Enhancement of Antioxidant Activities of Bark of Berberis koreana Palibin by Lactic Acid Fermentation

유산균 발효를 통한 매자나무 수피부의 항산화 활성 증진

하지혜*·서용창*^,**·최운용*^,**·김지선*^,**·김행훈***·안주희*·이현용*^,**^,****^†

*강원대학교 바이오산업공학부 생물소재공학과, **의료·바이오신소재융복합연구사업단,

***농촌진흥청 농업과학기술원 농업유전자원센터, ****강원대학교 생명공학연구소

Enhancement of Antioxidant Activities of Bark of Berberis koreana Palibin by Lactic Acid Fermentation

Ji Hye Ha

^*

, Myoung Hoon Jeong

^*,**

, Yong Chang Seo

^*,**

, Choi Woon Yong

^*,**

, Ji Seon Kim

^*,**

, Haeng Hoon Kim

^***

, Ju Hee Ahn

^*

and Hyeon Yong Lee

^*,**,****†

*

Department of Biomaterials Engineering, College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea.

**

Medical & Bio-materials Research Consortium, Kangwon National University, Chunchon, 200-701, Korea.

***

National Agrobiodiversity Center, NAAS, RDA, Suwon 441-853, Korea.

****

Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, ChunChon 200-701, Korea.

ABSTRACT : The bark of Berberis koreana Palibin was fermented by Bifidobacterium longum B6 and Lactobacillus para- casei at 37 ^℃ for 72 hour, then extracted by water solvent at 100 ^℃ for 180 min. Total pholyphenol and flavonoid contents were improved by fermentation process, compared to conventional water extraction. The barks of B. koreana Palibin extracts by B . longum B6 (FE-B.L.) and by L . paracasei (FE-L.P.) showed 17% and 16% cytotoxicity on human normal cell lines(HEK293) at 1.0 ^㎎ / ^㎖ of the highest concentration, respectively, which was about 3~5% lower than 20% from normal extracts (NE). DPPH radical scavenging activity of the FE-B.L. and FE-L.P. were about 73% and 75.9% higher than 56.8%

of NE. The highest inhibitory potency on xathine oxidase and superoxide dismutase (SOD)-like activities were also measured as 31.9% and 61.9% by adding FE-L.P. of 1.0 ^㎎ / ^㎖ . On tyrosinase inhibition test, the FE-L.P. showed highest activity as 75.9% at 1.0 ^㎎ / ^㎖ . Generally, FE-L.P. showed higher antioxidant activities as well as higher tyrosinase inhibition activity, possibly due to high contents of total pholyphenol and flavonoid. In general, fermentation of barks of B. koreana Palibin has relatively better biological activities than normal extracts. Specifically, the extracts fermented by L . paracasei showed higher activities than that from B . longum B6.

Key Words : Berberis koreana Palibin, Antioxidant Activity, Lactic Acid Bacteria, Tyrosinase Inhibition Activity

서 언

매자나무는 미나리아재비목 매자나무과의 낙엽관목으로 한 국 특산종 학명은 Berberis koreana Palibin 이다 . 오래전부터 소염 , 진통 , 호흡기질환 , 항암 , 항결액 및 항균 등의 목적으로 약용으로 한방에서 널리 사용되어 왔으며 (Yoo et al ., 1986),

뿌리와 줄기에서 높은 항산화 효과와 수피부에서의 항암 활성 이 보고되어 있다 (Jung et al . 2007; Jin et al ., 2008).

하지만 목질계 자원인 매자나무의 단단한 조직으로 인해 기 존의 추출 공법으로는 추출 수율이 낮아 유용 활성성분의 용 출 증대 및 활성 증진에 한계가 있었으며 이에 따라 본 연구 에서는 발효 공정을 통해 매자나무의 단단한 조직에 영향을

주어 추출 수율을 증대시킬 뿐만 아니라 활성 성분의 용출을 용이하게 함으로써 매자나무 발효물이 기능성 소재로 사용될 수 있음을 기대할 수 있다 (Jin et al ., 2009).

최근 발효식품의 생리활성 작용이 보고됨에 따라 probiotics ( 증생제 ) 을 이용한 발효물의 면역기능 강화 , 장기능 개선 , 생리 조절작용 , 새로운 항미생물질의 생성등과 관련된 여러 유익한 효능에 더욱 관심을 갖는 추세이다 .

