Effect of Esculetin from <i>Artemisia capillaris</i> on the Relaxation of Penile Corpus Cavernosum Smooth Muscle

DOI 10.17480/psk.2017.61.1.48

음경해면체 평활근의 이완에 대한 인진쑥으로부터 유래한 Esculetin의 효과

김 혜 경^#

전북대학교 의과대학 비뇨기학교실 경성대학교 약학대학

(Received December 22, 2016; Revised February 14, 2017; Accepted February 16, 2017)

Effect of Esculetin from Artemisia capillaris on the Relaxation of Penile Corpus Cavernosum Smooth Muscle

Hye Kyung Kim^#

Department of Urology, Medical school, Chonbuk National University, Jeonju 54896, Republic of Korea College of Pharmacy, Kyungsung University, Busan 48434, Republic of Korea

Abstract — The purpose of this study was to evaluate the relaxant effect and action mechanism of esculetin from Artemisia capillaris on penile corpus cavernosum smooth muscle (PCCSM). Esculetin (10^-7, 10^-6, 10^-5 and 10^-4 M) induced PCCSM relaxation in a concentration-dependent manner. The pretreatment with nitric oxide synthase inhibitor (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) and guanylate cyclase inhibitor (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one, ODQ) significantly blocked the relaxation. Esculetin significantly increased level of cGMP in perfusate and enhanced phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE5 Is)-induced relaxation in PCCSM. Esculetin relaxed the smooth muscle of rabbit penile corpus cavernosum by activating NO-cGMP signaling pathway and it may be an alternative medicine or supplement for improving erectile dysfunction in patients who do not completely respond to PDE5 Is.

Keywords Artemisia capillaris, esculetin, penile corpus cavernosum smooth muscle (PCCSM), phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE5 Is), NO-cGMP signaling pathway

발기부전(erectile dysfunction, ED)은 충분한 발기가 되지 않 거나 유지되지 않은 상태를 말한다.^1-3)메사추세츠 남성 고령화 연구(Massachusetts Male Aging Study)에서는 40세에서 70세 에 이르는 남성들 중 34.8%가 중등도 내지는 중증의 발기부전 을 나타내는 것으로 보고하였다. 17.2%인 경도의 발기부전도 포 함시킨다면 전반적인 발기부전 유병율은 52%가 된다.⁴⁾발기부 전의 원인들로는 고령, 흡연, 음주, 당뇨, 고혈압, 뇌혈관질환 등 이 될 수 있으며 약물들과 정신적인 스트레스나 우울증도 관련 있는 것으로 알려져 있다.⁵⁾발기부전의 유병율은 나이가 들어가

면서 증가하므로 전체 인구 중 고령자의 분포가 계속 늘어나는 것을 감안한다면 앞으로 발기부전 유병율이 점차 더 증가할 것 으로 생각된다.⁶⁾

음경 발기를 위한 음경해면체평활근의 이완은 비아드레날린성 비콜린성 신경전달물질과 해면체 내피세포에서 분비되는 이완물 질(endothelium derived relaxing factor, EDRF)에 의해 유발된 다.⁷⁾ 음경해면체평활근 이완의 매개체로 알려져 있는 nitric oxide(NO)는 대표적인 EDRF로 내피세포에서 생성된 NO가 평 활근 세포에서 cGMP를 증가시키면 세포외 Ca²⁺유입이 차단되 어 평활근 세포의 이완이 일어나게 된다.^8-9)

본 연구실에서는 우리나라에서 자생하며 식용 또는 약용으로 오랫동안 사용된 식물들을 위주로 음경해면체 평활근의 이완에 미치는 영향을 지속적으로 스크리닝한 결과 오미자, 복분자, 인 진쑥 등에서 효과를 확인할 수 있었으며 인진쑥의 경우 혈관이 완 효과에 대한 연구도 보고된 바¹⁰⁾인진쑥의 유효성분과 기전

#Corresponding Author Hye Kyung Kim

College of Pharmacy, Kyungsung University, 309 Suyeong-ro, Nam-gu, Busan 48434, Republic of Korea

