Characteristics of 'Baekseung', a new cultivar Flammulina velutipes

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J. Mushrooms 2017 March, 15(1):25-30 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2017.15.1.25 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853

© The Korean Society of Mushroom Science

*Corresponding author E-mail : [email protected]

Tel : +82-43-871-5710, Fax : +82-43-871-5702 Received February 15, 2017

Revised March 16, 2017 Accepted March 23, 2017

팽이버섯 신품종 ‘백승’의 특성

우성이^1,2 · 공원식¹ · 장갑열^1,*

1농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과

2강원대 응용생물학과

Characteristics of ’Baekseung’, a new cultivar Flammulina velutipes

Sung-I Woo^1,2, Won-Sik Kong¹, and Kab Yeul Jang^1,*

1Mushroom Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration Chungbuk Eumsung 369-873, Korea

2Department of Applied Biology Graduate School, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea

ABSTRACT: ‘Baekseung’, a new variety of Flammulina velutipes, was bred by mating two monokaryotic strains isolated from KMCC 4210 and KMCC 4216 in the Mushroom Research Division, Baekseung ARES in 2016. The Baekseung and Uri1ho strains showed fast mycelial growth and mycelial density on malt extract agar media after 7 days of incubation. The spawn running period on the sawdust substrate required a cultivation period and temperature of 30 days and 25^oC, respectively, for primordia formation where in fruiting body development occurred from 11±1 days at 14^oC and 14±1 days at 7^oC. The length of the pilei and stipes of the Baekseung harvested in optimal stag were 11.3±0.4 and 89.2±7.1 mm, respectively, whereas the values for Uri1ho were 10.7±1.0 and 91.3±20.8 mm, respectively. The yield of the Baekseung and Uri1ho strain grown on the sawdust substrate was 153.7±12.5 and 139.8±17.8 g, respectively, per 850 ml in bottle cultivation. The inferred tree exhibited a phylogenetic relationship between the Korean white fruiting body strains of Baekseung, Uri1ho and Fv-14-a-38, Fv-14-a-51, and the Japanese white fruiting body-forming strains of KMCC 4226, and these were confirmed to be genetically related.

KEYWORDS: Flammulina velutipes, Baekseung, Uri1ho

서 론

팽이버섯(Flammulina velutipes)은 Tricholomataceae family에 속하는 담자균류의 일종으로서 연중재배 및 대 량 생산이 가능하여 시기에 관계없이 항상 식용 가능하다 (Oh, 2010). 팽이버섯은 우리나라 대표적인 식용버섯 중

하나로 생산량은 37,554 톤으로 느타리, 큰느타리 다음으 로 팽이버섯 생산량이 많으며(2015, 특용작물생산실적) 소비도 많은 버섯이다. 또한 단일품목으로 수출량(16,441 M/T)이 가장 많은 효자종목이기도 하다(2015. 농수산물 무역정보). 또한 다양한 필수 아미노산을 함유하고 있을 (Crisan et al., 1978) 뿐만 아니라 항암효과 및 비타민 B, C가 풍부함이 알려지면서 소비자들에게 건강식품으로 각 광받고 있는 버섯이다. 팽이버섯은 약 1,200년전 A.D.

800년경 최초 인공재배가 시작되었다고 한다(Chang, 1993). 톱밥배지를 사용한 인공재배는 1928년 Morimoto 에 의해 시도되었으며(Edited, 1978), 산업의 발달과 함께 자동화 시설에서 계절에 관계없이 연중생산하고 있다. 따 라서 잡균의 오염을 줄이고, 배양실의 적절한 온습도 조 절, 환기관리 등 배양조건이 중요할 뿐만 아니라 활성이 좋은 품종의 육성이 버섯재배의 성공을 위해서 중요하다 (Oh, 2010). 또한 DNA의 분석 방법은 버섯의 품종구분으 로 DNA Finger Printing에서 특정부위를 증폭하는 기술 로 널리 알려진 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 것들인데, 그 중 하나는 RAPD(Random Amplified

Polymorphic DNA)를 사용하고 있다(Gherbawy et al., 2002). 최근 국내에서 육성된 백색품종이 보급되고 있어 일본 계통의 유연관계와 매우 가까우며(Kitamoto et al., 1993), 일본 백색 계통을 한국형 백색 품종으로 로 열티문제가 현안사항이 되고 있다(Kong et al., 2013).

