 diluted antiserum absorbed by the packed cells derived from growth of 2 tubes of BHI broth (1% NaCl) 10ml was sufficient for the diagnostic purpose of V. vulnificus , the cultures to be examined should be washed twice

The 0- serogrouping for 24 strains of V. ^vuln힘'cus isolated from human and seafish are summerized in table 6. of these, 14 strains were grouped by four 0- antisera (anti-01, anti-02, anti-04, and anti-05) ; of the remainder, three were cross-reacted with two or four antisera and the other seven strains did not react with any of the antisera.

I . 서 론 ting Vib서0 라 불렸고1) 1979년 Farmer에 의해서 비 로소 Vibrio vμln힘cus 라고 명명하게 되었다 2) Vib서'0 vuln힘cμs는 1976년 Hollis 등에 의해서 최 이 균은 바닷물， 갯벌 혹은 어패류 등에서 서식하 초로 생화학적 특성이 규명되어 lactose fermen- 고 있다는 것이 밝혀지게 되었다 3，4) 특히 이 세균은

-145-

간질환이나 심한 음주벽이 있는 사람들이 여름에 생 선회나 어패류를 생식한 경우에 감염되며 오한， 발 열， 수포， 괴사 등이 피부병변과 함께 심한 경우 치 명적인 패혈증을 초래하기도 한다 5)

국내에서는 1982 년에 처음으로 이 세균의 감염에 대해 보고되었으며 6，7) 그 후에 국내에서도 환자와 어 패류에서 분리된 보고가 계속되었다 8，9， 10， 1 1)

1985 년 Hitsuaki와 Ramon 등은 sonicated V.

vuln힘cus의 Ouchterlony 면 역 확산법 (immunodif- fusion test) 에서 면역한 동일 세균과 그 항혈청은 단일 침강대를 나타내었으나 다른 Vib서0 균종에서 는 침강대가 나타나지 않았다고 보고하였다 12)

또한 Mitsuaki와 Ramon은 V. vμln힘cus를 용해 시켜서 공통항원을 정제하여 면역한 항혈청이 온천 한 세균과는 반응하지 않았고 용해시킨 셰균항원과 micro-면역확산법에서 특이적으로 반응하였으나，

vib깨0 속의 다른 균종과는 반응하지 않았으으로 10

시간만에 조기 진단할 수 있었다고 보고하였다 13) 1984 년 Shimata와 Sakazaki는 V , vμln껴:cμs 균 주들로 토끼에 면역하여 얻은 항혈청을 R균주에 흡 수시키므로써 7 개의 혈청형으로 분류하였으며， 70 균주를 이들 혈청형 항혈청과 반응시켜 그 분포에 대하여 발표한 바 있다 14)

우리나라에서 여름에 생선회나 어패류를 생식하 고 감염된 보고 예가 해마다 있어， 이 세균의 감염 이 심한 경우 치명적이라는 점을 감안하여 신속한 진단이 요구되는 만큼 이미 혈청형이 동정된 4 개의 균주를 토끼에 면역하여 얻은 항혈청으로 이 세군의 동정에 이용할 수 있는지를 관찰하기 위하여 7 개의 혈청형 (serogroups) 중 4 개의 균주에 대하여 실험 을 시도하였다. 그리고 V. vuln힘cus 의 감염을 진 만하는데 있어 이들 항혈청을 이용하여 좀 더 신속 하고 정확한 진단으로 조속한 치료효과를 얻는데 목 적이 있다.

11. 실험재료 및 방법

실험 균주

면역에 사용한 군주들은 이미 동정된 sero-01 균 주 (F86213)

,

sero-02 균주 (F86291)

,

sero-04 균주

(H84721) 빛 sero-05 균주 (H85IH) 등이며， 면역혈 청을 제조하여 동정시험에 사용한 균주는 우리 연구 실에서 환자로부터 분리하여 보유하고 있는 15 개 균 주와 연세의료원에서、분양받은 9 개 균주를 합해서 총 24 개 균주를 사용하였다.

