▒ 접수 ▸ 2011년 10월 12일 수정 ▸ 2011년 12월 3일 채택 ▸ 2011년 12월 5일
▒ 교신저자 마진열, 대전시 유성구 전민동 461-24 한국한의학연구원 한의신약연구그룹 Tel +82-42-868-9639 Fax +82-42-868-9573 E-mail [email protected]
▒ 연구비지원 : 교육과학기술부 지원 한국한의학연구원 기관고유사업 K11050
유산균 발효에 의한 소청룡탕의 발효 전 후 성분 변화 연구
1
양민철,
2김동선,
3정상원,
3마진열
1(주)한국콜마 석오생명과학연구소, 2한국한의학연구원 한약기초연구그룹, 3한국한의학연구원 한의신약연구그룹
Analysis of Constituents in Socheongryong-tangs Fermented by Lactic acid bacteria
Min-cheol Yang, Dong-seon Kim, Sang-won Jeong, Jin-yeul Ma
1Kolmar Korea co.,Ltd. The institute for LifeScience of SeogO, 2Basic Herbal Medicine Research Group, Korea Institute of Oriental Medicine,
3TKM-Based Herbal Drug Research Group, Korea Institute of Oriental Medicine
Objective : The purpose of this study was to investigate the changes in the contents of constituents in Socheongryong-tang (CY) and its fermentations (FCY) with 10 species of lactic acid bacteria.
Methods : Ten strains of lactic acid bacteria, Lactobacillus casei 127, L. acidophilus 128, L. casei 129, L. plantarum 144, L. amylophilus 161, L. curvatus 166, L. delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, B. breve 744, and B. thermophilum 748, were used for the fermentation of Socheongryong-tang. The increased and decreased constituents were identified using HPLC/DAD and various liquid chromatographic techniques, and the structure was elucidated using NMR and MS.
These compounds were quantitatively analyzed using an HPLC/DAD system.
Results : The increased constituents were identified to be liquiritigenin (1) and cinnamyl alcohol (2), and the decreased constituent was determined to be liquiritin (3). Liquiritigenin (1) and cinnamyl alcohol (2) were increased in all of the FCYs, while liquiritin (3) was decreased. The fermentation of the ten lactic acid bacteria demonstrated that the decomposable rate of these three compounds in FCYs were different. Socheongryong-tang fermented by L. plantarum 144 and L. amylophilus 161 showed the most remarkable changes.
Conclusions : CY could be increased antibacterial, neuroprotective, or antiinflammatory effect by fermentation with lactic acid bacteria, especially with L. plantarum and L. amylophilus, considering their known biological activities. In addition, it is expected that this study will help to establish quality control parameters for FCY.
Keywords : Socheongryong-tang, fermentation, lactic acid bacteria, liquiritigenin, cinnamyl alcohol, liquiritin
Ⅰ. 서 론
小靑龍湯은 麻黃 ( Ephedra sinica ), 桂枝 ( Cinnamomum cassia ), 乾薑 ( Zingiber officinale ), 白芍藥 ( Paeonia lactiflora ), 半夏 ( Pinellia ternata ), 細辛 ( Asiasarum sieboldi ), 五味子 ( Schisandra chinensis ), 甘草 ( Glycyrrhiza
glabra )로 구성되어 있으며, 傷寒으로 인한 表症이 풀리지 않고 心下에 水氣가 있어서 헛구역을 하고 기가 逆하며 열이 나고 咳嗽喘息하는 증세를 치료한다고 알려져 있다
1,2). 약리효과로는 호흡기 질환
3-5)및 항균효과
6)가 연구 보고되어 있다. 최근 한의학계에서는 醱酵 (fermentation) 한약에 대한 관심과 수요가 높아지고 있다. 한방에서는 醱酵法에 대하여 ‘일정한 온도에서 霉菌을 이용해서 발효토록 함으로써 약성의 변화 및 새로운 발효의 생성과 더불어 약효를 증강시키는 방법’
등으로 정의하고 있으며
7), 한약에 따라 일정한 방법을
채용한 후 온도와 습도가 적합한 환경에서 발효를 진행
한다. 발효법을 이용하는 한약으로는 神麴, 紅麴, 淡豆鼓 등이 있으며, 최근에는 시장 변화에 따라 매균 뿐만 아니라 유산균 등을 이용하여 여러 한약재 및 한방제제에 대한 발효 연구가 활발히 이루어지고 있다
8-11). 이와 같이 발효 한약에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 유산균을 이용한 발효 한약 및 그에 따른 성분 변화에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구에서는 소청 용탕을 실험 재료로 10종의 유산균을 이용하여 발효를 시킨 후 발효를 하지 않은 소청룡탕 원탕 및 10종의 유산균 발효물에 대한 성분 변화를 관찰하였다. 발효 균주로서는 Lactobacillus casei 127, L. acidophilus 128, L. casei 129, L. plantarum 144, L. amylophilus 161, L. curvatus 166, L. delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, Bifidobacterium breve 744, B.
