連翹 n-BuOH 분획물의 아토피 피부염 억제 효과
이진화․한재경․김윤희
대전대학교 한의과대학 소아과학교실
Received: July 22, 2016 ∙ Revised: August 13, 2016 ∙ Accepted: August 16, 2016 Corresponding Author: Kim Yun Hee
Korean medicine hospital of Daejeon university, 75, Daedeok-daero 176beon-gil, Seo-gu, Daejeon, Republic of Korea.
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Abstract
The Effects of Forsythiae Fructus n-BuOH Fraction on Atopic Dermatitis
Lee Jin Hwa․Han Jae Kyung․Kim Yun Hee Department of Pediatrics, College of Korean Medicine, Daejeon University Objectives
Previous studies have found out that Forsythiae Fructus (FF) extracts have anti-atopic activities by in vitro experiment. In order to understand more about FF extracts’ benefit, we subdivided FF extracts depending on systematic fractionation method by using Methylene chloride (MC), Ethyl acetate (EtOAc), n-BuOH and n-hexane (n-Hx). This study is designed to examine the effect of FF fractions on the PMA- ionomycin-induced activation of RBL-2H3 mast cell lines in vitro and on the DNCB-induced activation of NC/Nga mice in vivo.
Methods
For this study, we examined IL-4, IL-13 production by ELISA analysis, IL-4, IL-13, IL-31, IL-31RA and TNF-α mRNA expression by real-time PCR and manifestations of AP-1 and MAPKs transcription factors by western blotting in vitro. Through in vitro experiment, we selected FF n-BuOH fraction that seems the best effective in atopic dermatitis then induced it on NC/Nga mice by DNCB. We measured mice’s WBC, eosinophil and neutrophil in heart blood, IL-4, IL-5, IFN-γ in the spleenocyte culture supernatant, the absolute cell numbers of CD4+, CD8+, B220+CD23+, CD3+CD69+ and Gr-1+CD11b+ in the PBMCs, ALN and dorsal skin, IL-5, IL-13, IL-31, IL-31RA in the dorsal skin by real-time PCR and the distribution of immune cells by H&E on dorsal skin and ANL and toluidine blue staining on dorsal skin.
Results
FF n-BuOH fraction suppressed IL-4, IL-13 production and mRNA expression of IL-4, IL-13, IL-31, IL-31RA and TNF-α. Results from the western blot analysis showed that FF n-BuOH fraction reduced the activation of the mast cell specific transduction factors involved in AP-1 by suppressing JNK and ERK phosphorylation. In the gross, atopic dermatitis induced by DNCB in NC/Nga mice were improved by oral administration of FF n-BuOH fraction.
Oral FF n-BuOH fraction also decreased the level of IgE in mice’s serum and the level of IL-4 and IL-5 in the spleenocyte culture supernatant, cell numbers of CD8+, B220+CD23+ in the PBMCs, CD4+ in the ALN and CD4+, Gr-1+CD11b+ in the dorsal skin and suppressed mRNA expression of IL-5, IL-13, IL-31, IL-31RA in the dorsal skin. Histological examination showed that infiltration levels of immune cells in atopic dermatitis induced NC/Nga mice were improved by FF n-BuOH fraction.
Conclusions
FF n-BuOH fraction can reduce pruritus by suppressing IL-31, IL-31RA secretion and modulate molecular mediators and immune cells associated with atopic dermatitis induced in NC/Nga mice which may have played a significant role in recovering atopic dermatitis symptoms.
Key words : 連翹 (Forsythiae Fructus), n-BuOH fraction, RBL-2H3 mast cell, NC/Nga mice, Atopic dermatitis, DNCB, IL-31
ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), http://dx.doi.org/10.7778/jpkm.2016.30.3.001
Ⅰ. Introduction
아토피 피부염은 유 · 소아에 흔히 발생하는 소양감 과 전형적인 피부염증 반응을 주증상으로 하는 만성 재발성 피부 염증질환이다1). 아토피 피부염의 원인은 아직 정확하게 밝혀지지 않았으나2) IgE 합성과 호산구 증가와 함께 T세포 면역반응에서 Th1 반응에 비해 Th2 반응이 우세하여 발생된 불균형이 핵심적인 면역 학적 원인으로 보고되고 있다3-4). Th2 세포가 분비하는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNF-α 등의 일련의 사이토카인 중 IL-4와 IL-13은 B세포의 IgE 생성을 유 도하고, IL-5는 호산구의 분화와 성숙 및 분비에 관여 하여 즉시형 아토피 반응을 유발한다5-6). 또한 IL-4, IL-5, IL-13 등의 사이토카인은 염증반응을 확장시켜 Th2 세포 반응을 우세하게 만드는 양성 되먹임 작용을 일으킨다6-7).
아토피 피부염에서 발생하는 소양감은 수면을 방해 하기도 하며 부모와 소아를 힘들게 하는 가장 큰 원인 이 된다8-9). 최근 아토피 피부염의 소양감 발생에 IL-31 이 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀지며10), 아토피 피부염과 IL-31의 연관성에 대한 많은 연구가 시행되 고 있다11-3).
連翹는 淸熱과 消腫 작용이 뛰어나, 瘡瘍腫毒과 瘰 癧結核을 치료하는 것으로 알려져 있다14-5). 저자는 이 전 연구16)를 통해 連翹 (Forsythiae Fructus) 추출물이 in vitro에서 비만세포의 AP-1, NFAT, NF-κB의 신호전달 기전을 차단하여 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, GM-CSF, TNF-α, MIP-1α의 생성을 억제함으로 써 아토피 피부염 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인 하였다. 그러나 소양감에 핵심적인 IL-31에 대한 연구 가 부족하였으며, in vivo에서 실제 아토피 피부염 치료 효과가 있는지 확인하지 못한 아쉬움이 있었다.
또한 저자의 이전 연구16) 및 기존의 실험적 연구17-9) 는 連翹를 한, 두가지 용매를 이용하여 전성분을 추출 하는 방식을 이용하여 항염증 및 항산화 효과를 연구 한 것으로 유효성분을 고농도로 함유한 효과적인 아토 피 피부염 치료제 및 외용제 개발에는 한계가 있었다.
이에 저자는 본 연구에서 이전 연구의 한계를 보안하 고 아토피 피부염에 효과적인 유효성분만을 고농도로 추출하기 위하여 連翹의 에탄올 추출물을 유효성분 분 리를 위해 사용되는 계통적 분획법20-3)에 따라 methyl- ene chloride (MC), ethyl acetate (EA), n-BuOH, n-hexane (n-Hx), water를 용매로 이용하여 재추출하였다. 또한
아토피 피부염에 효과적인 連翹 분획물을 선정하기 위 하여 in vitro 실험으로 RBL-2H3 비만세포에서 세포독 성을 실험하여 독성이 없는 EA, n-BuOH, water 분획물 만 선별하여 ELISA를 통하여 IL-4, IL-13의 단백질 생 성량을 확인하였다. 다음으로 IL-4, IL-13의 억제 효과 가 있는 에탄올 추출물과 water, n-BuOH 분획물의 효 과를 real-time PCR로 IL-4, IL-13, IL-31, IL-31RA, TNF-α mRNA 유전자 발현을 통해 비교하고, western blot으로 c-jun, c-fos의 전사인자 발현 기전을 분석하여 아토피 피부염에 치료에 유효한 성분이 있을 것이라고 추측되는 분획물을 선정하였다. 이상의 in vitro 실험에 서 최종 선정된 連翹 n-BuOH 분획물의 in vivo 에서의 효과를 알아보기 위하여 DNCB로 아토피 피부염을 유 발시킨 NC/Nga 생쥐에서 혈액 중 백혈구, 호중구와 호 산구를 분석하였고, 혈청에서 IgE 수준을 관찰하였다.