Tel.: 051-663-4883 Fax.: 051-663-4809 E-mail: [email protected]

Short Report종설

에 대한 연구를 지속해 왔다. 인진쑥의 성분들 중 coumarin계열 의 scoparone이 음경해면체 평활근을 효과적으로 이완하였으므로 같은 계열의 esculetin에 대한 효능 평가와 그 기전에 대한 연구를 진행하였다. 인진쑥(Artemisia capillaris)은 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 식물로서 한국을 비롯하여 중국, 일본 등 아시아 및 유럽 등에 분포하며^11-12)급만성 간염, 황달, 지방간, 간경화 등 간기능 개선^13-16)및 항염, 항미생물, 항경련, 항산화 해열 효 과를 가지는 것으로 보고되고 있다.^17-19)성분으로는 정유, 방향족 oxycarbonic acid, esculetin, scopoletin, scoparone및 capillarisin 등이 알려져 있으며²⁰⁾ esculetin(6,7-dihydroxy coumarin)은 혈소 판응집, xanthine oxidase 활성억제, 유방암과 폐암의 억제효과가 있다고 보고되어지고 있다.^21-23)

본 연구에서는 인진쑥 성분인 esculetin이 토끼의 음경해면체 평활근의 이완에 미치는 영향과 발기에 관련된 그 기전을 규명 하고자 하였으며, 발기부전 치료를 위해 임상에서 사용되고 있 는 약물인 phosphodiesterase type 5 inhibitors(PDE5 Is)에 미 치는 영향에 대해서도 조사하였다.

실험 방법

시약

Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride(L-NAME), 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one(ODQ), L-phenylephrine(Phe) 및 dimethyl sulfoxide(DMSO)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Esculetin(Fig. 1)은 Wako Pure Chemical Industries(Osaka, Japan)에서 구입하였다. Sildenafil와 udenafil 은 Dong-A ST(Seoul, Korea)에서 제공받았고 mirodenafil은 SK Chemicals Life Science(Seoul, Korea)에서 제공받아 사용하였다.

시약들은 정제수에 녹여 사용하였으며 ODQ는 DMSO에 녹여 농축액으로 만든 후 물로 희석하여 사용하였고 esculetin은 10%

DMSO에 녹인 후 buffer액으로 희석하여 사용하였다.

음경해면체 조직 준비

체중 2.5~3.0 Kg의 New Zealand White종 수컷 토끼를 사용 하였으며, 토끼용 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일이 상 동일 조건하에 실험동물연구실 사육장에서 적응 시킨 후 사

용하였다. 본 동물실험은 전북대학교병원 동물실험윤리위원회의 승인 하에 실시되었고(cuh-IACUC-2016-12) 모든 동물실험 과정 은 전북대학교병원 실험동물운영위원회의 표준운영가이드라인에 따라 진행하였으며 실험동물의 고통을 최소화시키는 방법을 택하였 다. 50mg/kg ketamine과 25 mg/kg rumpun(xylazine hydrochloride, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)을 토끼의 귀 정맥에 주사하여 마취 시킨 후 복부를 절개하고 대동맥을 절단한 즉시 음경 전체를 골반 골로부터 분리하였다. 음경해명체 관류모형 실험은 요도를 포함 한 음경전체를 사용하였고 두개의 cannula(내경, 1.2 mm; 외경, 1.7 mm; Natsume, Tokyo, Japan)를 각각 음경각의 근위부에 매 몰한 후 고정하여 음경내로 관류액을 주입하고 귀두부분을 0.5 cm 정도 잘라내어 관류액이 유출되게 하였다. 관류액으로는 HEPES buffer(NaCl 118, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 25, glucose 10.0 mM, pH 7.4)를 사용하였다. 실험하는 동안 100%

산소를 투여 하였으며, organ bath의 온도는 37^oC를 유지하였다.