thermophilum 748를 사용하였고, 10종의 발효물에 대하여 HPLC/DAD 분석 결과 성분 변화가 가장 뚜렷한 L. plantarum 144 발효물에서 增減이 분명한 3종의 성분 중 증가한 liquilitigenin 및 cinnamyl alcohol을 분리 정제하여 구조 규명을 하였으며, 감소한 liquiritin은 표준품과 비교 분석하여 규명하였다. 이들 3종 성분을 지표성분으로 하여 HPLC/DAD system을 이용하여 소청룡탕의 발효 전 후 성분 변화를 연구 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 약재추출
소청룡탕(CY)의 한약재 구성은 麻黃 ( Ephedra sinica ), 桂枝 ( Cinnamomum cassia ), 乾薑 ( Zingiber officinale ), 白芍藥 ( Paeonia lactiflora ), 半夏 ( Pinellia ternata ), 細辛 ( Asiasarum sieboldi ), 五味子 ( Schisandra chinensis ), 甘草 ( Glycyrrhiza glabra )이다. 이들 한약재는 영천 약업사 (Gyeongbuk Yeongcheon, Korea)에서 구입 하였으며 대한약전에 기술된 각각의 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였고 전탕 추출법 (초고속 진공 저온 약탕기, model : cosmos-600, KyungSeo Machine Co., Incheon, Korea)에 의해 소청룡탕을 조제하였 으며, 이들 한약재를 24945 ㎖의 증류수에 넣어 11 5℃에서 3시간 동안 열탕 추출한 후, standard testing sieve (150 ㎛, Retsch Co., Germany)를 이용하여 탕액을 여과하였다.
2. 발효 조건
발효에 사용된 10종의 유산균은 ( L. casei 127, L.
acidophilus 128, L. casei 129, L. plantarum 144, L. amylophilus 161, L. curvatus 166, L. delbruekil subsp. lactis 442, L. casei 693, B. breve 744, B.
thermophilum 748) 한국식품연구원 (Korea Food Research Institute: KFRI, Seongnam, Korea) 식품 미생물 유전자은행에서 분양 받았다. Lactobacillus spp.는 MRS broth (Difco, Detroit, MI, USA)에서, B. breve 744, B. thermophilum 748은 Reinforced Clostridial Medium (Difco)에서 계대 배양한 뒤 초기 균수를 1×10
6CFU/mL로 조절하여 inoculum으로 사용하였다. 여과한 소청룡탕의 pH를 7.0으로 조정한 후 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1% (v/v)로 접종하고 37℃의 항온배양기에서 48시간 동안 발효시킨 뒤 standard testing sieve로 여과하여 동결 건조하여 분석에 사용 하였다. 동결건조 후 수율은 L. casei 24.37%, L. acidophilus 128 24.38%, L. casei 24.18%, L. plantarum 24.54%, L. amylophilus 23.18%, L. curvatus 24.64%, L. delbruekil subsp. lactis 24.28%, L. casei 24.37%, B. breve 24.13%, B. thermophilum 23.85%로 나타났고, 발효전 원탕의 경우는 24.19% 였다.