또한 비장세포 분리 후 배양 상층액에서 IL-4, IL-5, IFN-γ 수준 및 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 와 axillary lymphe node (ALN), 등 피부조직에서의 CD4+, CD8+, B220+CD23+, CD3+CD69+, Gr-1+CD11b+
의 총 절대 세포수를 분석하였으며, 등 피부조직에서 real-time PCR로 IL-4, IL-13, IL-31, IL-31RA mRNA 유 전자 발현량을 확인하고, H&E 염색으로 등 피부조직 과 ANL의 염증, 세포 침윤 등을 관찰하였으며 tolui- dine blue 염색으로 비만세포의 침윤과 분포를 분석 하였다. 이에 連翹 n-BuOH 분획물의 아토피 피부염 억제효과에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바 이다.
Ⅱ. Materials and methods
1. 재료
1) 시약 및 기기 (1) 시약
본 실험에 사용된 시약 중 2-mercaptoethanol, L-glu- tamine, chloroform, isopropanol, ethanol, phenylmethyl- sulfonyl fluoride (PMSF)는 Sigma사 (U.S.A.), Tris-HCl, KCl, MgCl2, 적혈구 용혈액 (ACK lysis solution), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배양액, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), sodium dodecyl- sulfate (SDS), streptomycin은 Giboo사 (U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사
(U.S.A.), diethyl pyrocarbonate (DEPC)는 Invitrogen사 (U.S.A.), TRIzol은 Ambion사 (U.S.A.), anti-CD3-PE (phycoerythrin), anti-CD4-FITC (fluorescein isothiocyanate), T-stim은 BD Bioscience사 (U.S.A.), anti-CD3 mAb, anti-CD8-FITC, anti-B220-PE, anti-Gr-1-PE는 Pharmingen 사 (U.S.A.), IL-5 및 IFN-γ ELISA kit는 BioSource사 (U.S.A.), IL-4 (R4000) ELISA kit는 R&D system사 (U.S.A.), IL-13 (ab100766) ELISA kit는 bacam사 (U.K.), IgE ELISA kit는 Shibayagi사 (Japan), nuclear extract kit 는 Active motif사 (U.S.A.), moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT)은 Promega사 (U.S.A.) 제품을 사용하였다. 기타 일반 시약은 특급 시 약을 사용하였다.
(2) 기기
본 실험에서 분쇄기 FM-700SS는 한일전기사 (Korea), heating mantle MS-DM609/20L는 동서과학사 (Korea), rotary evaporator N-1200A는 EYELA사 (Japan), 여과지 는 Maidstone사 (England), freeze dryer PF-10/ALPHA 1-2LD는 CHRIST사 (Germany), autosampler, column oven, binary pump and DAD detector는 Agilent Technologies 사 (Germany), degasser는 Agilent Technologies사 (Japan), chemstation software와 quantitative real-time PCR은 Agilent Technologies사 (U.S.A.), Luna C18 column은 Phenomenex사 (U.S.A.), plate shaker는 Lab-Line사 (U.S.A.), ELISA reader는 Molecular devices사 (U.S.A.), Image-Rab densitometer는 Bio-Rad사 (U.S.A.), spectrop- hotometer는 Shimazue사 (Japan), homogenizer는 OMNI 사 (U.S.A.), cell strainer는 FALCON사 (U.S.A.), moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) 는 Promega사 (U.S.A.), 광학현미경은 Nikon사 (Japan) 제품을 사용하였다.
2) 세포주 및 실험 동물 (1) 세포주
RBL-2H3 mast cell line은 ATCC사 (U.S.A.) 제품을 구입하여 10% FBS, 10% T-stim, 0.05 mM 2-mercaptoe- thanol, 2 mM L-glutamine과 streptomycin 100 ㎍/㎖이 포함된 DMEM 배지에 1 × 105 cells/㎖ 농도로 맞추어 48 well plate에 분주하였다.
(2) 실험 동물
20～22 g의 7 주령의 NC/Nga 수컷 생쥐 (SLC, Inc.,
Japan)를 중앙실험동물에서 공급받아 실험 당일까지 물과 항생제 무첨가 고형사료 (삼양사료사, Korea)를 충분히 공급하고, 온도 22 ± 2 ℃와 습도 55 ± 15%, 12 시간 light-dark cycle의 환경을 유지하며 1 주간 적 응시켜 실험에 사용하였다. 그리고 동물실험에 대한 대전대학교 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)의 승인 (승인번호:
DJUARB2015-038)을 받았다.
2. 방법 1) In vitro
(1) 連翹 추출물 분리 및 분획
본 실험에서 사용한 連翹 (Forsythiae Fructus, FF)는 대전대학교 둔산한방병원에서 구입, 정선하여 사용하 였으며, 連翹 500 g을 분쇄기로 분쇄하여 heating man- tle에 넣고 45 ℃에서 70% 에탄올 (EtOH) 2 ℓ를 가하 여 60 분 간 추출한 후 다시 70% EtOH 2 ℓ를 가하여 같은 조건으로 60 분 동안 재탕하였다. 그 후 rotary evaporator를 이용하여 유기용매를 제거하는 농축과정 을 거치고, freeze dryer로 건조시켜 連翹 70% EtOH 추 출물 12.8 g을 얻었다. 이 12.8 g을 500 ㎖의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 Methylene Chloride (MC), Ethyl Acetate (EA), n-BuOH, n-Hexane (n-Hx), water로 각각 3 회씩 추출하여 분획한 후 감압 농축하여 MC층 3.49 g, EA층 1.12 g, n-BuOH 층 3.28 g, n-Hx층 0.25 g, water층 4.80 g을 획득하여 실험에 사용하였다 (Scheme 1).
(2) 세포 독성 측정
세포 독성은 MTT assay 법으로 측정하였다. 배양한 RBL-2H3 비만세포를 culture dish에 5 × 104 cells/㎖의 농도로 seeding하여 용기의 60∼70%가 채워질 때까지 배양하였다. 성장배지를 제거하고 FBS를 포함하지 않 는 유지배지에 MC층 분획물 (이하 FF_MC), EA층 분획 물 (이하 FF_EA), n-Hx층 분획물 (이하 FF_n-HX), n-BuOH층 분획물 (이하 FF_n-BuOH), water층 분획물 (이하 FF_water)을 각각 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 투여한 후 24 시간 배양하였다. 배지 를 제거하고 1 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 가하고 4 시 간 반응시킨 후, 배지를 제거하고 생성된 formazan양을 ELISA를 이용해 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 판정 하였다.
(3) ELISA 측정
RBL-2H3 비만세포를 96-well plate에 5 × 105 cells/
㎖로 1 ㎖씩 분주하여 24 시간 동안 배양한 뒤 PMA 50 ng/㎖와 ionomycin 0.5 μM (이하 PI)로 자극한 뒤 48 시간 동안 세포 배양한 것을 대조군으로 사용하였 다. 5층의 분획물 중 세포 독성 실험에서 세포 독성이 없다고 관찰된 FF_EA, FF_n-BuOH, FF_water를 각각 10, 50, 100 ㎍/㎖ 처리한 것을 실험군, cyclosporin A (이하 CsA) 10 ㎍/㎖를 처리한 양성대조군으로 하여 각 군을 1 시간 후에 PI로 자극한 뒤 48 시간 동안 세포 배양하여 상층액을 얻었다. IL-4와 IL-13 ELISA kit를 사용하여 코팅 antibody를 microwell에 100 ㎕씩 분주 한 뒤 4 ℃에서 16 시간을 유지한 후 wash buffer로 각 well을 세척하고 200 ㎕씩 assay diluent를 넣고 well을 막은 후 1 시간 동안 실온에서 배양한 뒤 다시 세척하 고 substrate solution을 만들어 각 well에 100 ㎕씩 넣고 30 분간 실온의 어두운 곳에서 배양한 다음 각 well에 stop solution을 50 ㎕씩 넣은 뒤 microplate spectropho- tometer에서 흡광도 450 ㎚로 측정하였다.