일반적으로 probiotics ^{는 항생물질} (antibiotics) ^{에 대비되어}

사용되는 말로서 ‘ ^{숙주의 장내 균총의 능력을 개선시킴으로 숙}

주의 건강에 유익한 효과를 주는 살아 있는 미생물 ’ 이라 정의 되고 있으며 장내 균총의 균형을 유지시키는 생균제로 많이 이용되고 있다 (Fuller, 1989). Probiotics 의 구체적 기작은 밝

†

Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6455 (E-mail) [email protected]

Received 2010 June 28 / 1st Revised 2010 November 1 / 2nd Revised 2010 November 23 / Accepted 2010 December 7

혀지지 않았지만 비병원성이고 안전한 균주로 이들은 장내에 서 다른 병원성 미생물과 경쟁적 (competition for attachment sites), 영양소에 대한 경쟁적 (cpmpetition for limited nutrients), 그리고 저해 물질의 생성 (production of inhibitory

metabolites) 등의 기작에 의해 기능적 유용함이 보고되고 있다

(Dunham et al ., 1993; Kim et al ., 2004).

현재 probiotics ^{로 사용되고 있는 미생물은} Lactobacillus , Bifidobacterium , Lactococcus 와 같은 젖산균이 많으며 , Leuconostoc , Pediococcus , Bacillus , Propionibacterium 그리 고 효모 등은 주로 동물에 사용되고 있다 (Hoolihan, 2001).

Probiotics 젖산균은 정상적인 장관 및 비뇨생식기의 미생물 균

총 유지 , 유당불내증의 완화 , 혈중 콜레스테롤의 감소 , 항암작 용 , ^{면역 증강작용} , ^{식품의 영양학적 가치의 증진 등의 유익한}

효과와 혈중 콜레스테롤 상승방지 , ^{장암·방광암의 방지} , ^항

알러지 효과 등의 치료적인 효과를 가진다고 알려져 있다

(Cho et al ., 2009; Furrie 2005; Park and Kim, 1998;

Gibson and Roberfroid, 1995).

매자나무 추출물의 probiotics 에 의한 발효는 새로운 기능성

식품 소재의 개발에 여러 장점들을 제시한다 . Probiotics 를 이

용한 발효는 기존의 probiotics ^{의 장점뿐만 아니라 매자나무라}

는 새로운 기능성 소재의 탐색이라는 장점을 모두 이용할 수 있는 가능성이 있다 . 따라서 본 연구에서는 대표적인

probiotics 젖산균인 Bifidobacterium longum B6, Lactoba- cillus paracasei 균주를 이용하여 매자나무 수피부를 발효시킨 매자나무 발효물과 일반 매자나무 추출물의 추출 수율 및 유 용 생리활성을 평가하여 국내 수목자원인 매자나무의 기능성 식품 소재로서의 부가가치 창출에 기여하고자 하였다 .

재료 및 방법

1. 실험재료

본 실험에 사용한 매자나무는 경기도에 분포하는 한국 특산 종인 Berberis koreana 로서 2007 년 , 국립산림과학원 광릉시험 림으로부터 묘목을 지원받아 사용하였다 . ^{매자나무 시료는 수}

세하고 수피부를 분리하여 25~30 ^{℃ 조건 하에서 음건하고 분}

쇄하여 실험에 사용하였다 .

2. 균주, 세포주 및 생육 배지

유산균 발효 매자나무 수피 발효물을 제조하기 위하여

Bifidobacterium longum B6 KACC 20597 균주와 Lacto- bacillus paracasei KACC 12413 ^{균주를 농촌진흥청 농업유잔}

자원정보센터로부터 분양받아 사용하였으며 실험에 사용된 유 산균주의 배양 배지로는 MRS (Lactobacilli MRS, DifcoTM, Detroit, MI, USA) broth 에 L-cysteine·HCl 이 0.05% 첨가된

MRS broth 를 이용하였다 .

세포독성 실험은 인간 신장 세포인 HEK293 (Human

embryonic kidney cell, ATCC, USA) 를 37 ℃ , 5% CO

2

조 건하에서 10% heating inactivated FBS 를 포함한 RPMI1640

배지를 이용하여 4~5 세대 계대 배양 후 실험에 사용하였으

며 , 세포배양 시 사용되는 RPMI 1640 (Roswell park memorial institute medium) ^배지와 FBS (fetal bovine serum)

은 GIBCO (USA) ^{로부터 구입하였으며} , hepes buffer, genta- mycin sulfate, Trypsin-EDTA 는 SIGMA (USA) 에서 구입하 여 사용하였다 .