음경조직은 처음에 10 g을 기본 장력을 맞추었으며, 약 100분간 기다려 안정화가 된 후 실험을 하였다. 관류액은 음경각에 연결 된 각각의 관을 통해 0.5 ml/min으로 연속 주입하였다. 음경을 통과한 관류액은 음경의 귀두부를 부분적으로 절단한 곳으로 유 출되게 하였으며, 2시간 동안 음경해면체 관류모형에서 esculetin 을 관류시켜 절단된 귀두부에서 나오는 관류액을 받아 cyclic neucleotides의 측정에 이용하였다.

음경해면체평활근의 장력 측정

New Zealand White종 수컷 토끼로부터 얻은 음경에서 음경 해면체 조직은 주변의 백막을 분리하여 얻었으며 이때 해면체에 존재하는 내피의 손상을 막기 위해 조직을 무리하게 조작하지 않 도록 하였다. 분리된 해면체 평활 근에서 두개의 긴 조직절편 (1.5×1.5×7 mm)을 얻었고 조직을 고정하는 동안 내피 조직이 손 상되지 않도록 과도하게 잡아당기는 것을 피하였다. 각각 절편 은 6-0실을 이용하여 양쪽 끝을 고정 한 후 한쪽은 장력을 측정 하기 위한 변환기(FT03, Grass Telefactor; West Warwick, RI, USA)에 연결하였고, 다른 한쪽은 2 ml organ bath의 끝에 고정 하였다. organ bath내에는 HEPES buffer(NaCl 118, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 25, glucose 10.0 mM, pH 7.4)를 사용하였다. 해면체 조직은 처음에 1 g을 기본 장력을 맞 추었으며, 약 60분간 기다려 안정화가 된 후 실험을 하였고, 매 15분마다 산소가 포화된 관류용액으로 바꾸어 주었으며, 실험이 시작되기 전까지 기본 장력을 1 g이 되도록 다시 조정하였다. 장 력의 표현은 약물의 투여 시 발생하는 최고 수축점 또는 최저 이 완점을 기준으로 하였다. 10^-5 M Phe에 의한 수축을 100%로 정 하고 투여 시약에 대한 이완반응을 %로 비례표시 하였다. 약물 의 투여는 낮은 농도부터 높은 농도로 축적하는 방식으로 하였 으며, 최고의 이완점에 도달했을 때 다음 농도의 약물을 투여하 Fig. 1 − Chemical structure of esculetin from Artemisia capillaris.

였다. Esculetin(10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4 M)을 투여한 후 농도 별로 각 10분간 총 40분동안 장력의 변화를 측정하였다. NOS 차단제 인 L-NAME(10^-3 M)와 guanylate cyclase 차단제인 ODQ(10^-5 M)을 30분간 전 처리 후에 esculetin 이완반응을 측정하였다.

음경해면체 관류액 내 cGMP 측정

수집한 관류액 100 μl를 취하여 6% trichloroacetic acid 300 μl 에 첨가하여 15분간 incubation한 후 4^oC에서 5분간 원심분리하 였다. 분리된 상층액을 100 μl 수거하여 polypropylene tube에 옮 기고 물이 포화된 ether로 3번 추출한 다음 Speedvac concentrator 로 건조시켰다. 건조된 시료는 100 μl sodium acetate buffer로 다 시 용해 시킨 후 방사면역측정법으로 정량화하였다.²⁴⁾

Standard와 시료를 50 mM sodium acetate buffer(pH 4.8)가 들 어있는 시험관에 100 μl 넣고 acetic anhydride와 triethylamine(1:2) 의 혼합물 5 μl를 첨가하여 acetylation 반응을 시킨 후 anti-cGMP antiserum(Calbiochem-Novabiochem, CA, USA)과 iodinated 2’- O-monosuccinyl-guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate tyrosyl methyl Ester[125-I-ScGMP-TME, 10,000 counts/min(cpm) per 100μl]를 100 μl 첨가하여 4^oC에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 charcoal suspension을 첨가하여 4^oC에서 3,000 rpm로 15분 간 원심 분리한 뒤 bound form과 free form을 분리하여 gamma counter로 방사능을 측정하여 cGMP량을 정량화 하였다.