(4) Real-time PCR
① RNA 추출
RBL-2H3 비만세포를 24 well plate에 5 × 105 cells/
㎖로 1 ㎖씩 분주하여 24 시간 동안 배양한 다음 PI로 자극한 뒤 48 시간 동안 세포 배양한 것을 대조군으로, CsA 10 ㎍/㎖를 처리하고 1 시간 후에 PI로 자극한 뒤 6 시간 후에 세포를 얻은 것을 양성 대조군으로 하였 다. ELISA 실험에서 IL-4, IL-13 단백질 발현 억제 효과 가 유의하지 않은 FF_EA군은 제외하고 連翹의 전성분 추출물과 분획물과의 효과를 비교하기 위하여 70%
EtOH로 추출한 連翹 추출물 (이하 FF_70EtOH) 200
㎍/㎖, FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖, FF_water 100 ㎍/㎖으로 처리한 것을 실험군으로 사용하였다. 대조군, 양성 대 조군, 실험군의 세포에 TRIzol 시약 1 ㎖를 넣고 eppen- dorf tube에 넣은 후 chloroform 100 ㎕를 넣은 후 얼음 에 17 분 동안 둔 후에 15 분 동안 13,000 rpm으로 원 심분리하였다. 분리된 층에서 상청액을 eppendorf tube 에 옮겨 담고, 상청액과 동량의 isopropanol을 넣은 후 10 분 정도 얼음에 담가 두었다가 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리하였다. 원심 분리한 후 상청액을 버리고 80% 에탄올로 세척한 후 13,000 rpm으로 10 분 동안 원심 분리하여 다시 상청액을 제거한 것을 투 명해질 때까지 말린 후 최종 부피가 25 ㎕가 되도록 DEPC water를 넣어 녹였다.
② 역전사-중합효소 연쇄반응
역전사 반응은 total RNA 3 ㎍을 75 ℃에서 5 분 동안 변성시킨 후 10 mM dNTPs mix 2.5 ㎕와 random sequence hexanucleotides 1 ㎕ (25 pmole/25 ㎕)를 가하 고 RNA inhibitor로서 RNase inhibitor 1 ㎕ (20 U/㎕)와 100 mM DTT 1 ㎕, 5 × RT buffer 4.5 ㎕ (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 첨가 한 후, M-MLV RT 1 ㎕ (200 U/㎕)를 가하고 DEPC water를 넣어 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하고 이를 잘 섞은 뒤 5 초간 2,000 rpm에서 원심 침강하여 60 분 동안 37 ℃ 항온 수조에서 반응시켜서 first-strand cDNA를 합성한 후에, 5 분 동안 95 ℃에서 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 다음 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
③ cDNA PCR
Quantitative real-time RT-PCR은 7500 Fast real-time Scheme 1. Extraction and fractionation procedures of Forsythia Fructus
PCR system을 이용하여 수행하였으며, 사용된 probe와 oligonucleotide의 염기배열은 다음과 같다 (Table 1).
Rat GAPDH probe set; Endogenous Control (VIC®) (4352339E) 유전자의 발현은 TaqMan PCR Master mix (ABI)를 사용하고, internal standard로 GAPDH를 사용 했으며, primer의 최종농도가 200 nM이 되도록 반응시 켰다. Quantitative real-time PCR은 pre-denaturation을 50 ℃에서 2 분, 94 ℃에서 10 분, 그리고 40 cycles을 95 ℃에서 9 초, 60 ℃에서 1 분 조건에서 수행하였다.
대조군, 양성대조군, 실험군을 internal standard로 GAPDH를 사용하여 다음의 식으로 계산하여 RQ (relative quantitative) 값을 측정하였다.
y = x (1+e)n x: starting quantity y: yield
n: number of cycles e: efficiency
(4) Western blot
RBL-2H3 비만세포를 100 × 20 ㎜ plate에 4 × 105 cells/㎖로 10 ㎖씩 분주하고 24 시간 동안 배양한 후, 선행연구결과에서 IL-4, IL-13, IL-31, IL-31RA의 유전 자 발현 억제 효과가 뚜렷하지 않은 FF_water는 제외하 고 FF_70EtOH 200 ㎍/㎖과 FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 만 을 처리하여 1 시간 후에 PI로 자극한 뒤 1 시간 후에 차가운 PBS로 세척하여 scraper로 세포를 얻고 원심 분 리하여 상청액을 버렸다. Lysis buffer 100 ㎕ {RIPA buffer 98 ㎕ + PMSF (100 mM) 1 ㎕ + protease inhibitor cocktail (100×) 1 ㎕}로 15∼20 분간 얼음에서 배양한 뒤 상층액을 얻었다. Nuclear extract kit의 hypotonic
buffer를 가하고 얼음에서 15 분 동안 배양한 것을 원심 분리하여 상층액을 모았으며, tube에 남아 있는 핵에 complete lysis buffer를 가하고 얼음에서 30 초 동안 배 양한 뒤 원심분리하여 nuclear fraction을 얻어 BCA단백 질 정량법으로 정량하였다. 10% SDS page gel을 만들 어 running buffer를 채운 후 20 분간 pre-running시키고 그동안 단백질을 loading buffer로 희석한 후 5 분 동안 끓여 단백질이 꼬인 것을 풀어주었다. Gel의 첫 칸은 띄우고 두 번째 칸부터 단백질 마커를 넣고 그 다음 칸부터 샘플을 넣고 120 V로 내렸다. 다 내린 gel을 크 기에 맞게 자른 후 transfer buffer에 20 분 동안 담가 놓고, 그동안 band를 transfer할 blotting membrane을 gel 의 크기에 맞게 자른 다음, transfer buffer에 미리 담가 두었다. Tank transfer를 transfer buffer로 가득 채운 후 얼음을 넣고 1 시간 30 분 동안 150 V로 membrane으로 이동시킨 후 transfer한 membrane을 5% skin milk (TBS/T buffer)로 1 시간동안 blocking하였다. Primary antibody (β-actin, c-jun, c-fos, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38)로 4 ℃에서 하루 동안 반응시킨 후 다음날 secondary antibody를 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 암실에서 ECL detection 용액을 사용해 필 름에 옮겨 현상용액에 담근 후 현상하고 고정액에 고 정시켜 건조시켰다. 결과에 대한 band densities는 β -actin과 비교하여 Image-Rab densitometer로 최종 분석 하였다.