2. 매자나무 발효물 제조

매자나무 수피부 시료를 121 ℃에서 15 분간 autoclave 를 처 리하여 background bacteria ^{를 멸균하여 증류수를} 1 : 1 ^{로 혼합}

한 후 균질화 하였다 . ^{각 균주를} MRS ^{액체배지를 이용하여}

37 ℃에서 20 시간 동안 정치 배양하여 활성화한 후 전처리가

완료된 매자나무 시료에 고농도로 활성화된 균주를 10% 접종

한 후 37 ℃의 혐기적 조건하에서 72 시간 동안 발효시켰다 . 수 득한 매자나무 발효물을 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플 라스크에 시료 중량의 10 배수 증류수를 용매로 100 ℃에서 60

분 추출을 3 ^{회 반복하여 열수 추출을 시행하여 매자나무 발효}

추출물을 수득하였다 . ^{대조군으로 사용된 매자나무 수피 일반}

추출물은 발효 공정 없이 동일한 열수 추출 공정을 통해 수득 하였다 . 상기 공정에서 획득한 매자나무 수피 일반 추출물과 ,

발효 추출물은 각각 회전 감압 농축기 (Rotary vaccum eva- porator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan) 로 농축한 다음 동 결건조를 거쳐 용매를 완전히 제거한 파우더 상태의 추출물을 실험에 사용하였다 .

3. 총 폴리페놀 측정

총 폴리페놀의 함량은 Folin-Denis 방법에 의하여 비색정량 하여 측정하였다 . 추출물을 메탄올에 10 ㎎ / ㎖로 용해한 용액

1 ㎖과 Folin 시약을 1 ㎖을 혼합한 뒤 3 분간 정치하여 발색 시킨 후 1 ㎖의 10% Sodium carbonate 용액을 서서히 가하 였다 . 이 혼합액을 90 분간 정치한 후 Microplate reader 를 사 용하여 760 ^{㎚에서 흡광도를 측정하였다} . ^{총 폴리페놀 함량을}

측정하기 위해 Gallic acid (Sigma Chemical Co., USA) 를 사용하여 구한 검량선을 이용하여 당량으로 환산하여 시료 중 의 총 페놀 함량을 구하였다 (Cicco et al ., 2009).

4. 총 플라보노이드 측정

총 플라보노이드 함량은 Moreni ^{등의 방법} (Moreni et al ., 2000) ^{에 의해 측정하였다} . ^{각 시료} 0.5 ^㎖에 10% aluminum nitrate 0.1 ㎖ 및 1 M potassium acetate 0.1 ㎖ , ethanol 4.3

㎖를 가하여 혼합한 후 실온에서 40 분간 정치한 다음 UV-vis

spectrophotometer (852A Diode Array Spectrophotometer,

Hewlett Packard) 를 이용하여 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였 으며 Catechin (Sigma Chemical Co., USA) 을 이용하여 검 량선을 작성한 후 , 시료의 총 플라보노이드 함량은 100 ㎖ 중 의 ㎎ catechine equivalent 로 나타내었다 .

5. 정상세포 독성 측정

인간 신장 세포 HEK293 ^{를 이용하여} SRB (sulforhodamine B) assay(Doll and Peto, 1983) 를 통해 각각 공정을 통한 매 자나무 추출물의 세포독성을 측정하였다 . SRB assay 는 세포 의 단백질 염색을 통해 세포 증식 및 독성 정도를 평가하는 방법으로 실험에 앞서 상기 세포의 농도를 4~5 × 10

⁴

cells/ ㎖ 가 되도록 조절하여 96 well plate 의 각 well 에 100 ㎕ 씩 분주한 후 24 ^{시간 동안 배양} (37 ^℃ , 5% CO

²

incubator) ^하였

다 . ^{각각의 시료의 최종 농도를} 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ^㎎ / ^㎖

로 조절하여 각각 100 ㎕ 씩 첨가한 후 48 시간 배양하였다 .

상등액을 제거하고 4 ℃ , 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100 ㎕을 가하여 4 ℃에서 1 시간 동안 정치한 후 증류수 로 5 회 세척하여 TCA 를 제거하고 실온 건조하였다 . 건조된

plate 의 각 well 에 1% (v/v) acetic acid 로 녹인 0.4% (w/v) SRB ^용액을 100 ^{㎕ 씩 첨가하여 상온에서} 30 ^{분 동안 염색시}

킨 후 결합되지 않은 SRB ^{염색액 제거를 위해} 1% acetic

acid 로 4~5 회 세척한다 . 실온에서 완전히 건조한 후 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 ㎚에 서 microplate reader (Molecular Devices, USA) 를 이용하여 흡광도를 측정하여 정상세포에 대한 독성을 계산하였다 .

