균 발효 두유의 산화적 스트레스 개선 효과 1

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70 책임저자：조은주, 󰂕 609-735, 부산시 금정구 장전동 산 30번지

부산대학교 생활환경대학 식품영양학과 및 노인생활환경연구소

Tel: 051-510-2837, Fax: 051-583-3648 E-mail: ejcho@pusan.ac.kr

접수일：2009년 2월 11일, 게재승인일：2009년 3월 4일

Correspondence to：Eun-Ju Cho

Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University

& Research Institute of Ecology for the Elderly, San 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea

Tel: ＋82-51-510-2837, Fax: ＋82-51-583-3648 E-mail: ejcho@pusan.ac.kr

Bacillus

균 발효 두유의 산화적 스트레스 개선 효과

1부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구소, ²(주)천호식품

최지명¹ㆍ배근호²ㆍ조은주¹

Protective Effect of Bacillus sp.-fermented Soymilks Against Oxidative Stress

Ji-Myung Choi¹, Keun-Ho Bae² and Eun-Ju Cho¹

1Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University & Research Institute of Ecology for the Elderly, Busan 609-735, ²Chunho Food, Busan 617-814, Korea

The purpose of this study is to develop the fermented soymilk (FSM) by Bacillus-sp. with antioxidative effect. Protective effect of FSM from oxidative stress was investigated under cellular system using LLC-PK1 renal epithelial cell. FSMs were prepared with 5 different Bacillus sp., three from K-chungkukjang which revealed the highest antioxidant activities in the previous study, and the other two from commercially available ones. Cell viability of the LLC-PK1 treated with 3-morpholinosydnonimine, sodium nitroprusside, or pyrogallol was dramatically decreased. However, FSMs recovered the cell viabilities significantly in a dose dependent manner, and in particular, FSM by Bacillus 2829 PNU-015 showed the greatest effect among FSMs. Present study suggests that soymilk fermented by Bacillus sp., especially FSM by Bacillus 2829 PNU-015, would elevate the antioxidative potential against oxidative damage induced by free radicals. (Cancer Prev Res 14, 70-76, 2009)

Key Words: Soymilk, Bacillus sp., LLC-PK1, 3-Morpholinosydnonimine, Sodium nitroprusside, Pyrogallol

서 론

인간을 비롯한 모든 생물은 산소를 이용하여 호흡을 하고 필요한 에너지를 발생시킨다. 이러한 과정에서 사 용된 산소 중 약 1% 정도는 불완전하게 환원되어 superoxide anion (O2󰠏

), hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (¹O2), hydroxyl radical (ㆍOH), peroxyl radical (ROOㆍ) 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하게 된 다.^1,2) 또한 최근에는 ROS와 함께 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 주목 받고 있다. RNS에는 nitric oxide (NOㆍ), nitrogen dioxide (NOOㆍ), peroxynitrite (ONOO^󰠏), alkyl peroxynitrites (LOONO) 등이 있으며, 특히 NO와 O2󰠏

과의 반응으로 생성되는 대사산물인 ONOO^󰠏는 전구체 보다 훨씬 강력한 반응성으로 광범위한 생체 분자의 산 화적 손상 및 mitochondria 손상을 야기시킨다.^3∼5) ROS, RNS와 같은 유리기의 과도한 생성은 생체 내 항 산화 방어 시스템과 유리기 생성계의 불균형을 유발하 여 산화적 스트레스를 증가시켜 세포의 항상성 상실을 가져옴으로써 노화를 비롯하여 암, 동맥경화증, 당뇨병 등 많은 질환들을 초래하는 것으로 여겨진다.^6∼9) ROS와 RNS에 의한 손상을 개선시키기 위한 항산화 방어 시스 템에는 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase, catalase 같은 생체 내의 활성산소 제거 효소에 의해 조절 되는 항산화시스템¹⁰⁾과 주로 음식을 통해 섭취하는 β- carotene, 비타민 C, 비타민 E 등의 비효소적인 항산화 시

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Fig. 1. The diagram of Bacillus sp.-fermented soymilk pre- 스템이 존재한다.^11,12) 최근 들어 산화적 스트레스가 다양