3. 시약 및 기기
HPLC 분석에 사용된 water 및 acetonitrile은 J.T Baker (Phillipsburg, NJ, USA)의 HPLC급 용매를 사용하였다. 지표 물질인 liquiritigenin, cinnamyl alcohol은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), liquiritin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
(Osaka, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였다. 분석에
사용한 HPLC system은 Elite Lachrom HPLC/DAD
system (Hitachi High-Technologies Co., Tokyo,
Japan)을 사용하였으며 L-2130 pump, L-2200
auto-sampler, L-2350 column oven, L-2455
diode array UV/VIS detector, EZchrom Elite
software (version 3.3.1a) 로 구성되어있다. NMR
spectrum은 Varian사의 INOVA 600, INOVA
400NB NMR (Varian Co., USA), MS spectrum은
Item Condition
Mobile phase
Time(min) Water Acetonitrile
0 95 5
5 95 5
70 0 100
80 0 100
Flow rate 1.0 ml/min
Inject volume 10 μL
Column
OptimaPak C18
(4.6mm×250mm, 5μm, RS tech Co., Daejeon, Korea)
Column temperature 40 ℃
UV wavelength 250, 276 nm
<Table 1> HPLC condition for analysis of non-fermented and fermented
Socheongryong-tang
(CY and FCY).<Fig. 1> HPLC/DAD spectrums of compounds 1 – 3.
1. Liquiritigenin; 2. Cinnamyl alcohol; 3. Liquiritin.
ESI-IT-TOFMS (Shimadzu Co. Japan)와 JMS-600W EI-MS (JEOL Co., Japan)를 사용하여 측정하였다.
Prep HPLC는 Gilson pep HPLC (Wisconsin, USA)를 이용하여 성분을 분리 정제하였으며, 333, 334 pump, UV/VIS151 detector로 구성되어 있다. Prep HPLC column은 Ascentis Si (10×250 mm, 10 μm, Supelco Co., USA) 및 Agilent prep-sil (21.2×250 mm, 10 μm, Agilent Co., USA) column을 사용하였다. Open column chromatography용 C
18powder는 YMC 사의 YMC*Gel ODS-A (particle size 75μm, YMC Co., Ltd., Japan)를 사용하였다.
4. HPLC 분석 조건
HPLC 분석 column은 OptimaPak C
18(4.6 mm×
250 mm, 5 μm, RS tech Co., Daejeon, Korea)을 사용하였으며, 이동상은 유속을 1 ml/mL로 하여 5%에서 5분간 유지 시킨 후, 65분 동안 100% acetonitrile까지 비율은 올린 후 10분간 100% acetonitrile을 흘려 분석 하였다<Table 1>. Injection volum은 10 μL를 주입 하였다. 파장은 지표 성분의 최대 흡수 파장에 따라 cinnamyl alcohol (1) 은 250, liquiritin (2) 및 liquiritigenin (3) 은 276nm에서 분석하였다<Fig. 1>.
5. 발효 후 증가한 성분의 분리 정제
소청룡탕 원탕과 10종의 소청룡탕 유산균 발효물을 HPLC/DAD system을 이용하여 비교 분석한 결과 10종의 발효물에서 2개의 증가한 peak와 1개의 감소한
peak가 관찰되었으며, 10종 발효물 중 가장 뚜렷한 변화를 보인 L. plantarum 144 발효물로부터 2개의 증가한 peak의 분리 정제를 수행한 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석 방법에 의해 구조를 규명하였다. 1개의 감소한 성분은 표준 물질의 t
R(retention time) 및 DAD spectrum과 비교 분석하여 성분을 규명하였다.