6. DPPH free radical 소거 활성 측정

항산화 활성 측정법 중의 하나인 DPPH ^{전자공여능 자유라}

디칼 소거 활성측정 방법을 통해 항산화 효과를 평가하였다

(Blois, 1958). DPPH 는 안정한 free radical 로서 이 홀전자로 인해 상자성 (Paramagnetism) 을 띄게 되며 전자나 hydrogen radical 을 받아들여 안정화시키기 쉽다 . 또한 그 홀전자 때문에

517 ㎚ 근처에서 강한 흡수가 일어나기 때문에 용액은 짙은

보라색을 띈다 . DPPH ( α , α -diphenyl- β -picrylhydrazyl) radical

에 대한 소거활성은 Blois ^{등의 방법을 약간 변형하여 실험하}

였다 . 용매를 ethanol 로 하여 제조한 0.1 mM DPPH 용액 1

㎖과 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖의 농도로 조절된 샘플을

0.5 ㎖ 혼합하여 25 ℃에서 20 분 동안 암실에 방치 한 후 525

㎚ 에서 흡광도를 측정하였다 . DPPH 라디칼 소거활성은 대조 구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 다음과 같이 계 산하였다 .

7. Xanthine oxidase 저해 활성

매자나무 시료의 항산화 활성 측정을 위해 xanthine

oxidase 저해활성 (Hyun et al ., 2007) 을 측정하였다 . 1 ㎎ / ㎖ 의 농도로 조절한 각 시료 1 ㎖에 40 mU 의 xanthine oxidase 0.1 ㎖ 및 0.07 M phospate buffer (pH 7.5) 2.9 ㎖를 가하여

25 ^℃에서 15 ^{분간 예열 시켰다} . ^여기에 0.15 mM xanthine 2

㎖를 가하고 , ^다시 30 ^{분간 반응시킨 후} 1 N HCl 1 ^{㎖를 가}

하여 반응을 정지시킨 후 290 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다 . Inhibition ratio of xanthine oxidase (%) = {1 ⁻ ( Sample O.D . / Control O.D. )} ^× 100

8. Superoxide(SOD) 유사활성

SOD 유사활성은 Marklund 의 방법 (Marklund and Marklund, 1975) 에 따라 과산화 수소 (H

2

O

2

) 로 전환 반응을 촉매하는

pyrogallol 의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었 다 . 즉 , 일정농도의 시료 0.2 ㎖에 pH 8.5 로 보정한 Tris-HCl buffer (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane + 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 ㎖와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ㎖을 첨가 하여 25 ℃에서 10 분간 반응시키고 1 N HCl 1 ㎖를 가하여 반응을 정지시켰다 . 반응액 중 산화된 pyrogallol 의 양은 420

㎚에서 UV spectrophotometer 를 사용하여 흡광도를 측정하였

으며 SOD 유사활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이

의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다 . SOD 유사활성 (%) =

A

^s

: ^{추출물 첨가구의 흡광도}

A

^c

: 추출물 무첨가구의 흡광도

단 , A

s

와 A

c

는 대조구의 흡광도를 제외한 수치 9. Tyrosinase 억제 효과

Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome 방법 (Hearing, 1987)

을 통해 측정하였다 . 150 ㎕ 의 mushroom tyrosinase (150 unit), 225 ^㎕의 2.5 mM L-tyrosine, 225 ^㎕의 0.4 M Hepes buffer (pH 6.8), 그리고 300 ㎕의 ethanol 용액 혹은 시료를 혼합한 후 , 배양 전과 배양 15 분 후 각각의 흡광도를 475 ㎚ 에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다 . Tyrosinase 의 억 제 정도는 다음과 같이 계산하였다 .

Tyrosinase inhibition (%) =

ODa (Optical density a) 와 ODb 는 각각 시료가 첨가된 용 액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이며 , ODc 와 ODd 는 각각

1 A_s A_c ---

⎝ ⎠⎛ ⎞

⎩ – ⎭

⎨ ⎬

⎧ ⎫

100

×

ODd ODc–

( )–(ODb ODa– ) ODd ODc–

( )

--- 100×

DPPH radical sacavening activity (%) =

control O.D control O.D. . − sample O.D. _× 100

시료를 넣지 않은 기준 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이 다 . 이들 tyrosinase 억제효과는 100 으로 나타날 때 완전한 억 제를 의미하며 , 0 일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미 한다 .