또한 국내 유통 및 수출을 목적으로 사용하고 있는 팽 이 품종은 일본 품종에 의존하고 있다. 본 연구에서 일 본 품종을 대체할 수 있는 팽이버섯은 농촌진흥청에서 백색품종간 교배법을 사용하여 ‘백설’, ‘백로’ 등을 육성 한 바 있다(Kong et al., 2004). 팽이버섯 신품종을 교 잡 육성하였기에 이에 그 육성경위와 주요 특성을 보고 하고자 한다.

재료 및 방법

육성경위

농촌진흥청에서 보유중인 팽이버섯 백색 품종인 KMCC 4210과 KMCC 4216을 모균주로 사용하였다. KMCC 4210은 생육이 다발성이고 기존 재배조건에서 생육관리 가 용이하며, KMCC 4216은 새로운 국내 갈색계통과 국 내 육성품종간 교잡품종으로써 수량이 좋은 특성을 가지 고 있다. ‘백승’ 갓은 백색 반구형이며 대는 백색으로 굵 고 곧으며 길이는 중간으로 다발성이며 품질과 수량이 우 수하였다. 2014년부터 2016년 까지 걸쳐 우수한 이핵균 주를 선발하여 생산력 검정과 신품종 심의를 통해 2016년 도 ‘백승’ 으로 명명되었다(Fig. 1).

‘백승’은 균주의 활력을 찾기 위하여 4^oC 균주 보관실에 보관 중인 균을 감자한천 배지에 이식한 후 직경 3 cm이 상 자랐을 때 균총의 가장자리에서 직경 8 mm의 cork borer로 떼어 새로운 PDA(Potato Dextrose Agar)배지에 이식하였다. 버섯 균이 접종된 배지는 암상태의 25^oC 항 온기에서 7일간 배양 후 사용하였다.

단포자 분리 및 교배

팽이버섯 KMCC 4210과 KMCC 4216의 포자로 채취 하고 Raper(1966)의 방법대로 단핵균주를 육성하였다. 단포 자 분리는 증류수에 연속적으로 희석하여 MCM(Mushroom Complete Medium) 평판배지에 10^-4×10^-5로 희석하여 약 50µl를 도말한 후 25^oC, 3~6일간 배양하였다. 교잡은 각

단핵균사를 현미경 검정을 통해 꺽쇠연결체의 유무를 확 인하고 만연된 PDA조각을 1×1 cm로 잘라서 Petri dish의 중앙부분에 각각 1 cm 거리에 치상한 후 25^oC에 배양하 였다. 포자에서 30개의 단핵균주를 분리하여 그 중 KMCC 4210-27과 KMCC 4216-25을 대치부분과 수평 연장선을 따라 PDA배지 1/5를 반달모양으로 잘라내고 다시 2~3일 배양한 후 자란 균사를 현미경으로 관찰하여 꺽쇠연결체 의 형성여부를 관찰하였다. 꺽쇠연결체가 관찰되어 교잡 이 확인된 균사는 PDA 배지로 옮겨서 25^oC에 배양하 였다.

균사배양 및 생육특성

균사생장에 적합한 최적 온도를 규명하기 위하여 고압 살균기에서 121^oC로 20분간 살균한 PDA 배지를 직경 90 mm인 Petri dish에 20 ml를 분주하여 고화시킨 후 평 판배지에 접종원를 cork borer로 절취하여 접종하고 배양 온도가 각각 5, 10, 15, 20, 25, 30^oC로 조절된 항온기에 서 7일간 배양한 다음 균총의 직경을 조사하였다.

균사생장에 적합한 배지를 선발하고자 Yasumi 등 (1998)의 방법을 참고하여 YM(Yeast-Malt Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), MEA(Malt Extract Agar), MCM (Mushroom Complete Media) 배지를 조제한 후 이를 고 압살균기에서 121^oC로 20분간 살균하고 무균상 내에서 분주하여 식힌 후 각 균사체를 cork borer로 절취하여 배 지에 접종하였다. 접종한 각 배지는 25^oC의 항온기에서 7 일간 배양하면서 균사의 생장속도를 측정하여 균사배양 특성을 조사하였다(Table 1).

배양 및 생육조건은 Ryu(2005; 2007)등의 방법에 준하 여 실시하였으며, 균주의 자실체 특성조사를 위해 생육배 지는 850 ml 병재배를 실시 하였으며, 배지는 콘코브 35%, 미강 35%, 밀기울 10%, 비트펄프 13%, 면실피 4%, 패화

Fig. 1. Growth scene of new cultivar ‘Baekseung’.