2) In vivo 실험
(1) 피부염 유발 및 시료처리
7 주령 된 NC/Nga 생쥐를 1 주일 동안 실험실 환경 에 적응시킨 후 NC/Nga 생쥐의 등 (귀 하단부에서부터
Target gene Primer Sequences
rat IL-4 Forward 5' GGATGTAACGACAGCCCTCT 3'
Reverse 5' GTGTTCCTTGTTGCCGTAAG 3'
rat IL-13 Forward 5' CAGTTGCAATGCCATCCACA 3'
Reverse 5' AGCCACATCCGAGGCCTTT 3'
rat IL-31 Forward 5' GCTGCTGTGCTGTGTAGGAG 3'
Reverse 5' CAGATGCCTCGGTTTTGTTA 3'
IL-31RA Forward 5' AGAATGTTCCAGATACAATGGAAA 3'
Reverse 5' CGAAGCATGCATACTAAAGGAA 3'
rat TNF-a Forward 5' TACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC 3'
Reverse 5' CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 3'
GAPDH Probe 5' CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG 3'
Table 1. Primer Sequence for Real-time PCR Analysis
꼬리 상단부) 부위의 털을 제거하고 24 시간 동안 방치 한 후 1%의 dinitrochlorobenzene (DNCB)가 들어 있는 200 ㎕의 아세톤 : 올리브오일 (3 : 1)을 제모한 부위에 도포한 후, 3 일 후 2 차로 도포하였다. 10 주령부터는 3 주간 1 주일에 3 회씩 150 ㎕의 0.4% DNCB 용액을 재차 도포하여 아토피 피부염을 유발시켰다 (Scheme 2).
(2) 약물처리 및 치료평가
In vitro 실험을 통해 連翹의 아토피 피부염 억제와 관련된 유효 성분이 있을 것이라 예상되는 FF_n-BuOH 이 In vivo 실험에서 동일한 결과를 보이는지 확인하기 위하여 7 주령 NC/Nga 생쥐를 15 주령까지 사육한 정 상군, 0.4% DNCB를 3 주 동안 도포한 대조군, DNCB를 도포하고 Dexamethasone (Dexa.) 3 ㎎/㎏을 경구 투여한 양성대조군 그리고 DNCB를 도포하고 FF_70EtOH 200 ㎎/㎏, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏을 투여한 실험군으 로 나누어 실험을 시행하였다.
양성 대조 약물인 Dexa 3 ㎎/㎏은 12 주령부터 15 주령까지 3 주 동안 매일 오전 11시에 1회 경구 투여하였으며, 실험 약물인 FF_70EtOH 200 ㎎/㎏과 FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏도 동일하게 12 주령부터 15 주 령까지 3 주 동안 매일 오전 11 시에 1 회 경구투여 하였다. 실험 종료 후 (15 주령)에 심장 및 retro-orbital venus plexus에서 채혈하고, 아토피 피부염이 발생한 등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아서 보관하였다.
(3) 백혈구, 호중구와 호산구 측정
최종 실험종료 후 30 ㎕의 heparin (20 IU)을 포함한 3 ㎖ sylinge 주사기로 0.8 ㎖의 심장 혈액을 채취하였 다. 전혈을 서울의과학연구소에 의뢰하여 자동 혈액 분석기로 혈액 중 백혈구, 호중구와 호산구의 총 세포 수를 측정하였다.
(4) 채혈 및 IgE 측정
약물 투여 전 (11 주령)과 실험 종료 후 (15 주령)에 NC/Nga 생쥐의 retro-orbital venus plexus에서 capillery tube를 이용하여 약 100 ㎕를 채혈하여 6,500 rpm에서 20 분간 원심분리하여 분리된 30 ㎕의 혈청을 -70 ℃에 서 냉동 보관하였다. ELISA로 NC/Nga 생쥐의 혈청 내 IgE 농도를 측정하였다. 각 well에 보관된 혈청 5 ㎕ (1/10 dilution)에 45 ㎕의 dilution buffer를 혼합하여 각 well에 분주한 후 2 시간 동안 25 ℃ 실온에서 방치하 고 2 회 완충용액으로 세척하였다. 그리고 biotin-con- jugated anti IgE를 넣고 2 시간 방치한 후 다시 2 회 수세하고, 완충용액으로 세척한 후에 100 ㎕의 Avidin-HRP conjugated antibody로 처리하고 1 시간 동 안 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 어두운 곳에서 30 분간 방치한 뒤 100 ㎕의 stop 용액을 처리하고 ELISA reader 450 ㎚에 서 흡광도를 측정하였다.
(5) 비장 세포 분리 및 사이토카인 측정
최종 실험을 종료하고 15 주령의 NC/Nga 생쥐에서 비장을 적출하여 100 mesh로 비장세포를 분리하였다.
전날 α-CD3 mAb 1 ㎍/㎖로 96 well plate에 코팅하여 4 ℃ 냉장고에 하루 밤 보관한 후 D-PBS로 2 회 수세하 였다. 분리한 비장세포는 ACK 용액을 사용하여 RBC 를 제거한 후 anti-CD3 0.5 ㎍/㎖ 로 코팅된 각각의 well 에 5 × 105 세포씩 분주하여 5% FBS-DMEM 배양액으 로 48 시간 동안 배양한 후 원심분리기에서 2,000 rpm 으로 3 분간 원심분리하여 200 ㎕의 배양 상층액을 얻 었다. 배양 상층액 내의 IL-4, IL-5와 IFN-γ의 수준은 ELISA로 측정하였다. 각 well에 배양상층액 50 ㎕를 분 주하여 2 시간 동안 25 ℃ 실온에 놓아둔 후 완충용액 으로 2 회 세척한 뒤에 antibody biotin-IgE conjugated 를 첨가하고 2 시간 동안 방치한 뒤 다시 2 차례 수세 후에 완충용액으로 세척한 후 antibody Avidin-HRP Scheme 2. Experimental design for the induction of atopic dermatitis skin lesions in NC/Nga mice
conjugated 100 ㎕를 처리하고 실온에서 1 시간 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 30 분간 어두운 곳에 놓아둔 후에 100 ㎕의 stop 용액 을 처리하고 ELISA reader 450 ㎚에서 흡광도를 측정하 였다.
(6) PBMCs, ALN 및 등 피부조직에서 형광 유세포 분석
최종 실험을 종료한 후 PBMCs은 NC/Nga 생쥐의 심 장에서 heparin을 포함한 3 ㎖ 주사기로 채혈한 뒤 ACK용액 10 ㎖ (8.3 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 1 ℓ dem- ineralized water + 0.1 mM EDTA)에 혼합하여 5 분 동 안 실온에서 처리하여 적혈구를 제거한 뒤 1% FBS가 함유된 PBS (FACS buffer)로 2 회 세척한 뒤 cell strainer 에 통과시켜 세포 외 불순물을 제거하여 얻었다. ALN 은 적출하여 세포를 100 mesh로 분리하여 D-PBS로 1,700 rpm으로 5 분 동안 원심분리하고 2 회 세척한 뒤 cell strainer에 통과시켜 세포 외 불순물을 제거하였 다. 등 피부조직은 잘게 chopping한 뒤 1 ㎎/㎖의 colla- genase를 첨가하고 37 ℃ shaker (180 rpm, 20 min)에서 배양하여 상층액을 얻는 방법을 4 회 반복하였다. 분리 한 ALN과 등 피부조직에서 침윤세포의 총 세포수를 측정하여 세포를 5 × 105 cells/㎖로 조정하였다. 조정한 ALN과 등 피부조직과 분리된 PBMCs을 4 ℃에서 면역 형광염색을 실시하였다. 각각에 anti-CD3-PE, anti- CD4-FITC, anti-CD8-FITC, anti-B220-PE 그리고 anti- Gr-1-PE를 넣고 얼음에서 30 분간 반응시킨 후 PBS로 3 회 이상 수세한 후 flow cytometry의 Cell Quest 프로 그램을 사용하여 CD4+, CD8+, B220+CD23+, CD3+CD69+
와 Gr-1+CD11b+ 세포수를 먼저 백분율 (%)로 분석한 후 ALN과 등 피부조직은 총 세포수를 적용시켜 각 조 직에서의 절대 세포수를 산출하였다.