10. Scanning Electron Microscope(SEM) 관찰

추출수율 증진 및 활성의 증진 효과를 나타내는 추출물의 특성을 알아보고자 각 발효 공정 처리 후 매자나무 시료를 저 진공주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron, ×100,

×500) 으로 구조와 모양을 관찰하였다 . 각 매자나무 시료의 조

직을 수직 및 수평으로 절단하여 고진공증착기 (Polaron SC502 sputter coater) 에서 gold coating 한 후 저진공주사현미 경 (Hitachi Science Systems, S-3500N, Japan) ^{을 이용하여}

각각의 시료를 단면 확대하여 관찰하였다 (Kim et al ., 2006).

11. 통계처리

Microsoft excel 의 student t -test 에 의해 유의성을 검정하였 다 . 또한 각 실험 결과는 triplicate determinations 에 의한

Mean ± standard deviation (SD) 로 표시하였으며 , 각 평균치 간의 차이는 student t -test ^{에 의해} P < 0.001, P < 0.005, P <

0.01 ^{수준에서 유의성을 검정하였다} . 결과 및 고찰

1. 추출 수율

Bifidobacterium longum B6, Lactobacillus paracasei 균주 를 이용하여 매자나무 수피부를 발효시킨 매자나무 수피 발효 물 (FE-L.P., FE-B.L.) ^{과 매자나무 수피 일반 추출물} (NE) ^의

추출 수율을 비교하여 Table 1 에 나타냈다 . NE 의 추출 수율 은 5.21% 로 상대적으로 낮았으며 , 반면 FE-L.P. 와 FE-B.L. 은 각각 10.30%, 11.15% 로 일반 매자나무 추출물과 비교하여 2

배 이상 증가한 수율을 나타냈다 . 이는 발효 공정을 통해 목 질계 시료의 활성성분 용출에 걸림돌로 작용하였던 목질계의 단단한 조직을 분해 및 파괴함으로써 조직과 세포내의 활성 성분이 용출이 용이해졌기 때문으로 사료되며 , ^{추출수율 증진}

에 기여한 것으로 판단된다 . 또한 발효 미생물을 통해 2 차 대

사산물이 생성되면서 , 기존에 존재하지 않았던 유용 생리활성 성분의 생성이 가능할 것으로 기대된다 .

2. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2 차 대사 산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가지며 한 분자 내에

2 ^{개 이상의} phenolic hydroxyl ^{기를 가지고 있기 때문에 단백질}

등의 거대분자들과 결합하는 성질을 가지며 , 항산화 효과 등 의 생리활성 기능을 가지고 있다고 알려져 있다 (Lee et al ., 2008). 따라서 probiotics 균주로 발효된 매자나무의 생리활성 성분 함량 변화가 매자나무 발효물의 유용 생리활성 증대에 기초적인 요인이 될 수 있으므로 매자나무 일반 추출물과 발 효물의 총 폴리페놀 함량과 함께 총 플라보노이드 함량을 측 정하여 Table 2 ^{에 비교하였다} . B. longum B6 ^{를 이용한 매자}

나무 수피 발효물 (FE-B.L.) 과 L. paracasei 균주를 이용한

매자나무 수피 발효물 (FE-L.P.) 의 총 폴리페놀 함량은 각각

20.57 ㎎ /g, 22.13 ㎎ /g 으로 15.94 ㎎ /g 을 나타낸 일반 매자나 무 수피 일반 추출물 (NE) 의 함량 보다 약 30~40% 증가한 것을 확인할 수 있었다 . 총 플라보노이드 함량 또한 NE 가

5.86 ^㎎ /g ^{인 것과 비교하여} , FE-B.L ^이 8.63 ^㎎ /g, FE-L.P. ^이 9.83 ^㎎ /g ^{으로 약} 50~70% ^{증가하였다} . ^{매자나무 수피부의 총}

폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 유산균 발효 추출로 증가한

Table 1.

Extraction yields of the fermented extracts from bark of B. koreana Palibin.

Sample

^†

Fermentation Extraction Yield

(%, w/w)

Probiotics Temp Holding time

NE

−

100

℃

180 min 5.21±0.23

FE-L.P. Lactobacillus paracasei 100

℃

180 min 10.30±0.29

FE-B.L. Bifidobacterium longum B6 100

℃

180 min 11.15±0.22

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE-L.P. : fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE-B.L.:

fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by B. longum B6.

*

Results are expressed as mean±S.D. of data obtained from three independent experiments. Each value were compared with control at P < 0.05.

Table 2.