Table 1. Composition of media used for mycelial growth of Flammulina velutipes

Medium ingredient Medium and Composition(g/1,000 ml)

YM* PDA MEA MCM

K2HPO4 1

KH₂PO₄ 0.46

MgSO4-7H2O 0.5

Glucose 10 20

Peptone 5 2

Malt extract 3 20

Yeast extract 3 2

PDA(Difco) 39

Agar 20 20 20

*YM; Yeast-Malt Agar, PDA; Potato Dextrose Agar, MEA; Malt Extract Agar, MCM; Mushroom Complete Medium.

석 3%(v/v)로 혼합하여 수분함량을 65%로 조절하였다.

배지 살균방법은 121^oC에서 90분간 고압살균하였고 냉각 실로 옮겨서 충분히 냉각시킨 후 무균상내에서 접종하여 온도 25^oC, 상대습도 65%, CO₂ 농도를 1,500ppm 이하로 맞춘 배양실에서 30일간 배양시켰다. 배양 후 종균과 균 긁기 작업을 한 후 발이를 유도하였다. 균긁기 이후 자실 체 발생 온도는 14^oC, 습도 93%로 조절하였으며, 버섯이 병 입구 위로 올라오면 권지를 씌운 후 수확까지 억제온 도는 4^oC, 자실체 온도는 7^oC로 유지하였다. 자실체의 형 태적 특징과 수량성을 조사하기 위하여 갓 크기가 1 cm 내외에서 수확하면서 농업과학기술 연구조사분석기준 (Rural Development Administration, 2012)에 따라 여러 가지 특 성을 조사하였다.

Genomic DNA분리

배양된 균사체를 동결건조 후 유발에 넣고 액체질소를 첨가하여 곱게 마쇄하였다. 마쇄된 균사체 200 mg에 lysis buffer 400µl를 넣고, vortexing 후 65^oC에서 10분 간 반응시켰다. 반응 후 동량의 chloroform 600 µl를 넣고 vortexing 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상 층액을 새로운 tube에 옮기고 흡착액 600 µl와 자성비드 40µl를 넣은 후 trapper의 자성비드에 DNA가 붙게 하였 다. 상등액을 취한 후 70% ethanol로 2회 세척하였다. 상 온에서 10분 동안 진공 건조시켜 50 µl의 DDW에 녹였다.

Trapper에 자성비드와 DNA가 녹아있는 액을 분리한 후 새로운 tube에 옮긴다. 흡광도 (O.D.)를 측정해서 template DNA농도를 조정하였다(Park et al., 2006).

RAPD에 의한 균주간 유연관계 분석

유연관계 분석은 UPF(Universal PCR Fingerprinting) Premix Kit에 genomic DNA 1 µl, primer 1 µl, DW 7 µl 를 첨가하였다. RAPD의 조건은 template predenaturation 은 94^oC에서 5분간, denaturation은 94^oC에서 1분간, annealing은 55^oC에서 1분간, extension은 72^oC에서 2분

간을 1 cycle로 하여, 총 35 clycle을 돌린 후 PCR산물을 1.5% agrose gel에서 전기영동 하였고 EtBr로 염색하여 UV illuminator 위에서 band를 확인하였다. UPF primer kit를 이용한 PCR의 다형성을 보이는 band를 하나의 형 질로 취급하여 band가 있으면 ‘1’, band가 없으면 ‘0’으로 구분하여 유연관계를 분석하였다. 분류학적 유연관계는 MEGA vesion 6 program의 neighbor-joining방법에 의해 분석하였다(Tamura K et al., 2013).

결과 및 고찰

신품종 ‘백승’의 주요특성

‘백승’ 팽이버섯의 균사배양 최적배양온도 25^oC에서 배양기간은 30일 정도 배양하였고 초발이는 종균접종 후 11±1일 소요되었으며, 생육일수는 14±1일 소요되었다.

자실체 발생 온도는 14^oC, 억제온도는 4^oC, 자실체 생육 온도는 7^oC로 기존품종의 버섯 생육온도와 동일하였다.

갓은 백색 반구형이며 대는 백색으로 굵고 곧으며 길이 는 중간으로 다발성이며 품질과 수량이 우수하였다 (Table 2).

균사배양 특성 검정

팽이버섯의 배양온도에 따른 균사생장 특성을 조사하기 위하여 균사생장 길이로 조사한 결과는 다음과 같다. 육 성된 품종 ‘백승’의 균사생장 적정온도는 25^oC가 가장 적 합하며 7일간 배양하여 균사생장을 보였다 (Table 3 and Fig. 2).