L. plantarum 144로 발효하여 얻어진 발효 소청룡탕의
건조분말 5g을 C
18flash column chromatography
(100% H
2O, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% MeOH)를
실시하여 7개의 분획(F1-F7)을 나눈 후, 이 중 F5 분획
(400 mg)을 60% MeOH를 유출 용매로 하여 C
18open
column chromatography를 실시하여 6개의 분획으로
나누었다 (F51-F56). 이 중 F53 (50 mg) 분획을 prep
HPLC (chloroform/methanol, 20:1)을 이용하여 compound 1
(0.7mg)을 얻었고, F6 분획 (500 mg)에서는 sephadex
Components Retention time
(tR, min) Regression equation* R2 (n=5) Liquiritigenin (1) 29.30 y = 93214x - 6211.2 0.9999 Cinnamyl alcohol (2) 30.72 y = 241294x - 36918 0.9999 Liquiritin (3) 22.29 y = 49780x - 39259 0.9983
* y, peak area; x, concentration (μg/mL).
<Table 2> Standard curves and R2 value of compounds 1-3.
CY† Liquiritigenin (1) 276nm‡
Cinnamyl alcohol (2) 250nm
Liquiritin (3) 276nm
Control 2.91±0.18 16.90±1.11 93.66±0.63
CY127 6.75±0.11 58.96±1.07 74.76±0.80
CY128 11.69±0.18 91.71±2.35 56.91±0.93
CY129 7.21±0.16 59.11±0.43 71.04±0.24
CY144 29.52±0.69 92.93±3.83 3.09±0.26
CY161 30.55±0.19 89.08±0.99 1.24±0.00
CY166 5.99±0.17 81.10±2.92 73.06±1.48
CY442 5.36±0.08 75.62±1.61 68.54±0.39
CY693 4.63±0.16 68.91±2.24 79.03±3.86
CY744 7.52±0.02 59.95±1.95 67.94±0.66
CY748 7.12±0.02 85.99±1.49 66.37±1.17
* Unit of contents : μg/mL.
† Control: non-fermented Socheongryong-tang; CY127: L. casei 127;
CY128: L. acidophilus 128; CY129: L. casei 129; CY144: L. plantarum 144; CY161: L. amylophilus 161; CY166: L. curvatus 166; CY442 L. delbruekil subsp. lactis 442; CY693: L. casei 693; CY744: B.
breve 744; CY748: B. thermophilum 748.
‡ Detection UV wavelength.
<Table 3> Contents changes of non-fermented and fermented
Socheongryong-tang
(CY, FCY)*LH-20 (methylene chloride/methanol, 1:1) 및 prep HPLC ( n -hexane/EtOAc, 7:1)를 실시하여 compound 2 (5.0 mg)을 획득하였다.
Compound 1
Yellow powder; ESI-MS m/z 279 [M+Na]
+;
1H-NMR (CD
3OD, 600 MHz) δ 2.69 (1H, dd, J = 17.0, 3.0 Hz, H-3a), 3.00 (1H, dd, J = 17.0, 13.0 Hz, H-3b), 5.40 (1H, dd, J = 13.0, 3.0 Hz, H-2), 6.33 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.50 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 6.85 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3', 5'), 7.33 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', 6'), 7.75 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5);
13C-NMR (CD
3OD, 100 MHz) δ 45.0 (C-3), 81.2 (C-2), 104.0 (C-8), 112.2 (C-6), 115.1 (C-10), 116.5 (C-3', 5'), 129.3 (C-2', 6'), 130.5 (C-5), 131.2 (C-1'), 159.0 (C-4'), 166.0 (C-9), 167.3 (C-7), 193.7 (C-4).
Compound 2
Colorless oil; EI-MS m/z 134 [M]
+;
1H-NMR (CD
3OD, 600 MHz) δ 7.40 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-2, 6), 7.30 (2H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz, H-3, 5), 7.21 (1H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz, H-4), 6.60 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7), 6.35 (1H, dt, J = 16.0, 5.5 Hz, H-8), 4.25 (2H, d, J = 5.5 Hz, H-9);
13C-NMR (CD
3OD, 100 MHz) δ 138.5 (C-1), 131.5 (C-7), 123.0 (C-4), 129.5 (C-3, 5), 128.5 (C-8), 127.4 (C-2, 6), 63.6 (C-9).