Comparison of total polyphenol and total flavonoid content in the fermented extracts from bark of B. koreana Palibin.

Contents

Sample

^†

Total phenolic

compounds (

㎎

/g) Total flavonoid compound (

㎎

/g)

NE 15.94±0.797 5.86±0.129

FE-L.P. 22.13±1.106 9.83±0.159

FE-B.L. 20.57±1.028 8.63±0.095

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE-L.P.:

fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE-

B.L.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by B. longum

B6.

*

Results are expressed as mean±S.D. of data obtained from three

independent experiments. Each value were compared with control at

P < 0.05.

것을 확인할 수 있었으며 , ^특히 L. paracasei ^{균주를 통한 매}

자나무 발효물의 활성 성분이 더 높은 것을 알 수 있었다 . 이 를 통해 probiotics 를 이용한 발효가 단단한 목질계 조직에 물 리적인 영향을 주어 생리활성 성분의 용출이 용이하였음을 추 측할 수 있으며 , 또한 미생물 대사를 통해 유용 생리활성물질 의 증가 또는 생성을 기대할 수 있다 .

3. 정상세포 독성

Probiotics 젖산균주로 발효시킨 매자나무 수피 발효물의 인

간 신장 세포 HEK293 을 이용한 정상세포에 대한 세포독성을

측정하여 그 결과를 Fig. 1 에 나타냈다 . 매자나무 수피 일반

추출물과 매자나무 발효물의 첨가로 인해 세포독성은 농도 의 존적으로 증가하는 경향을 나타내었다 . 최고농도인 1.0 ㎎ / ㎖ 에서 NE ^가 20.52% ^{의 세포독성을 나타낸 반면} , FE-B.L. ^은 17.39% ^{를 나타내었으며} FE-L.P. ^은 15.96% ^{를 나타내었다} . ^일반

추출물에 비하여 발효물의 세포독성이 약 3.1~4.6% 낮게 나 타났으며 , L. paracasei 균주를 이용한 매자나무 발효물이 더 낮은 독성을 나타내었다 . 이러한 결과를 통해 probiotics 젖산 균주를 통한 발효가 세포독성을 유발하는 성분을 분해 및 파 괴함으로써 매자나무 수피부의 세포독성을 저감시키는데 기여 한다는 것을 확인할 수 있으며 , ^{특정 균주가 그 효과를 더 증}

가시킬 수 있음을 알 수 있다 . ^{또한 상기 두 가지 매자나무}

수피 발효물 모두 최대 농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서 정상세포 생존

율을 80% 이상 유지시키는 것으로 확인된 바 , 이는 매자나무

수피 발효물이 인간 유래 정상세포에 대한 안정성을 유지한다 고 할 수 있다 .

4. DPPH free radical 소거 활성

생체 대사 활동에 의한 활성 산소의 과잉 생성은 인체의 효

소 , 단백질 및 DNA 등의 손상을 가져오고 유전자 손상에 의

한 암의 개시 및 촉진 단계에 작용하여 발암의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다 (Park and Kim, 1998). DPPH 전자 공여능 측정에 사용된 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)

은 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 free radical 로 전자나 수 소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 환원되는데

이러한 radical ^{을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은}

항산화 활성 및 활성산소를 비롯한 다른 radical 에 대한 소거 활성을 기대할 수 있다 . 이에 probiotics 젖산균주로 발효시킨

매자나무 수피 발효물의 DPPH radical 소거활성을 농도별로

측정하여 그 결과를 Fig. 2 에 나타내었다 .

NE 가 최고 농도 1.0 ㎎ / ㎖에서 56.8% 의 활성을 나타낸 것 과 비교하여 FE-B.L. ^은 73.0%, FE-L.P. ^는 75.9% ^{로 더 높은} DPPH ^{전자 공여능을 나타내었다} . DPPH radical ^{소거능을 보}

이는 물질 중 폴리페놀 성분과 같은 hydroxyl group 을 포함

하는 화합물이 DPPH radical 과 최적으로 반응한다는 연구 결

과 (Chen and Ho, 1997) 룰 미루어 보아 , probiotics 젖산균 을 이용한 발효 공정 중 매자나무 수피의 폴리페놀류와 플라 보노이드 화합물이 증가되어 항산화 활성에 기여한 것으로 사 료된다 .

5. SOD 유사활성 및 Xanthine oxidase 억제 활성

생채 내 활성 산소종은 산소에서 유래되며 안정한 분자상태 인 triplet oxygen (

³

O

2

) 이 자외선 , 방사선 , 화학적 반은 또는 대사과정을 통해 생성 된다 (Trush et al ., 1982). 이들 활성

Fig. 1.