팽이버섯 균주에 대한 증식용 균사생장 최적배지를 선 발하기 위하여 PDA 등 4종류의 한천배지에 접종하여 25^oC 항온기에서 7일간 배양 후 균사생장 속도를 조사한 결과(Table 4) MEA(Malt Extract Agar) 배지에서 균사생 장 속도가 매우 빨랐으며, 그 외 배지에서는 균주간에 많 은 차이를 보이지 않았다. ‘백승’의 균사배양 적합배지 선 발 결과 MEA배지에서 균사생장 속도가 가장 빠른 것으 Table 2. Inherent characteristics of ‘Baekseung’

Variety Primordia formation temperature (^oC)

Growth temperature

(^oC) Shape of stipes Shape of pilei Color of fruiting body

‘Baekseung’ 14 7 Normal Hemi-spherical White

‘Uri1ho’

(Control) 14 7 Long Hemi-spherical White

Table 3. Mycelial growth of ‘Baekseung’ at the different temperature

Variety Mycelial growth (mm, 25^oC, 7days, PDA)

5^oC 10^oC 15^oC 20^oC 25^oC 30^oC

‘Baekseung’ 9.0±0.0 10.0±1.4 29.0±1.4 44.5±0.7 62.0±2.8 53.0±1.4

‘Uri1ho’

(Control) 9.0±0.0 22.5±0.7 30.5±2.1 60.5±0.7 81.0±1.4 62.5±0.7

로 나타났다(Fig. 3).

자실체 형태적 특성

‘백승’의 수확적기 자실체는 갓의 직경이 11.3±0.4 mm, 대의 길이가 89.2±7.1 mm이며 수량은 850ml 병당 153.7

±12.5g이었으며, ‘우리1호’ 수확적기의 자실체는 갓의 직 경이 10.7±1.0 mm, 대의 길이가 91.3±20.8 mm, 수량은 139.8±17.8g이었다(Table 5 and 6).

백승 자실체의 갓 색깔은 백색 반구형으로 순수한 백색, 대길이는 중간으로 다발성이며 품질이 우수하며, 대조 품 종에 비하여 수량이 양호하며 기존 재배조건에서 생육관 리가 용이하였다.

RAPD에 의한 다형성 검정

본 실험에서는 UPF primer를 이용하여 팽이버섯 균주 를 대상으로 PCR분석을 실시하였으며, primer에 따라 12 개 PCR다형성 band를 보였다(Fig. 4). ‘백승’의 모균주는

‘우리1호’; KMCC 4198, 일본품종; KMCC 4226이며, 선 발된 균주는 ‘백승’, Fv-14-a-33, Fv-14-a-38, Fv-14-a-51 로 band를 확인 할 수 있었다.

RAPD결과는 MEGA vesion 6 program의 neighbor- Fig. 2. Mycelial growth of Flammulina velutipes at different

temperature A; 5^oC, B; 10^oC, C; 15^oC, D; 20^oC, E; 25^oC, F;

30^oC

Table 4. Mycelial growth of ‘Baekseung’ at the different media

Variety Mycelial growth (mm, 25^oC, 7days)

YM PDA MEA MCM

‘Baekseung’ 67.0±1.4 68.0±0.0 75.0±7.1 66.0±5.7

‘Uri1ho’

(Control) 77.0±4.2 73.0±9.9 59.0±1.4 76.0±2.8

Table 5. A period for mycelial growth and fruiting in the bottle filled with sawdust (unit : days)

Variety Mycelial

growth

Primordia formation

From removing old spawn to harvest

Fresh weight (g/850 ml)

‘Baekseung’ 30 11±1 14±1 153.7±12.5

‘Uri1ho’

(Control) 30 11±1 14±1 139.8±17.8

Table 6. Morphological characteristics on fruiting body of ‘Baekseung’ in the bottle culture

Variety

The number of valid fruiting bodies

(ea/bottle)

Pileus Stipe

Diameter (mm)

Thickness (mm)

Length (mm)

Diameter (mm)

‘Baekseung’ 118.4±19.6 11.3±0.4 6.3±0.5 89.2±7.1 4.7±1.1

‘Uri1ho’

(Control) 118.3±7.6 10.7±1.0 5.8±0.4 91.3±20.8 4.7±0.3

Fig. 3. Mycelial growth of Flammulina velutipes at different media

joining방법에 따라 정리하여 작성한 결과 Fig. 5와 같다.

유전적 유연관계는 2개 그룹으로 나누어졌으며, 첫번째 군은 일본 품종인 KMCC 4226이고 두번째 군은 ‘우리1 호’, ‘백승’, Fv-14-a-38, Fv-14-a-51 균주로 분류되었다.

‘우리1호’와 같은 그룹으로 선발된 3균주는 국내 품종임 을 확인하였다.