한 질환의 원인이 되고 있음이 밝혀져 이를 개선시킬 수 있는 항산화제에 대한 연구가 많은 관심을 끌고 있는데 특히 식품을 통해 섭취하는 천연 항산화제가 유해성은 적으면서 효과적인 것으로 여겨지고 있다.^13,14)

청국장은 콩으로부터 유래되고 발효과정 중에 생성되 는 각종 생리활성물질을 보유하여, 혈압 조절 작용,¹⁵⁾ 혈 중 콜레스테롤 저하능,¹⁶⁾ 항돌연변이성, 항암성,^17∼19) 항 산화성,²⁰⁾ 혈전 용해능,^21,22) 골다공증 예방 효과²³⁾ 등이 있다고 보고되었다. 이러한 청국장 발효에 중요한 역할 을 하는 Bacillus sp.는 장내에서 부패균의 활동을 억제하 여 부패균이 만드는 암모니아, 인돌, 아민 등 발암 촉진 물질을 감소시키며, 또한 Bacillus sp.가 생성하는 다당류 가 이러한 유해물질을 흡착하고 배설시키는 작용을 한 다.²⁴⁾ 이렇듯, 청국장의 건강기능성이 과학적으로 규명 됨에 따라 청국장 및 분말의 섭취가 늘어나고, 이를 유제 품에 첨가하여 섭취하는 경우가 늘어나고 있다. 현재 청 국장을 응용한 유제품은 주로 청국장 발효 분말 또는 관 련 원료들을 단순 첨가하는 수준으로, 청국장 특유의 냄 새를 해결하지 못해 관능적인 면에서 소비자를 만족시 키지 못한다. 이에 청국장의 발효에 주요 역할을 하는 Bacillus 균과 유가공식품을 접목한 Bacillus 균을 이용한 발 효유를 제조하여 청국장에서 얻을 수 있는 유효한 효과 를 얻을 수 있는 제품을 만들 수 있을 것이라 사료된다.

본 연구에서는 유음료 중에서도 청국장과 같이 콩으로 만든 음료인 두유에 Bacillus 균을 접종시켜 기능성이 우 수한 두유를 제조하여 cellular system에서의 산화적 스트 레스 개선효과를 검토하였다.

재료 및 방법 1. 원료 및 종균

선행 연구에서 순창 지역의 3가지 청국장의 in vitro와 cellular system에서 항산화 활성을 검토한 결과,^25,26) 가장 효과가 뛰어난 K 청국장에서 분리, 동정해 낸 Bacillus 2805 PNU-014, Bacillus 2829 PNU-015, Bacillus 2825 PNU- 016의 세 가지 균을 이용하였다. 그리고 이것과 활성을 비교하기 위해 공시균주로 Bacillus subtilis (KCCM 11316) 를 한국 미생물 보존 센터에서, Bacillus subtilis MYCO 10001을 MYCO에서 분양받아 사용하였다. 두유는 (주) 천호식품에서 제공받아 사용하였다.

2. 발효 두유 제조

glucose를 첨가하고 고온 고압 멸균기를 이용하여 121ôC 에서 15분간 멸균과정을 거친 후, 두유를 빠르게 식혀 37ôC 정도가 되었을 때 1%의 Bacillus 균(10⁷∼10⁸ CFU/ml) 을 접종시켜 37ôC로 설정된 shaking water bath에서 배양 시켰다. 선행연구의 결과, 37ôC에서 8시간 발효시켜 pH 5.5가 되었을 때 관능성이 가장 우수하였으며, 이 발효조 건에 따라 발효두유를 제조하였으며, 제조된 발효 두유 는 약한 청국장의 냄새를 띤 베이지색의 액상이었다.

3. 시료의 MeOH 추출물 제조

발효 두유는 동결 건조시킨 후 중량의 10배 methanol (MeOH)로 24시간 동안 추출하는 과정을 총 3번 반복한 후 회전식 진공 농축기를 이용하여 농축 시킨 후(수율:

약 20%), −80^oC의 냉동고에 보관하였다.

4. 원료 및 시약

LLC-PK1 (porcine renal epithelial cell)은 ATCC (Solon, Ohio, USA)에서, 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS)은 Invitrogen co.