흡수시 험 에 사용한 Rough--c olony (WK 9 R) 균주 는 1 % acriflavine액 과 강하게 응집 을 일으키 는 균

주를 계대배양하여， 증식시켜서 사용하였다. 혈청 형을 동정하기 위한 균주들은 BHI broth (1 % NaCl) 10ml에 접 종하고 36.C incubator에 서 18시 간 배양한 후 100.C 에서 2 시간 열 처리하고， 생리식염 수로 2 회 세척하였다. 최종 원심 후 침사세균은 O.

5ml의 생리식염수로 재부유하여 각 혈청형 항혈청 과 slide 응집에 의하여 동정하였다.

0-항혈청의 면역

V. vμln찌cus 의 혈청형을 위한 0-항혈청을 제조 하기 위하여 BHI broth (1% N aCl) 10ml에 각 균주 를 접 종하고 36.C incubator에 서 18시 간 배 양한 후 배양균은 100.C 에서 2 시간 가열하였다. 열 처리한 배양균은 생리식염수로 2 회 세척하고 최종 원섬 후 침사세균은 생리식염수로 세균의 농도를 McFar- land No. 4 와 동일하게 조정하여 채부유하였으며，

4.C 에 보관하여 면역 접종에 사용하였다. 세균의 각 헬청형마다 두 마리의 토끼에 3-4 일 깐격으로

o . ⁵

^,

^{1. 0}

^,

^{2 .} 0와 3.0ml의 세끊 부유액을 귀 (ear

lobe) 정맥 내로 각각 면역 접종하였다.

면역 계획의 종료 후 5 일에 각 토끼의 귀 정맥에 서 약 2ml씩의 혈액을 채혈하여 실온에 30분 이상 방치한 후 혈청을 분리하여 역가를 측정하였다.

항혈청의 역가측정

면역혈청 내의 항체가를 결정하기 위하여 항혈청 을 2 배 계단희석한 각 희석혈청 0.5ml를 넣은 시험 관에 0-항체의 제조에 사용한 것과 같은 배양균을 열 처 리하여 McFarland No. 2 로 조정한 동량의 세 균 부유액을 가하여 세균응집반응을 실시하였다.

겸 사 결 과는 50.C water bath에 서 18 시 간 반응시 킨 후 2+ 정도의 응칩을 일으킨 항혈청의 희석도 로써 항체의 역가를 판독하였다.

비특이 응집소의 홉수

각 면역혈청이 면역한 모든 균주간에 응집을 일으 키므로 흡수시험을 실시하였다. 각 면역혈청은 원혈 청 (undiluted serum)

,

1: 4 빛 1:8 희 석 혈청으로 흡수시험에 임했으며 흡수시험에 사용된 균형은 V.

νμln힘CUS， sero-01

,

02

,

04

,

05 균주와 R 균주인

WK9R 균주를 사용하였다. 흡수하는 침사 세균의

조작은 면역균주의 준비와 똑같은 방법에 의해서 실 시하였다.

川.실험성적

1 . 항혈청의 역가

Table 1 에서 보여주는 것과 같이 항혈청의 역가는

1 : 640에서 1 : 1， 280을 나타내었다. 4 개의 혈청형

-146-

05 균주에는 흡수가 되었으나 04 균주에는 흡수가 되지 않았다. 그리고 anti-05는 02 균주에만 흡수되 었을 뿐 01과 04 균주에는 흡수되지 않았다. 항혈청 을 더 희석하고 더 농후한 균액으로 흡수시키면 진 단용 항혈청으로 사용할 수 있다는 암시를 제시하여 주었다.

항혈청 중에서 anti-02 만이 1 : 640을 나타내였으며，

다른 항혈청은 모두 1 :

1, 280을 나타내었다. 그런데

단독적으로 혹은 서로간의 응집반응에서 모두 교차 반응이 일어났으므로 흡수시험을 실시하였다.