Cytotoxicity of the fermented extracts from bark of koreana Palibin on human embryonic kidney cell, B.

HEK293.

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE- L.P.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE-B.L.: fermented extracts from bark of B.

koreana Palibin by B. longum B6.

*

Each value were compared with control at

^a

P < 0.001,

b

P < 0.005,

^c

P < 0.01 by student t-test. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown.

Fig. 2.

DPPH electron donating ability in adding the fermented extracts from bark of B. koreana Palibin.

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE- L.P.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE-B.L.: fermented extracts from bark of B.

koreana Palibin by B. longum B6.

*

Each value were compared with control at

^a

P < 0.001,

b

P < 0.005,

^c

P < 0.01 by student t-test. Mean values ±

SD from triplicate separated experiments are shown.

산소에 의한 지질과산화 결과 생성되는 지질과산화물 및 체내 과산화물은 세포에 대한 산화적 파괴로 인한 각종 기능장애를 야기하며 , 활성 산소종이 정상적으로 소거되지 않을 시 잔존 하는 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스를 받게 됨으로써 질병의 원인이 되기도 한다 (Harman, 1982). ^{생체 내 항산화}

효소 중의 하나인 superoxide dismutase 는 세포내 활성산소를 과산화산소로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소이며 , SOD 에 의해 생성된 과산화수소는 catalase 또는 peroxidase 에 의해 물분자와 산소분자로 전환되는 중요한 효소 중 하나이다 . NE (1.0 ㎎ / ㎖ ) 의 경우 20.27% 의 활성을 나타낸 반면 매자나무 발 효물인 FE-B.L. 과 FE-L.P. 는 각각 26.35% 와 31.90% 로 약

6~11% ^{활성이 증가한 것을 알 수 있다} (Table 3). ^이는 Chung 등 (Chung et al ., 1998) 의 연구에서 보고된 약용식물

60 여종의 평균 34.8% 와 유사한 수치로 매자나무 추출물이 항

산화 활성물질을 가지며 발효를 통해 활성물질의 용출이 증진 될 수 있을 것으로 사료된다 .

반면 , Xanthine oxidase 는 산소 분자를 수소 수용체로 이용

하므로 이를 저해하게 되면 free radical ^{의 생성이 억제되어}

항산화 , ^{항노화 등의 효과를 기대할 수 있다} . NE ^{의 경우} (1.0

㎎ / ㎖ ) 40.5% 의 억제 활성을 나타낸 반면 FE-B.L. 이 64.3%, FE-L.P. 가 61.9% 를 나타내었으며 , 양성대조군으로 사용한

Ascorbic acid (0.5 ㎎ / ㎖ ) 는 81.3% 의 활성을 나타내었다 . 마 찬가지로 매자나무 수피 발효물이 일반 추출물보다 약

22~24% 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다 .

상기 SOD 유사활성 및 xanthine oxidase 억제활성 측정 결과 , ^{매자나무 수피부의} probiotics ^{유산균을 이용한 발효를}

통해 항산화 활성이 추가적으로 증진되었음을 확인할 수 있 고 , 공통적으로 FE-L.P. 가 활성이 가장 높게 나타남으로서 균 주에 따른 매자나무 수피 발효물의 활성 증진 정도에 차이가 있는 것을 알 수 있다 .

6. Tyrosinase 저해 효과

Melanin 은 피부세포 내에서 tyrosinase 의 생합성 과정을 통 해 생성되어 자외선 노출 , 건조 , 극한 온도 등으로부터 피부 저항력을 높여주지만 , 과도한 멜라닌의 생성은 인체에 기미 ,

주근깨 , 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고 피부 노화를 촉진한다 . 따라서 천연물의 향장품 및 의약품 적용을 위해서 는 천연물 시료의 미백 또는 착색 효과에 대한 분석 또는 검 증이 매우 중요하다 . ^{따라서 매자나무 발효물 성분이 미백 또}

는 착색에 미치는 영향을 알아보고자 mealanin 생성의 대표적 기작으로 tyrosinase 효소의 작용 저해 활성을 측정하여 Fig.