적 요

팽이버섯의 다수성 신품종 개발을 위하여, 단포자 교잡에 의해 육성된 신품종 ‘백승’의 주요 특성은 다음과 같다. ‘백 승’의 원균배양 적정배지는 MEA(Malt Extract Agar) 배지 이며 균사생육 적정온도는 25^oC였다. 자실체 발생 적정온도 는 14^oC, 자실체 생육온도는 7^oC로 기존품종과 동일하였다.

초발이는 11±1일 소요되었으며 생육일수는 14±1일 이었다.

‘백승’ 수확적기의 자실체는 갓의 직경이 11.3±0.4 mm, 대의

길이가 89.2±7.1 mm이며 수량은 850 ml 병당 153.7±12.5g 이었으며, ‘우리1호’의 수확적기의 자실체는 갓의 직경이 10.7±1.0 mm, 대의 길이가 91.3 ±20.8 mm, 수량은 139.8±17.8 g 이었다. 갓은 백색 반구형이며 대는 백색으로 굵고 곧으며 길이는 중간으로 다발성이며 품질과 수량이 우수하였다. 유 전적 유연관계로 표현하기보다는 ‘백승’은 대조구와 다른 DNA 밴드 양상을 보였다.

감사의 글

본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호 PJ01016003) 에 의하여 수행된 결과의 일부이며 이에 감사 드립니다.

References

Chang ST. 1993. Mushroom biology: The impact on Fig. 4. PCR amplicon profiles from genomic DNA of Flammulina velutipes generated by primers UPF 1-12 M; Marker, 1;

Uri1ho (KMCC 4198), 2; KMCC 4226, 3; Baekseung (Fv-14-a-33), 4; Fv-14-a-38, 5; Fv-14-a-51. Read left to right.

Fig. 5. Dendrogram of Flammulina velutipes based on UPF analysis with tree random primers (Neighbor-Joining) 1; Uri1ho (KMCC 4198), 2; KMCC 4226, 3; Baekseung (Fv-14-a-33), 4; Fv-14-a-38, 5; Fv-14-a-51

mushroom productionand mushroom products. Mushroom biology and mushroom priducts. The chiness University Press, Hong Kong. 3-20.

Crisan EV. And Sands A. 1978. Nutritional value, In the biology and cultivation of edible mushroom. 145-150.

Edited by Chang ST and Hayes WA. 1978. The biology and cultivation of edible mushroom. Academic Press. 418.

Gherbawy YA, Farghaly RM. 2002. Mycoflora of Chicken- Viscera with Aid of RAPD Technique as a Tool for Confirmation. Mycobilogy. 30: 5-12.

Kitamoto YM, Nakamata Masuda P. 1993. Production of a novel white Flammulina velutipes by breeding. Genetics and Breeding of Edible Mushrooms. Gordon and Vreach Science Publishers. pp. 65-85.

Kong WS, Cho YH, Jhune Cs, Yoo YB, Kim KH. 2004.

Breeding of Flammulina velutipe Strains Adaptable to Elevated-temperature. Mycobiology. 32: 11-16.

Kong WS, Jang KY, Lee CY, Koo J, Shin PG, Jhune CS, Oh, YL, Yoo YB, Suh JS. 2013. Breeding progress and characterization of a Korean white variety ‘Baek-A’ in Flammulina velutipes. J Mushroom Sci Prod. 11:159-63.

Oh SI, Lee MS. 2010. Functional activities of ethanol extracts from Flammulina velutipes. Kor J Food Nutr. 23:

15-22.

Raper, JR. 1966. Genetics of Sexuality in Higher Fungi.

Roland Press, New York.

Park, JM, Kim GY. 2006. Comparison of RAPD, AFLP, and EF-1alpha Sequences for the Phylogenetic Analysis of Fusarium oxysporum and Its formae speciales in Korea.

Mycobiology. 34: 45-55.

Rural Development Adminstration. 2012. The agricultural science and technology, Standard of research and investigation.

Ryu, JS, Kim MK, Cho SH, Yun YC, Seo WM. And Lee HS. 2005. Optimal CO2 level for cultivation of Pleurotus eryngii. J Mushroom Sci Prod. 3:95-99.

Ryu, JS, Kim MK, Kwon JH, Cho SH, Kim NK, Rho CW, Rho HS. And Lee HS. 2007. The growth characteristics of Pleurotus eryngii. Kor J Mycol. 35: 47-53.

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S.

2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mil Biol Evol. 30: 2725-9.

Yasumi, A. 1998. Reutilization of culture wastes of Pleurotus ostreatus and Pholiota nameko for cultivation of Lyophyllum decastes. J Wood Sci. 44:417-420.