Table 1. O-agglutinin titer of each antiserum immunized with V. vuln힘cμS ， serogroups

3. Agglutinability of antiserum (1 : 4) after absorption by R-strain and reciprocal strains

~Antigen Antiserum~

Anti-01 Anti-02 Anti-04 Anti-05

V. vμln힘cus ， serogroup 01

+++

+++

++

+++

05

+

04

++

+++

+++

+++

02

+++

Table

Death (2nd injection) 1 : 1 , 280

1 : 640 1 : 640 1 : 1 , 280

Death (3rd injection) 1 : 1 , 280

1 : 1 , 280

Rabbit N o. O-Agglutinin titer

1li n/“

1l4 n/“

1l4

끼/“

1lA n/“

Sero-Ol (F86213) Sero-02 (F86291) Sero-04 (H84721)

Sero-05 (H85IH) Strain

++

Antiserum(l: 4) , 2ml: PC of R-strain(l tube) and reci procal strains (1 tube culture)

4. R권f주와 서로간의 균주의 농후한 침사 세균에 의한 홉수혈청의 반응도

1:8 희석혈청， 2 ml를 R-균주와 면역시킨 균주 상호간의 농후한 침사 세균에 흡수시킨 후 각 항혈 청의 응집상태를 살펴보면 table 4 에서 보여주는 것과 같이 각 흡수혈청이 명확한 특이성을 나타냈기 때문에 진단용 혈청으로 사용할 수 있다는데 확신을 갖게 되었다.

Table 2 에서 흡수혈청의 반응도를 각 항혈청 (원 혈 청 ), 2 ml를 BHI broth 10ml에 배 양한 R 균주의 침사 세균에 흡수한 결과 anti-01 항혈청은 혈청형 02와 05 인 균주와 응칩이 일어나지 않을 정도로 흡 수되었을 뿐 다른 항혈청은 모두 흡수가 불충분하였 음을 나타내였다. 그런데 table 2 에는 나타내지 않 았지만 anti- : 01 혈청을 R-균주의 생균과 사균에 각

1 회 흡수시킨 결과 혈청형 01 균주에만 특이적으로 응집하는 것을 확인하고 여러 가지 방법에 의한 흡 수시험을 시도하였다.

2. R-균주에 의한 홉수혈청의 반응도

4. Agglutinability of antiserum(l: 8) after absorption by the heavy cells of R-strain and reciprocal strains

05 V. νulnijicus ， serogroup

04 02

Table

~Antigen Antiseru~

Anti-01

I

+ + +

Anti-02 Anti-04 Anti-05

01 2. Agglutinability of antiserum (1 : 1)

after absorption by R-strain

\낭I\ntigen Antiserum~

Anti-01 Anti-02 Anti-04 Anti-05

V. vulηijicμS ，

serogroup

01

+++

+++

+++

++

05

+ + + + + +

04

+++

+++

++

+++

02

++

+++

++

Table

+++

+++

+++

Antiserum (1 : 8) , 2 ml : PC of WK 9 R (2 tube) and reciprocal strains (2 tubes)

Antiserum (1 : 1) , 2 ml : PC of WK 9 R (1 tube)

+ +, + + + ; Agglutination grades

; N

0

agglutination

5. R-균주와 상호간의 균주의 농후한 칩사 세균에 의한 다량의 항혈청의 반응도

3. R~균주와 상호간의 균주에 의한 홉수혈 청의 반응도

전 실험과 달리 같은 농후 침사 세균과 6ml의 Table 3 에서 살펴보면 anti-01 과 anti-04는 02와

낀

1:8 희석 항혈청과의 홉수상태를 살펴보면 table 5 에서 보여주는 것과 같이 농후한 침사 세균에 대 해서 1:8 희석혈청 6ml에도 원만하게 흡수되었음 을 나타내었다. 따라서 각 혈청형에 대한 면역혈청 이 상기한 방법에 의해서 흡수시키면 특이적인 혈청 형 진단용 혈청을 제조하여 임상세끌학적 동정에 유 용하게 이용할 수 있다는 확신을 갖게 하였다.