(7) 등 피부조직에서 quantitative real-time PCR 분석
① NC/Nga 생쥐의 등 피부조직에서 RNA 분리 NC/Nga 생쥐의 등 피부조직을 검출하여 RNAzolB 500 ㎕를 넣은 뒤 homogenizer로 용해될 때까지 분쇄하 였다. 분쇄된 혼합부유액에 chloroform 50 ㎕를 첨가하 여 15 초간 혼합한 뒤 15 분간 얼음에 둔 후 13,000 rpm에서 원심분리하여 약 200 ㎕의 상층액을 회수하 였다. 이 상층액에 2-propanol 200 ㎕를 넣고 천천히 흔 들어 혼합하여 얼음에 15 분간 둔 후에 다시 13,000 rpm에서 원심분리한 뒤 80% EtOH로 수세하고 vaccum
pump에서 3 분간 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출 한 RNA는 DEPC 처리된 증류수 20 ㎕에 넣고 heating block 75 ℃에서 불활성화 시킨 뒤 first strand cDNA 합성에 사용하였다. Quantitative real-time PCR은 7500 real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다.
② 역전사-중합효소 연쇄반응
역전사 (reverse transcription) 반응은 total RNA 2 ㎍ 과 DNase I (10 U/㎕) 2 U/tube를 heating block 37 ℃에 서 30 분간 반응시킨 뒤 75 ℃에서 10 분간 변성시켰 다. 여기에 10 mM dNTPs mix 2.5 ㎕와 random se- quence hexanucleotides 1 ㎕ (25 pmole/25 ㎕)를 가한 후 RNA inhibitor로서 RNase inhibitor 1 ㎕ (20 U/㎕), 100 mM DTT 1 ㎕, 5 × RT buffer 4.5 ㎕ (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 첨가 한 후, M-MLV RT 1 ㎕ (200 U/㎕)를 다시 첨가하고 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 DEPC 처리된 증류수를 넣었다. 이 20 ㎕의 혼합액을 잘 섞은 후 5 초간 2,000 rpm에서 원심 침강하여 heating block 37 ℃에서 60 분 간 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 뒤 95 ℃에서 5 분간 방치하여 M-MLV RT가 불활성화 된 후에 합성 이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
③ Quantitative real-time RT-PCR
Quantitative real-time RT-PCR은 7500 real-time PCR system을 사용하였다. 사용된 mouse olionucleotid 의 염기배열은 아래의 표와 같다 (Table 2). Cytokine 유전자 발현은 SYBRⓇ Green PCR Master mix를 사용 하고 internal standard는 G3PDH로 TaqMan probe를 사 용하였으며, primer의 최종농도는 200 nM이 되도록 반응시켰다. Quantitative real-time PCR의 조건은 pre- denaturation은 50 ℃에서 2 분간, 94 ℃에서 10 분간, 그리고 40 cycles을 95 ℃에서 9 초, 60 ℃에서 1 분간 수행하는 것으로 설정하였다. 대조군, 양성대조군, 실 험군의 quantitative PCR은 internal standard로 G3PDH 를 사용하여 다음의 식으로 계산하여 RQ 값을 측정하 였다.
y = x (1+e)n x: starting quantity y: yield
n: number of cycles e: efficiency
(8) 등 피부, ALN 조직 채취 및 염색
등 피부 (등 쪽 목 부위)와 ALN 조직을 떼어내어 10% paraform-aldehyde에서 포르말린으로 24 시간 동안 고정하였다. 이 조직들을 파라핀으로 포매하고, 5 ㎛ 두께로 block을 만들었다. 등 쪽 목 부분은 염증을 일으키는 dermis, epidermis, keratinocytes, neutrophils, eosinophils, 이 외 다른 세포와 부종을 식별하는 H&E 염색을 시행하고 비만세포를 염색하는 toluidine blue 염색을 한차례 더 시행하여 광학현미경으로 (×200) 배 율로 관찰하였다. ALN 조직은 H&E 염색을 시행하여 광학현미경으로 (×100) 배율로 관찰하였다.
3. 통계 처리
각 실험군의 결과값을 unpaired student's T-test 통계 프로그램을 사용하여 처리하였으며, p<0.05 이하의 수 준에서 유의성 검정을 실시하였다 (*: p<0.05, **:
p<0.01, ***: p<0.001).
Ⅲ. Results
1. In vitro
1) 連翹 분획물의 세포독성 측정
FF 분획물에 세포독성을 확인한 결과 FF_n-BuOH 과 FF_water에서는 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다. FF_MC와 FF_n-Hx에서는 10, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 모든 농 도에서 세포독성이 나타났으며, FF_EA에서는 200, 400 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성이 나타났다 (Fig. 1).
이상에서 세포 독성이 나타나지 않은 FF_EA, FF_n-BuOH과 FF_water 100 ㎍/㎖이하의 농도로 향후 실험을 진행하였다.
2) ELISA analysis (1) IL-4 단백질 생성
IL-4 생산량은 정상군은 20.3 ± 0.47 ㎍/㎖였으며, PI 만으로 처리한 대조군은 8557.1 ± 789.4 ㎍/㎖로 정상 군에 비하여 증가하였으며, CsA 처리 뒤 PI로 자극한 양성대조군은 37.1 ± 6.21 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 유 의성 있게 억제되었다 (p<0.01). FF_EA 처리 후 PI로 자극한 실험군 10 ㎍/㎖는 9256.347 ± 93.34 ㎍/㎖, 50
㎍/㎖는 9047.993 ± 646.73 ㎍/㎖으로 대조군에 비하여 증가하였으며, 100 ㎍/㎖는 7287.433 ± 423.74 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 억제되었으나 모두 유의성은 없었다.
FF_n-BuOH 처리 후 PI로 자극한 실험군 10 ㎍/㎖는 6726.94 ± 155.51 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖는 5434.333 ± 802.83
㎍/㎖, 100 ㎍/㎖는 5291.647 ± 143.91 ㎍/㎖로 대조군 에 비하여 모두 유의성 있게 억제되었다 (p<0.05).
FF_water 처리 후 PI로 자극한 실험군 10 ㎍/㎖는 6323.62 ± 378.62 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖는 6133.753 ± 613.57
㎍/㎖, 100 ㎍/㎖는 5463.36 ± 157.92 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 억제되었다 (p<0.05) (Fig. 2).
(2) IL-13 단백질 생성
IL-13 생산량은 정상군은 146.7 ± 2.87 ㎍/㎖였으며, PI만으로 처리한 대조군은 3114.3 ± 439.9 ㎍/㎖로 정 상군에 비하여 증가하였으며, CsA 처리 뒤 PI로 자극 한 양성대조군은 176.8 ± 2.87 ㎍/㎖로 대조군에 비하 여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.01). FF_EA 처리 후
Gene Primer Sequences
IL-5 Forward 5' AGCCTAACCCTGTTGGAGGT 3'
Reverse 5' GTGATCGGCTTTTCTTGAGC 3'
IL-13 Forward 5' ATGCCCAACAAAGCAGAGAC 3'
Reverse 5' TGAGAGAACCAGGGAGCTGT 3'
IL-31 Forward 5' AAACAAGAGTCTCAGGATCTTTATAACAAC 3'
Reverse 5' ACGGCAGCTGTATTGATTCGT 3'
IL-31RA Forward 5' CCAGAAGCTGCCATGTCGAA 3'
Reverse 5' TCTCCAACTCGGTGTCCCAAC 3'
G3PDH Forward 5' TGAAGCAGGCATCTGAGGG 3'
Reverse 5' CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG 3'
Table 2. Primer Sequence (Mouse Oligonucleotide)
PI로 자극한 실험군 10 ㎍/㎖는 2286.467 ± 195.06 ㎍/
㎖, 50 ㎍/㎖는 2178.91 ± 86.80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖는 2088.727 ± 79.41 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 모두 유의 성 있게 억제되었다 (p<0.05). FF_n-BuOH 처리 후 PI 로 자극한 실험군 10 ㎍/㎖는 2087.003 ± 171.42 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖는 1767.567 ± 100.77 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖는
1545.59 ± 35.88 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 억제되었다 (p<0.05). FF_water 처리 후 PI로 자극 한 실험군 10 ㎍/㎖는 1912.233 ± 183.17 ㎍/㎖, 50 ㎍/
㎖는 1856.973 ± 50.53 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖는 1816.347
± 92.28 ㎍/㎖로 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 억 제되었다 (p<0.05) (Fig. 3).