3 에 나타냈다 . 매자나무 일반 추출물 및 발효물의 첨가를 통

해 농도의존적으로 억제 활성이 소폭 증가하는 경향을 나타내 었으며 , 매자나무 수피 발효물이 일반 추출물에 비해 약

8~10% ^{높은 억제 활성을 나타내었다} . ^{특히 최고 농도인}

1.0 ^㎎ / ^㎖에서 NE ^가 17.72% tyrosinase ^{억제 활성을 나타내었}

고 , 반면 FE-B.L. 가 25.83% 를 나타내었으며 , FE-L.P. 가

27.05% 로 가장 높은 억제 활성을 나타내었다 . FE-B.L. 보다

FE-L.P. 가 약 1.22% 의 근소한 차이를 나타내는 것을 미루어 보아 균주별 발효공정에 따른 활성 차이는 있는 것으로 알 수 있다 . 이러한 결과는 probiotics 균주를 발효를 통해 매자나무 수피 발효물이 미백 관련 기능성 향장제품으로 적용 가능함을 시사하는 결과로서 , tyrosinase ^{저해 활성은 폴리페놀 함량 및}

항산화 효과와 상관관계에 있다는 연구결과를 미루어보아 발 효를 통한 폴리페놀 성분의 함량 증가가 매자나무 발효물의 미 백 활성 증가에 기여한 것으로 사료 된다 (Lee et al ., 2006).

Table. 3.

SOD-like activity and xanthine oxidase inhibition activity in adding the fermented extracts (1.0

㎎

/

㎖

) from bark of B. koreana Palibin.

Contents

Sample

^†

SOD-like activity

(%) Xanthine oxidase inhibition activity (%)

NE 20.27 ± 2.025 40.51 ± 0.790

FE-L.P. 31.90 ± 2.971 61.94 ± 0.798 FE-B.L. 26.35 ± 2.830 64.38 ± 1.186 Ascorbic aicd 71.59 ± 2.078 81.33 ± 1.575

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE-L.P.:

fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE- B.L.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by B. longum B6.

*

Results are expressed as mean±S.D. of data obtained from three independent experiments. Each value were compared with control at P < 0.05.

Fig. 3.

Tyrosinase inhibition effects of the fermented extracts from bark of B. koreana Palibin against the in vitro melanin synthesis.

†

NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, FE- L.P.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L. paracasei, FE-B.L.: fermented extracts from bark of B.

koreana Palibin by B. longum B6.

*

Each value were compared with control at

^a

P < 0.001,

b

P < 0.005,

^c

P < 0.01 by student t-test. Mean values ±

SD from triplicate separated experiments are shown.

7. SEM (Sanning Electron Microscope)을 이용한 발효 대 사 후 매자나무 조직의 형태적 변화 관찰

B. longum B6 , L. paracasei 을 이용한 발효공정을 통해 매 자나무 시료 조직의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 저진공주 사현미경 (SEM, Sanning Electron Microscope) 을 이용하여 매자나무 수피 시료의 표면을 확대 관찰하였다 (Fig. 4). (A)

는 일반 열수 추출 후 촬영한 것으로 매자나무 수피의 조직 표면이 손상 없이 비교적 매끈한 형태를 유지하고 있음을 확 인할 수 있었다 . ^{반면 발효 공정을 처리한} (B), (C) ^{는 매자나}

무 수피 조직의 표면이 손상 및 변형 또는 파괴되어 (A) 와 비교하여 확연한 차이를 확인할 수 있었다 . 이와 같이 발효 공정을 통한 조직의 분해를 통해 유용물질의 용출량 증가를 통해 수율이 증가한 것으로 보이며 , 발효를 통한 성분 변화 및 새로운 유용 성분의 생성을 기대할 수 있을 것이라 사료된

다 . 또한 이러한 발효 공정이 매자나무 독성 물질의 파괴나 변성을 통해 독성 저감에도 영향을 미치는 것으로 보이며 독 성실험의 결과를 통해 유용 생리활성 증진 및 독성 저감에 높 은 효과가 있음을 본 연구의 실험을 통해 확인할 수 있었다 .

따라서 매자나무를 대상으로 발효공정을 통한 활성 증대 및 활성 성분의 증가에 대한 앞으로 구체적인 기작에 대한 연구 가 진행되어야 할 것으로 보인다 .

감사의 글

본 연구는 2010 년 교육과학기술부로부터 지원받아 수행된

연구임 ( 지역거점연구단육성사업 / 의료·바이오신소재융복합연 구사업단 ).

Fig. 4.

Morphology observation of fermented bark of B. koreana Palibin by SEM (Sanning Electron Microscope; left, ×100; right, ×500).

†

(A) NE: normal extracts from bark of B. koreana Palibin, (B) FE-L.P.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by L.

paracasei, (C) FE-B.L.: fermented extracts from bark of B. koreana Palibin by B. longum B6.

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