Table 5. Agglutinability of antiserum (1 : 8) after absorption by the heavy cells of R-strain and reciprocal strains

\낸~tigen I V. vuln행αs， 똥ro맑oup Antiserum"'- I 01 02 04 05

Anti-01 I + + +

Anti-02 - + + +

Anti-04 Anti-05

+++

+++

Antiserum (1 : 8) , 6 ml : PC of WK 9 R (2 tubes) and reciprocal strains (2 tubes culture)

6. 4 개의 면역혈첨에 의한 혈청형 판정 면역한 후 흡수시험을 거친 4 개의 혈청형 항혈청 에 의해서 24 개의 분리균주를 조사하여 본 결과 anti -01 혈청에 응집한 균주가 1 개， anti-02 혈청에 1

개， anti-04 혈청에 117~ ， anti-05 혈청에 1 개가 응 집하으로써 각각 혈청형이 분류되었다.

4 개의 혈청형 항혈청에 전혀 반응하지 않은 것 (이들은 03

,

06 흑은 07 혈청형에 속할 것으로 예상 됨)이 7 권주 이었으며， 2 내지 4 개의 항혈청과 교차응집하여 혈청형이 결정되지 않은 균주가 3 개 있었다. 결국 24균주 중 3 개의 균주 (12.5%) 만이 혈청형을 결정할 수 없었다 (Table 6) .

Table 6. Serogrouping for 24 strains of V.

vulη쩌'cus isolated

O- group Source Total

Human Seafish

01 0 1

02 0 1

04 8 3 11

05 1 0

Other gro0u7p)

(03 , 06 , 7 0 7

Unkown 3 0 3

Total 19 5 24

IV. 고 찰

V. vμln띔cus는 1976년 Hollis 등에 의 해 서

lactose fermenting Vib서o 라고 보고한 후 1) 1979년 Former에 의해서 V. vμlη힘cus 라고 비로소 명명된 셰균이다2)

이 셰균은 간질환이나 심한 음주벽이 있는 사람들 이 여름에 생선회 혹은 어류를 생식하므로써 감염되 면 오한， 발열， 수포， 빛 괴사와 같은 피부병변은 물 론 심한 경우 치명적인 패혈중을 초래하는 관계로5) 우리나라 학자들도 1982년 이래 환자와 어패류 둥에 서 속속 분리 보고 하게 되었다5-11)

1985년 Mitsuaki와 Ramon은 sonicated V.

ψln쩍cus로 토끼에 면역하여 얻은 항혈청으로 Ouchterlony의 면 역 확산볍 (immunodiffusion test) 에 의한 실험 결과에서 V. vuln쩌cμs의 단일 침강 대가 생긴다고 보고하였다 12) 그리고 또 셰균을 용 해시켜서 면역한 항혈청은 온천한 셰균항원과 반응 하지 않으나 용해시컨 세균항원과 microimmuno.

diffusion test에서 특이적으로 반응하지만 Vib꺼0 의 다른 균종과는 반응하지 않으묘로 항혈청을 이용 하여 10시간 내에 조기 진단할 수 있다고 보고하였

다 12)

1984 년 Shimata와 Sakazaki는 V. vulnificμsit 주들을 토끼에 면역한 항혈청이 교차반응을 일으키 므로 R-균주를 선택하여 흡수시킨 결과 7 종의 혈청 형으로 분류할 수 있었다고 하였으며 이들 항혈청으 로 70균주를 혈청형 판정검사( serogrouping) 한 결 과 01 혈청형이 27% (19/70) 를 차지하고 04 혈청형 이 20% (14/70) 를 차지하고 나머지 혈청형은 대개 1% 혹은 1% 이내로 분류되었다고 보고하였다μ)

저 자들은 동정 된 4 개 의 군주 (serogroup 01

,

02

,

04와 05) 를 토끼에 면역하여 얻은 항혈청들이 1 : 640 내지 1 : 1， 280의 응집가를 나타내었으나 이들 항혈청은 V. vuln힘cus의 다른 혈청형과 교차반응 을 일으키므로 이들 항혈청은 다가혈청 (polyvalent

antiserum) 으로 이용할 수는 있으나 혈청형 진단혈 청으로 이용할 수 없으므로 공통항원에 의한 교차반 응을 제거하기 위하여 최적의 흡수조건을 찾기 위하 여 흡수를 시도하였다.