PDE Is와 esculetin의 상호작용

음경해면체평활근에서 sildenafil(10^-8 M), udenafil(10^-7 M) 및 mirodenafil(10^-8 M)의 영향을 알아보기 위해 30분간 전처리 한 후에 esculetin(10^-5 M)을 처리하여 이완반응을 측정하였다. 이

와 반대로, 음경해면체평활근에 esculetin을 30분 전처리 한 후 에 sildenafil, udenafil 및 mirodenafil을 처리하여 이완반응을 측 정하였다.

자료 분석 및 통계

Phe에 의한 수축을 100%로 정하고 esculetin에 대한 이완반 응을 %로 비례표시 하였다. 통계학적인 수식은 평균±표준편차 로 표시하였고, 각 실험의 반복횟수는 n 으로 표시하였다. 유의 성의 검증은 one-way analysis of variance(ANOVA), 사후분석으 로는 Bonferroni’s multiple comparison test를 이용하였다.

NOS 차단제와 guanylate cyclase 차단제 실험의 유의성 검증은 Student’s paired t-test를 이용하였고, P < 0.05일 경우 통계학적 유의성이 있다고 판단하였다.

실험 결과

음경해면체평활근에 대한 esculetin의 이완효과

본 연구에서는 음경해면체평활근의 이완에 대한 esculetin의 효과를 확인하고자 음경해면체조직에 대한 장력을 측정하였다.

Esculetin은 농도의존적으로 유의성 있게 음경해면체평활근을 이 완하였다(Fig. 2). Esculetin을 10^-7, 10^-6, 10^-5및 10^-4 M 농도로 처리하였을 때, 각각의 이완율은 8.60±2.93, 12.28±2.79, 20.36±3.22 및 53.52±1.05%를 기록하였다. L-NAME(10^-3 M)로 전 처리한 음경해면체 평활근에 esculetin을 적용해 본 결과 이 완율은 2.18±0.61, 4.74±0.72, 5.77±0.83 및 13.03±3.49%로서 10^-6, 10^-5및 10^-4 M 농도에서는 유의성 있게 감소되었다(Fig. 2a).

Esculetin(10^-7, 10^-6, 10^-5및 10^-4 M)에 의해 7.42±1.48, 15.25±

Fig. 2 − Effect of ODQ and NAME in PCCSM relaxtion induced by esculetin (n=6). The PCCSM contracted by Phe (10^-5 M) which was pre- incubated with Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME, 10^-3 M) (a) or 1H-[1,2,4]oxadiazolo [4,3-a]quinoxalin- 1-one (ODQ, 10^-5 M) (b) was treated with four concentrations of esculetin (10^-7, 10^-6, 10^-5 and 10^-4 M). The submaximal penile contractile responses induced by Phe were taken as the 100% values, and all subsequent responses to esculetin were expressed as a percentage of this value. Each point represents the mean±SD of the percentages. Statistical analysis was carried out by ANOVA followed by Bonferroni’s test (*P<0.05 vs esculetin, **P<0.01 vs esculetin).

2.63, 20.14±2.90 및 48.21±2.00%의 이완효과를 가진 음경해면체 평활근을 ODQ(10^-5 M)로 전 처리한 후 esculetin에 의해 유도된 이완율은 2.54±1.02, 3.10±0.94, 4.41±1.24 및 8.99± 1.79%로서 10^-6, 10^-5및 10^-4 M 농도에서는 유의성 있게 감소되었다(Fig. 2b).

음경해면체 관류액 내의 cGMP에 대한 esculetin의 효과 음경해면체 관류액에서의 cGMP 수치는 esculetin에 의해 농 도의존적으로 증가하였다. 10^-5과 10^-4 M에서는 cGMP 수치가 170.0±4.97과 170.3±7.32 fmol/ml로서 통계학적으로 유의성 있 게 증가함을 확인하였다(Fig. 3).