Fig. 1. Effect of FF fractions on cell viability in RBL-2H3 cell line
RBL-2H3 cells were pre-treated with FF fractions extract (10, 50, 100, 200, 400 ㎍/ml) for 24 hrs. MTT assay was conducted to check the cytotoxic effect of RBL-2H3 cell line. Each bar graph signifies mean ± (SE) of at least three-independent experiments.
Fig. 2. Inhibitory effects of FF fractions on IL-4 production
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF fractions (10, 50, 100 ㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 24 hrs. IL-4 levels were analysed by a sandwich ELISA. Values were represented as means ± SE from three-independent experiments (* p<0.05, ** p<0.01).
3) real-time PCR analysis (1) IL-4, IL-13 mRNA 유전자 발현
IL-4 mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.0745 ± 0.052 이었고, 대조군은 0.9555 ± 0.045로 정상군에 비하여 유 전자 발현이 증가하였다. 양성대조군은 0.0255 ± 0.008 으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001).
FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-4 mRNA 유전자 발현은 0.785 ± 0.034 (p<0.01)이며, FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 0.519 ± 0.021 (p<0.001)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다. FF_water 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-4 mRNA 유전자 발현은 1.025 ± 0.495로 대조군에 비하여 상승하였으나 유의 성은 없었다 (Fig. 4A).
IL-13 mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.3565 ± 0.331이었고, 대조군은 0.952 ± 0.048로 정상군에 비하 여 유전자 발현이 증가하였다. 양성대조군은 0.085 ± 0.062으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-13 mRNA 유전자 발현은 0.5095 ± 0.171 (p<0.05), FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 0.365 ± 0.158 (p<0.01)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되 었다. FF_water 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-13 mRNA 유전자 발현은 0.796 ± 0.311로 대조군에 비하여 억제 되었으나 유의성은 없었다 (Fig. 4B).
(2) IL-31, IL-31RA mRNA 유전자 발현
IL-31 mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.36 ± 0.112 이었고, 대조군은 1.1025 ± 0.103로 정상군에 비하여 유전자 발현이 증가하였다. 양성대조군은 0.376 ± 0.061으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-31 mRNA 유전자 발현은 0.6215 ± 0.137 (p<0.01), FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 0.5305 ± 0.139 (p<0.001)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다. FF_water 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 I L-31 mRNA 유전자 발현은 1.0365 ± 0.172로 대조군 에 비하여 상승하였으나 유의성은 없었다 (Fig. 5A).
IL-31RA mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.0271 ± 0.022이었고, 대조군은 0.948 ± 0.052로 정상군에 비하 여 유전자 발현이 증가하였다. 양성대조군은 0.226 ± 0.211으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-31RA mRNA 유전자 발현은 0.6 ± 0.022 (p<0.001), FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 0.503 ± 0.013 (p<0.001)으로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제 되었다. FF_water 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군의 IL-31RA mRNA 유전자 발현은 0.807 ± 0.284로 대조군에 비하 여 억제되었으나 유의성은 없었다 (Fig. 5B).
Fig. 3. Inhibitory effects of FF fractions on IL-13 production
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF fractions (10, 50, 100 ㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 24 hrs. IL-13 levels were analysed by a sandwich ELISA. Values were represented as means ± SE from three-independent experiments (* p<0.05, ** p<0.01).
(3) TNF-α 유전자 발현
TNF-α mRNA 유전자 발현은 정상군은 0.8285 ± 0 .074이었고, 대조군은 1.1525 ± 0.153로 정상군에 비하 여 유전자 발현이 증가하였다. 양성대조군은 0.432 ± 0.050으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군의
TNF-α mRNA 유전자 발현은 0.678 ± 0.070 (p<0.01), FF_n-BuOH 200 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 0.542 ± 0.081 (p<0.01), FF_water 100 ㎍/㎖ 처리한 실험군은 1.7465
± 0.078 (p<0.05)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다 (Fig. 6).
Fig. 4. Inhibitory effects of FF extracts and FF fractions on IL-4 and IL-13 mRNA expression
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF_70EtOH extracts (200 ㎍/㎖), FF_n-BuOH layer (100 ㎍/㎖) and FF_water layer (100
㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 6 hrs. IL-4 (A) and IL-13 (B) mRNA synthesized by real-time PCR was measured. The amount of SYBR Green was analyzed at the end of each cycle. The cycle number at which the emission intensity of the sample towers above the baseline is named the RQ (relative quantitative). Real-time PCR was conducted in duplicate and measured by a Applied Biosystems 7500 real-time PCR system. Values were represented as means ± SE from two-independent experiments (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
Fig. 5. Inhibitory effects of FF extracts and FF fractions on IL-31 and IL-31RA mRNA expression
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF_70EtOH extracts (200 ㎍/㎖), FF_n-BuOH layer (100 ㎍/㎖) and FF_water layer (100
㎍/㎖) for 1 h, and stimulated with PI for 6 hrs. IL-31 (A) and IL-31RA (B) mRNA synthesized by real-time PCR were measured. The amount of SYBR Green was analyzed at the end of each cycle. The cycle number at which the emission intensity of the sample towers above the baseline is named the RQ (relative quantitative). Real-time PCR was conducted in duplicate and measured by a Applied Biosystems 7500 real-time PCR system. Values were represented as means ± SE from two-independent experiments (** p<0.01, *** p<0.001).
A B
A B
4) Western blot analysis (1) c-jun, c-fos 신호전달 기전
c-jun, c-fos의 단백질 발현은 β-actin을 기준으로 PI 만으로 자극한 대조군 (Fig. 7, c-jun band lane 2, c-fos band lane 2)이 정상군 (Fig. 7, c-jun band lane 1, c-fos band lane 1)에 비하여 densities가 증가하여 단백질 발 현이 증가되었다. FF_70EtOH 200 ㎍/㎖ 처리 후 PI 자 극한 실험군 (Fig. 7, c-jun band lane 3, c-fos band lane 3)이 대조군에 비하여 단백질 발현이 억제되었으며, FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖ 처리 후 PI 자극한 실험군 (Fig.
7, c-jun band lane 4, c-fos band lane 4)은 대조군에 비하 여 단백질 발현이 현저하게 억제되었다.