각 항혈청 2ml를 R-균주 (WK 9 R) 의 1 개의 시 험관이 배양균에 흡수시킨 결과 table 2 와 같이 흡 수가 불충분하였다. 1: 4희석 항혈청 2ml를 R-끌 주와 상호간의 균주 1 개의 시험관 배양균에 흡수시 킨 결과 table 3 과 같이 역시 불충분하였다. 그래서

1 : 8 희석 항혈청 2ml를 R-윤주와 상호간의 균주

의 2 개의 시험관 배양균에 흡수시킨 결과 table 4

-148-

와 같이 흡수가 충분히 되어 각 혈청형 항혈청이 특 이적으로 응집하였으으로 serogrouping 할 수 있어 진단용 항혈청으로 이용할 수 있게 되었다. 또한 항 혈청 내의 항체와 세균항원(혈청형 항원)이 최적 흡 수되는 조건을 찾기 위하여 1:8 희석 항혈청 6ml 를 R-균주와상호간의 군주의 2 개의 시험관배양균 에 흡수시킨 결과 table 5 에서 보여주는 것과 같이 흡수가 충분히 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

차후에는 본 연구에서 입수못한 나머지 균주들 (03 , 06 , 07 혈청형)도 입수되는데로 면역 연구를 계속할 작정이다. 그래서 7 개의 혈청형 항혈청이 구비되면 V. vμln쩌cus의 혈청형 판정을 할 수 있 을 것으로 사료된다.

V. 결 론

Vibrio vμln쩌cus의 혈 청 형 (serogroup) 을 위 한 0

-항혈청을 제조하기 위하여 BHI broth(l% NaCl) 10ml에 4 개의 균주 (01， 02 , 04 빛 05 혈청형)를 접 종하고 incubator (36.C 에 서 18시 간 배 양 후 100.C 항온수조 (water bath) 에서 2 시간 가열하였다. 열 처리한 배양군은 멸균된 생리식염수로 2 회 세척하 고 최종원심 후 침사 세균은 멸한된 생리식염수로 세율 농도를 McFarland No. 4 로 조정하여 재부유 한 후 균주당 2 마리의 토끼에 면역 접종하였다. 각 면역혈청은 R-균주와 서로간의 균주의 농후한 침사 세균에 흡수하여 특이적인 혈청형 항혈청을 제조하 여 24개의 분리균주에 대해서 혈청형 동정시험을 실 시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1 . 토끼에 면역한 V. vμlη쩍cμs의 4 개의 혈청 형에 대한 항혈청 내의 0-항체가는 1 : 640 내 지 1 : 1 , 280 이었다. 그러나 모든 항혈청은 면역한 모든 혈청형의 셰람에 교차응집반응 이 일어났다.

2. R-균주 (WK 9 R) 와 상호간의 균주의 농후한 첨사 세군에 흡수시킨 6ml의 희석혈청 (1:

8) 은 최적으로 흡수되어 각 혈청형 항혈청은 해당 균주와만 특이적으로 응집하여 진단용 항혈청으로 사용할 수 있었다.

3 . 이들 항혈청을 이용하여 24개의 분리 균주들 에 대 하여 serogrouping한 결 과 table 6 에 서 보여주는 것과 같이 이 혈청형은 1 주， 02 혈 청형은 1 주， 04 혈청형은 11주， 05 혈청형은

1 주， 기타 혈청형 (03 , 06 , 07) 은 7 주 그리 고 전혀 판정되지 않은 균주는 3 주이였다.

췄 (본 연구를 할 수 있도록 균주를 분양하여 주시 고 여러 가지로 조언해 주신 연세의료원 임상병리과

정 윤섭 교수님께 심심한 감사를 드립니다. ) 참고문헌

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