6. 검량선 작성 및 검액 조제
Liquiritigenin은 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39 μg/mL, cinnamyl alcohol은 200, 50, 12.5, 3.13, 0.78 μg/mL, liquiritin은 110, 55, 13.75, 3.44, 0.86 μg/mL의 농도로 단계적으로 희석한 시료를 분석하여 검량선을 작성하였 으며, 소청룡탕 및 발효 소청룡탕의 검액은 40㎎/mL의 농도로 조제한 후 syringe filter (PVDF, 0.45 um, non-sterile, Advantec MFS Inc., Japan)로 여과하여 분석하였다<Table 2>.
7. 정량 분석
정량 분석은 지표 성분의 면적을 검량선에 대입하여 소청룡탕 및 발효 소청룡탕에 함유되어 있는 지표 성분의 함량을 계산 하였다<Table 3>.
Ⅲ. 결 과
1. Structure Elucidation
발효 후 성분 변화가 가장 뚜렷한 L. plantarum 144 소청룡탕 발효물 5g으로부터 증가한 2종의 성분을 분리 정제하였으며
1H-,
13C- NMR , MS 및 기존 문헌과
12,13)비교하여 compound 1, 2에 대하여 각각 liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2)로 구조를 규명하였으며, 1종의 감소한 성분은 표준 물질의 HPLC t
R(retention time) 및 DAD spectrum을 비교 분석 한 결과 liquiritin (3)으로 규명되었다<Fig. 2>.
2. HPLC chromatogram과 검량선
Liquiritigenin (1), cinnamyl alcohol (2), liquiritin
(3)은 각각 29.30, 30.72, 22.29 min에서 검출되었으며,
3 O HO
O
O O CH2OH
OH OH HO
1 2
1 4 2
6 7 9
OH 7
5 8
3 2 O 1'
4' HO
OH
O
<Fig. 2> Structures of compounds 1-3 from non-fermented and fermented Socheongryong-tang (CY and FCY).
1. Liquiritigenin; 2. Cinnamyl alcohol; 3. Liquiritin.
<Fig. 3> HPLC/DAD chromatograms of CY and FCYs at 203nm.
Control : non-fermented Socheongryong-tang; CY127: L. casei 127; CY128:
L. acidophilus 128; CY129: L. casei 129; CY144: L. plantarum 144; CY161:
L. amylophilus 161; CY166: L. curvatus 166; CY442: L. delbruekil subsp. lactis 442; CY693: L. casei 693; CY744: B. breve 744; CY748: B. thermophilum 748.
이들 성분의 peak 면적에 대한 검량선에 대한 R
2value는 0.9983이상으로 높은 직선성을 나타내었다
<Table 2>.
3. 발효 균주별 liquiritigenin (1) 함량
CY의 발효 전 liquiritigenin의 함량은 2.91±0.18 μg/mL 이었으나 발효 후에는 10종의 발효 균주물 전체에서 함량이 증가하였으며, L. plantarum 144, L. amylophilus 161 발효물이 각각 29.52±0.69 μg/mL, 30.55±0.19 μg/mL로 발효물 중 가장 높은 함량을 나타내었으며, L. casei 693 발효물은 4.63±0.16 μg/mL로 가장 낮은 함량을 나타내었다<Fig. 3, Table 3>.
4. 발효 균주별 cinnamyl alcohol (2) 함량
CY를 발효하기 전 cinnamyl alcohol의 함량은 16.90±
1.11 μg/mL 이었으며, 발효에 따라 전체 10종의 소청
룡탕 발효물에서 cinnamyl alcohol의 함량이 증가하였 으며 L. plantarum 144, L. amylophilus 161 발효물이 각각 92.93±3.83 μg/mL, 89.08±0.99 μg/mL로 발효물 중 가장 높은 함량을 나타내었다. L. casei 127 발효물은 58.96±1.07 μg/mL로 10종의 소청룡탕 발효물 중 가장 낮은 함량을 나타내었다<Table 3>.
5. 발효 균주별 liquiritin (3) 함량