(2) JNK, ERK, p38 인산화 신호전달 기전 p-JNK, p-ERK, p-p38 단백질 발현을 JNK, ERK, p38 전사 인자와 각각 비교하여 분석하였다. PI만 자극 한 대조군 (Fig. 8, p-JNK band lane 2, p-ERK band lane 2, p-p38 band lane 2)이 정상군 (Fig. 8, p-JNK band lane 1, p-ERK band lane 1, p-p38 band lane 1)에 비하여 단백질 발현이 증가하였다.
p-JNK, p-ERK의 단백질 발현은 FF_70EtOH 200 ㎍ /㎖로 처리 후 PI로 자극한 실험군 (Fig. 8, p-JNK band lane 3, p-ERK band lane 3)이 대조군에 비하여 감소하 였으며, FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖로 처리 후 PI로 자극한 실험군 (Fig. 8, p-JNK band lane 4, p-ERK band lane Fig. 6. Inhibitory effects of FF extracts and FF fractions on TNF-αmRNA expression
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF_70EtOH extracts (200 ㎍/㎖), FF_n-BuOH layer (100 ㎍/㎖) and FF_water layer (100
㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 6 hrs. TNF-α mRNA synthesized by real-time PCR was measured. The amount of SYBR Green was analyzed at the end of each cycle. The cycle number at which the emission intensity of the sample towers above the baseline is named the RQ (relative quantitative). Real-time PCR was conducted in duplicate and measured by a Applied Biosystems 7500 real-time PCR system. Values were represented as means ± SE from two-independent experiments (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
Fig. 7. Effect of FF_70% EtOH extracts and FF_n-BuOH fractions on c-jun signal events in RBL-2H3 mast cell
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF_70EtOH extracts (200 ㎍/㎖) and FF_n-BuOH fractions (100 ㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 6 hrs. The nuclear fractions were gained by using nuclear extract kit and subjected to SDS-PAGE. The total nuclear fractions were electrophoresed and analyzed by Western blot using c-Jun, c-Fos and β-actin specific antibodies.
4)은 현저하게 감소하였다. 이를 통해 FF_n-BuOH이 FF_70EtOH 보다 p-JNK와 p-ERK의 신호기전에 의한 인산화 신호전달 기전을 더 강하게 억제하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 8).
p-p38 단백질 발현은 FF_70EtOH 200 ㎍/㎖로 처리 후 PI로 자극한 실험군 (Fig. 8, p-p38 band lane 3)과 FF_n-BuOH 100 ㎍/㎖로 처리 후 PI로 자극한 실험군 (Fig. 8, p-p38 band lane 4)은 모두 대조군과 비슷하였 다 (Fig. 8).
2. In vivo
1) DNCB를 이용한 아토피 피부염 유발 후 피부 변화 DNCB를 도포한 대조군에서 긁는 행동을 동반한 홍 반, 부종, 가피, 인설, 태선화 등의 증상이 확인되었다.
대조군에 비하여 Dexa 3 ㎎/㎏을 경구 투여한 양성대조 군의 피부 발진이 줄어들었으며, 실험군인 FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군과 FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군도 등 피부의 피부 병변이 감소하였다 (Fig. 9).
2) 혈액 중 백혈구, 호중구와 호산구 세포수 혈액 중 WBC 수는 정상군에서 1.38 × 103/㎖이며, 대조군에서 2.48 × 103/㎖로 정상군에 비하여 증가하였 고, Dexa 경구 투여한 양성대조군은 1.05 × 103/㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.01).
FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군은 1.51 × 103/㎖ (p<0.01) 이였으며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군은 1.24 × 103/
㎖ (p<0.01)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 하였다 (Fig. 10A).
Netrophils의 비율은 정상군에서 32.3%이고, 대조군 에서 25.2%로 정상군에 비하여 감소하였고, 양성대조 군에서 27.2%로 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였 으나 유의성은 없었다. FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군 에서 22.7%로 대조군에 비해서 감소하는 경향을 보였 으며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 32.5%로 대조 군에 비하여 증가하는 경향을 보였으나 모두 유의성은 없었다 (Fig. 10B).
Eosinophils의 비율은 정상군에서 3.29%이고, 대조 군에서 5.07%로 정상군에 비하여 증가하였고, 양성대 조군에서 2.6%로 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보 였으나 유의성은 없었다. FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여 군에서 3.07%, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 3.27%로 모두 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였 으나 유의성은 없었다 (Fig. 10B).
3) 혈청 IgE에 미치는 영향
혈청내 IgE의 수준은 정상군에서 248.94 pg/㎖이었 으며, 대조군에서 488.2 pg/㎖로 정상군에 비하여 증가 하였으며, 양성대조군에서 385.38 pg/㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었다 (p<0.01). FF_70EtOH Fig. 8. Effect of FF_70EtOH extracts and FF_n-BuOH fractions on phosphorylation of MAPKs in RBL-2H3 cells
RBL-2H3 cells were pretreated with CsA (10 ㎍/㎖) or FF_70EtOH extracts (200 ㎍/㎖) and FF_n-BuOH fractions (100 ㎍/㎖) for 1 h, and then stimulated with PI for 6 hrs. The nuclear fractions were gained by using nuclear extract kit and subjected to SDS-PAGE. The total nuclear fractions were electrophoresed and analyzed by Western blot using (A) p-JNK, JNK, (B) p-ERK, ERK, (C) p-p38, and p38 specific antibodies.
200 ㎎/㎏ 투여군에서 358.21 ㎎/㎖ (p<0.001), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 355.21 pg/㎖ (p<0.001)로 대조 군에 비하여 모두 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 11).
4) 비장세포 내의 IL-4, IL-5, IFN-γ 단백질 생성 비장세포 배양상층액내 IL-4 수준은 정상군에서는 58.32 pg/㎖였으며, 대조군에서는 132.020 pg/㎖로 Fig. 9. Topical application of FF_70EtOH extract and FF_n-BuOH fraction improved the clinical features of dermatitis in NC/Nga mice
Shown were dorsal skin of NC/Nga normal mice (NC/Nga-Nr), DNCB-induced atopic dermatitis mice (DNCB-Control), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 3 ㎎/㎏ dexamethasone (DNCB-Dexa.), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 100 ㎎/㎏
FF_n-BuOH (DNCB-FF_n-BuOH), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 200 ㎎/㎏ FF_70EtOH (DNCB-FF_ 70EtOH).
Symptoms were evaluated by skin dryness, eruption and wound on the back.
Fig. 10. WBC differential counts in atopic dermatitis NC/Nga mice induced by DNCB
Atopic dermatitis NC/Nga mice were induced by DNCB treatment in the dorsal skin, before the treatment of DNCB (normal, Nr), DNCB treatment for 3 weeks (DNCB-CT), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 3 ㎎/㎏ dexamethasone (DNCB-Dexa.), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 100 ㎎/㎏ FF_n-BuOH (DNCB-FF_n-BuOH), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 200 ㎎/㎏ FF_70EtOH (DNCB-FF_70EtOH). After NC/Nga mice were anesthetized with ether, immediately blood was gathered from the heart by syringes contained heparin. Cell contents were analyzed by hematology (BD, U.S.A.). Each point represents the mean ± S.E of three mice. Statistically value compared with DNCB-CT group data by T test (** p<0.01).
A B
정상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서는 50.4 pg/㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제하였다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 39.8 pg/㎖ (p<0.001), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 20.68 pg/㎖ (p<0.001)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제하였다 (Fig. 12A).
비장세포 배양상층액내 IL-5 생산량은 정상군에서 는 30.398 pg/㎖였으며, 대조군에서는 59.7 pg/㎖로 정 상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서는 27.3 pg/
㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제하였다 (p<0.01). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 30.5 pg/
㎖ (p<0.01), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 27.4 pg/㎖ (p<0.01)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 억제하였다 (Fig. 12B).
비장세포 배양상층액내의 IFN-γ 수준은 정상군에 서는 9.960 pg/㎖였으며, 대조군에서는 42.371 pg/㎖로 정상군에 비하여 증가했으며, 양성대조군에서는 82.904 pg/㎖로 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였 다 (p<0.05). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 86.4 pg/㎖으로 대조군에 비하여 증가하였으나 유의성은 없 었고, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 111.209 pg/
㎖로 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다 (p<0.01) (Fig. 12C).