PDE Is의 이완효과에 대한 esculetin의 영향

10^-8 M의 sildenafil에 의해서는 11.41±1.53%의 음경해면체평 활근에 대한 이완율을 보였고 10^-5 M의 esculetin은 음경해면체 평활근을 11.51±2.51%로 이완시켰다. 그러나 sildenafil로 전 처 리한 음경해면체에서의 esculetin에 의한 이완 율은 22.09±3.27%

를 보였고 esculetin으로 전 처리한 경우 sildenafil의 이완율은 20.77±4.68%를 보임으로서 sildenafil 단독 처리 군에 비하여 유 의성 있게 증가하였다(Fig. 4).

Udenafil(10^-7 M)에 의한 음경해면체평활근 이완율은 10.87±

1.18%였고 반면 esculetin에 의해서는 11.25±1.51%의 이완효과를 보였다. Udenafil로 전 처리 시 esculetin의 이완율은 28.00±1.48%

였으며 esculetin으로 전 처리한 음경해면체 평활근에서는 udenafil 의 이완율은 25.91±0.77%로 나타났다. Esculetin은 udenafil의 이완효과를 유의성 있게 증가시켰다(Fig. 5).

Mirodenafil(10^-8 M)에 의해 유도되는 이완율은 6.76±1.54%였으 며 esculetin에 의한 이완율은 10.43±2.90%를 보였다. Mirodenafil

로 전 처리한 음경해면체 평활근에서의 esculetin의 이완율은 16.25±2.97%였으며 esculetin으로 전 처리한 경우 mirodenafil의 이완율은 21.71±1.94%였다. Esculetin은 mirodenafil의 단독 처리 시에 비하여 이완효과를 유의성 있게 3배이상 증가시켰다(Fig. 6).

Fig. 3 − Effect of esculetin (10^-7, 10^-6, 10^-5 and 10^-4 M) on cGMP level in perfusate (n=6). Each point represents the mean

±SD of the percentages. Statistical analysis was carried out by ANOVA followed by Bonferroni’s test (**P<0.01 vs control).

Fig. 4 − Interaction of esculetin (ESCU, 10^-5 M) with sildenafil (SILD, 10^-8 M) (n=6). SILD + ESCU means the relaxation induced by esculetin in sildenafil-preincubated PCCSM. ESCU + SILD means the relaxation induced by sildenafil in esculetin- preincubated PCCSM. Each point represents the mean±

SD of percentages of maximal relaxation of the preceding submaximal contractile responses. Statistical analysis was carried out by ANOVA followed by Bonferroni’s test (*P<0.05 vs SILD, **P<0.01 vs SILD).

Fig. 5 − Interaction of esculetin (ESCU, 10^-5 M) with udenafil (UDE, 10^-7 M) (n=6). UDE + ESCU means the relaxation induced by esculetin in udenafil-preincubated PCCSM. ESCU + SILD means the relaxation induce by udenafil in esculetin- preincubated PCCSM. Each point represents the mean±

SD of percentages of maximal relaxation of the preceding submaximal contractile responses. Statistical analysis was carried out by ANOVA followed by Bonferroni’s test (**P<0.01 vs UDE).

고 찰

발기를 위한 음경해면체평활근 이완의 매개체로 알려져 있는 nitric oxide(NO)는 대표적인 EDRF 중 하나로서^25-26)해면체 혈 관 내피세포에서는 endothelial nitric oxide stnthases(eNOS)에 의해 L-arginine으로부터 합성되는데, NO가 음경해면체 평활근 세포에 있는 guanylate cyclase를 활성화시키고 활성화된 guanylate cyclase가 평활근 세포 내의 guanosinetriphosphate(GTP)를 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)로 전환시키게 된다. 즉 해면 체 내피세포에서 생성된 NO가 평활근 세포에서 cGMP를 증가 시키면 proteinkinase G(PKG)가 활성되어 세포외 Ca²⁺유입이 차단되고 평활근 세포의 이완, 즉 발기가 일어나게 된다.^27-29)