5) PBMCs, ALN, 등 피부조직에서 형광 유세포 분석 (1) 총세포수 측정
등 피부 조직에서의 총세포수는 정상군에서 5.1 ± 0.63 × 105/1 g이며, 대조군에서는 10.2 ± 0.65 × 105/1 g으로 정상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서는 4.7 ± 0.65 × 105/1 g으로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여 군에서는 6.9 ± 0.96 × 105/1 g (p<0.01)이였으며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 6.0 ± 10.45 × 105/1 g (p<0.001)으로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감 소하였다 (Fig. 13A).
ALN에서의 총세포수는 정상군에서 4.5 ± 0.85 × 106, 대조군에서는 11.3 ± 0.43 × 106으로 정상군에 비 하여 증가하였고, 양성대조군에서는 4.8 ± 0.55 × 106 으로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 7.3 ± 0.19 × 106 (p<0.001)이였으며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏
투여군에서는 7.0 ± 1.23 × 106 (p<0.01)으로 모두 대조 군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 13B).
(2) 면역형광염색에 의한 cell contents 변화
① PBMCs에서 총 절대 세포수 변화
CD4+ Th 총 절대 세포수는 정상군에서 45.1 ± 3.35%이며, 대조군에서 24.1 ± 0.35%로 정상군에 비 Fig. 11. Serum IgE elevation or histamine release and development in atopic dermatitis NC/Nga mice induced by DNCB
Atopic dermatitis NC/Nga mice were induced by DNCB treatment in the dorsal skin, before the treatment of DNCB (normal, Nr), DNCB treatment for 3 weeks (DNCB-CT), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 3 ㎎/㎏ dexamethasone (DNCB-Dexa.), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 100 ㎎/㎏ FF_n-BuOH (DNCB-FF_n-BuOH), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 200 ㎎/㎏ FF_70EtOH (DNCB-FF_70EtOH).After NC/Nga mice were anesthetized with ether, immediately blood was gathered from the retro-orbital plexus by syringes contained heparin. Total IgE levels were analyzed by a sandwich ELISA using an ELISA kit (Shibayagi, Japan). Each point signified the mean ± S.E of three mice. Statistically value compared with DNCB-CT group data by T test (** p<0.01, *** p<0.001).
하여 감소하였고, 양성대조군에서 28.7 ± 1.15%로 대 조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다 (p<0.01). FF_7 0EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서 27.9 ± 4.76%로 대조군 에 비하여 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 없었으 며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 29.2 ± 1.81%
로 대조군에 비하여 유의성있게 증가하였다 (p<0.01) (Fig. 14B).
CD8+ c/s T 총 절대 세포수는 정상군에서 12.8 ± 0.60%이며, 대조군에서 18.7 ± 2.18%로 정상군에 비 하여 증가하였고, 양성대조군에서 10.3 ± 0.10%로 대 조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.01).
FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서 17.3 ± 2.24%로 대 조군에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 없
었으며, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 12.9 ± 0.35%로 대조군에 비하여 유의성있게 감소하였다 (p<0.01) (Fig. 14B).
B220+CD23+ 총 절대 세포수는 정상군에서 3.6 ± 1.34%이며, 대조군에서 20.8 ± 2.23%로 정상군에 비 하여 증가하였고, 양성대조군에서 10.5 ± 0.73%로 대 조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001).
FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 15.1 ± 1.71%
(p<0.05), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 11.2 ± 1.37% (p<0.01)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 14C).
Gr-1+CD11b+ 총 절대 세포수는 정상군에서 8.1 ± 0.10%이며, 대조군에서 40.8 ± 3.80%로 정상군에 비 Fig. 12. Culture supernatant IL-4, IL-5, IFN-γlevel in splenocytes in atopic dermatitis NC/Nga mice induced by DNCB
Atopic dermatitis NC/Nga mice were induced by DNCB treatment in the dorsal skin, before the treatment of DNCB (normal, Nr), DNCB treatment for 3 weeks (DNCB-CT), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 3 ㎎/㎏ dexamethasone (DNCB-Dexa.), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 100 ㎎/㎏ FF_n-BuOH (DNCB-FF_n-BuOH), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 200 ㎎/㎏ FF_70EtOH (DNCB-FF_70EtOH). Splenocytes from mice at 15 weeks of age were re-stimulated with anti-CD3 (0.5 ㎍/㎖) for 48 hrs. IL-4, IL-5, and IFN-γ release levels were analyzed by a sandwich ELISA using an mouse ELISA kit I (R&D system, Biosource, USA). Each point signified the mean ± S.E of three mice. Statistically value compared with DNCB-CT group data by T test (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
A B
C
하여 증가하였고, 양성대조군에서 21.5 ± 4.53%로 대 조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.01).
FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군 31.1 ± 3.24%으로 대조 군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며 (p<0.01), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 30.7 ± 5.90%으로 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다 (Fig. 14D).
② ALN에서 총 절대 세포수 변화
CD4+ Th 총 절대 세포수는 정상군에서 11.64 ± 4.68 × 105이며, 대조군에서 32.92 ± 2.34 × 105으로 정상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서 14.87 ± 3.19 × 105로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 18.78
± 3.52 × 105 (p<0.01), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군 에서 18.15 ± 6.78 × 105 (p<0.05)으로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig. 15B).
CD8+ c/s T 총 절대 세포수는 정상군에서 4.71 ± 2.62 × 105이며, 대조군에서 14.65 ± 4.77 × 105으로 정상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서 5.86 ± 1.01 × 105으로 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성 은 없었다. FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군 7.52 ± 2.12
× 105, FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서 7.46 ± 2.57
× 105으로 모두 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보 였으나 유의성은 없었다 (Fig. 15B).
CD3+CD69+ 총 절대 세포수는 정상군에서 3.31 ± 0.7 × 105이며, 대조군에서 44.78 ± 9.64 × 105으로 정 상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서 24.18 ± 11.7 × 105으로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였 다 (p<0.01). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군 19.86 ± 1.79 × 105으로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였 으며 (p<0.01), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 20.58 ± 10.42 × 105으로 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다 (Fig. 15C).
③ 등 피부조직에서 총 절대 세포수 변화 등 피부조직에서 CD4+ Th 총 절대 세포수는 정상 군에서 3.45 ± 1.95 × 104이며, 대조군에서 20.85 ± 2.47 × 104으로 정상군에 비하여 증가하였고, 양성대조 군에서 5.24 ± 2.45 × 104로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001). FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투 여군에서는 9.57 ± 2.21 × 104 (p<0.001), FF_n-BuOH 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 7.23 ± 1.27 × 104 (p<0.01)로 모두 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (Fig.
16B).
CD8+ c/s T 총 절대 세포수는 정상군에서 3.23 ± 1.68 × 104이며, 대조군에서 4.05 ± 0.15 × 104으로 정 상군에 비하여 증가하였고, 양성대조군에서 2.22 ± 1.15 × 104으로 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성 은 없었다. FF_70EtOH 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 6.88 Fig. 13. Total cell number dorsal skin and ALN in atopic dermatitis NC/Nga mice induced by DNCB
Atopic dermatitis NC/Nga mice were induced by DNCB treatment at the dorsal skin, before the treatment of DNCB (normal, Nr), DNCB treatment for 3 weeks (DNCB-CT), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 3 ㎎/㎏ dexamethasone (DNCB-Dexa.), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 100 ㎎/㎏ FF_n-BuOH (DNCB-FF_n-BuOH), DNCB treatment for 3 weeks with orally administration of 200 ㎎/㎏ FF_70EtOH (DNCB-FF_70EtOH). Total cell count was (A) in NC/Nga mice dorsal skin and (B) in NC/Nga mice ALN. Each point represents the mean ± S.E of three mice. Statistically value compared with DNCB-CT group data by T test (** p<0.01, *** p<0.001).
A B