본 연구진은 esculetin이 발기에 어떠한 영향을 미치는지 알아 보고자 토끼 음경해면체평활근을 이용하여 이완효과와 cGMP의 변화를 확인해 보았다. Esculetin은 음경해면체평활근에 대해 농 도 의존적으로 유의성 있게 이완효과를 보였고 관류시킨 액에서 cGMP도 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과 들은 esculetin이 발기에 유익한 효과를 보이며 이는 esculetin이 NO-cGMP신호전달 기전에 관련될 수 있다는 가능성을 보여 주 었다. 이에 내피세포의 NOS 차단제인 L-NAME와 평활근 세포 에서 guanylate cyclase 차단제인 ODQ를 처치한 뒤 수축 정도 를 측정한 결과, 전 처리하지 않은 군에 비하여 각각 유의성 있 게 이완이 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 esculetin의 발기 를 위한 음경해면체평활근 이완효과가 NO-cGMP신호전달를 활 성화하는 기전에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

최근 발기부전의 효과적인 치료제로는 음경 특이적인 PDE5 Is 인 sildenafil, udenafil, mirodenafil, vardenafil, tadalafil, avanafil 가 널리 사용되고 있으나³⁰⁾이들 약물들은 두통, 안면홍조, 소화 불량 등의 흔한 부작용과 더불어 코피, 어지러움, 복통, 안구충 혈을 유발하며 심혈관계 질병 발생 위험을 증가시킨다.³¹⁾또한 이들 약물들은 일시적으로 치료하는 목적만으로 사용되어지고 있으며 이들 약물에 반응하지 않는 환자도 40%나 되는 것으로 알려져 있다.³²⁾그러므로 부작용이 적고 안전성이 뛰어나며 기 존 치료제의 일회성 효과에서 벗어나 지속적 투여 용법이 가능 한 발기부전 치료제를 천연물로부터 찾으려는 노력들이 시도되 고 있다. 많은 약물들이 발기부전을 치료하기 위해 사용되고 있 지만, 기존 치료제에 효과를 보지 못하는 환자들을 위해 새로운 치료제나 대체할 수 있는 다른 약물들을 개발하고 그 기전에 대 해 연구하는 것은 여전히 의미 있는 연구라 할 수 있다.

본 연구에서는 esculetin이 PDE5 Is인 sildenafil, udenafil 및 mirodenafil에 의한 음경해면체평활근 이완에 미치는 영향을 확 인하고자 하였다. Esculetin은 sildenafil, udenafil 및 mirodenafil 에 의한 이완효과를 유의성 있게 증가시켰으며 특히 mirodenafil 에 의해 유도되는 음경해면체평활근의 이완효과를 3배이상 증가 시켰다. Esculetin은 병용 사용 시 PDE5 Is에 의해 유도되는 이 완효과를 더욱 증진시켰고 기존 치료제인 PDE5 Is에 효과를 보 지 못하는 발기 부전 환자들의 증상을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다.

결 론

본 연구를 통해서 인진쑥의 esculetin 성분이 음경해면체평활 근을 유의적으로 이완시키는 것과 PDE5 Is에 의한 이완을 유의 성 있게 증가시키는 것을 확인하였다. 관류액 내에서의 cGMP증 가와 L-NAME 및 ODQ에 의한 esculetin의 이완작용 차단은 esculetin이 NO-cGMP신호전달를 활성화시킴으로써 발기에 관 련하고 있음을 시사한다. 그러므로 esculetin은 발기부전을 치료 하기 위한 약물 개발을 위한 후보물질이 될 수 있으며 PDE5 Is 과 esculetin의 병용은 PDE5 Is에 반응하지 않는 발기부전 환자 들의 치료효과를 증진시킬 수 있을 거라는 가능성을 제시하였다.

감사의 말씀

이 논문은 2016학년도 경성대학교 학술연구비지원에 의하여 연구된 것으로 이에 감사 드립니다.

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Fig. 6 − Interaction of esculetin (ESCU, 10^-5 M) with mirodenafil (MIRO, 10^-8 M) (n=6). MIRO + ESCU means the relaxation induced by esculetin in mirodenafil- preincubated PCCSM.

ESCU + MIRO means the relaxation induced by mirodenafil in esculetin-preincubated PCCSM. Each point represents the mean±SD of percentages of maximal relaxation of the preceding submaximal contractile responses. Statistical analysis was carried out by ANOVA followed by Bonferroni’s test (**P<0.01 vs MIRO).

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