(Grand Island, NY)에서 구입하여 사용하였다. 산화적 스 트레스를 유도하기 위해 사용한 sodium nitroprusside (SNP) 는 Wako (Tokyo, Japan)사 제품을, 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), pyrogallol, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- 2H tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma chemical co. (USA) 제품을 사용하였다.

5. 세포 배양

LLC-PK1 cell은 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 5%

의 FBS가 함유된 DMEM을 이용하여 37^oC, 5% CO2

incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 2∼3 회 refeeding하고 배양 6∼7일 경 phosphate buffered saline (PBS)으로 1차 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부

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Table 1. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.-fermented soymilk on viability of LLC-PK1 cells treated with SNP

Treatment (μg/ml) Cell viability (%)

SM FSM-1 FSM-2 FSM-3 FSM-4 FSM-5

100 500 1,000

42.1±5.7^b 43.8±2.4^ab 50.6±2.7^cd

47.4±4.9^a 48.5±2.7^bc 55.1±1.2^ab

48.2±2.7â 52.8±2.4â 55.9±3.2â

35.5±4.3^c 45.2±3.9^c 52.4±2.9^c

43.6±2.5^ab 49.5±1.7^ab 52.8±0.8^bc

44.6±2.7^ab 45.8±2.6^c 48.2±0.7^d

SNP-treated control 24.3±0.9

Normal 100.0±0.7

SM: soymilk, FSM-1: fermented soymilk by Bacillus subtilis 11316 from KCCM, FSM-2: fermented soymilk by Bacillus subtilis from Vilac, FSM-3: fermented soymilk by Bacillus subtilis 2805 PNU-014 from K chungkukjang, FSM-4: fermented soymilk by Bacillus subtilis 2829 PNU-015 from K chungkukjang, FSM-5: fermented soymilk by Bacillus subtilis 2825 PNU-016 from K chungkukjang.

Values are mean±SD.

a∼dMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.

착된 세포를 분리하여 원심분리해서 집적된 세포를 배 지에 넣고 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합 하여 6∼7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.

6. Cell viability 측정

세포가 confluence 상태가 되면 96-well plate에 well당 1×10⁴ cells/ml로 seeding하여 2시간 배양한 후 산화적 스 트레스를 유발하기 위하여 ONOO^󰠏, NO, O2󰠏

의 generator 인 SIN-1 (1 mM), SNP (1.2 mM) 및 pyrogallol (1.2 mM)을 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 산화적 스트레스 유 발 후, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 뒤 5 mg/ml의 MTT solution을 각 well에 주입하여 37^oC에서 4시 간 동안 재배양한 후 생성된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였 다.²⁷⁾

7. TBA-reactive substances (TBARS) 측정

TBARS 생성 정도는 세포가 confluence 상태가 되면 96- well plate에 well당 1×10⁴ cells/ml로 seeding하여 2시간 배 양한 후 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 ONOO^󰠏, NO, O2

󰠏의 generator인 SIN-1 (1 mM), SNP (1.2 mM) 및 pyrogallol (1.2 mM)을 각각 첨가하여 24시간 배양하였다.

산화적 스트레스 유발 후, 시료를 농도별로 처리하여 24 시간 배양한 뒤 상층액과 TBARS solution을 반응시켜, 95^oC 수욕 상에서 20분간 가열하였다. 4,000 rpm에서 30 분간 원심분리한 뒤 상등액의 흡광도를 532 nm에서 측정 하였다. 지질 과산화물(TBARS)은 malondialdehyde (MDA) 의 양으로 환산하여 계산하였다.²⁸⁾

8. 통계분석

대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균±

표준편차로 나타내었고, 각 실험 결과로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan's multiple test를 이 용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

LLC-PK1 cell을 포함한 renal proximal tubule cell은 free radicals에 매우 민감한 세포로 잘 알려져 있다. LLC-PK1

신장 상피 세포는 네프론에서 유도된 MDCK cell보다 산 화적 스트레스에 더 민감하며, 산화제에 의한 sodium- dependent glucose와 phosphate transport의 간섭으로 인해 ion gradient를 붕괴시키고 이로 인해 ATP 결핍과 Na^＋- K^＋-ATPase의 불활성화를 유도하며 세포 손상을 초래하 게 된다.²⁹⁾ 따라서 LLC-PK1 cell에 free radical을 처리하여 산화적 손상을 일으킨 후 이에 대한 개선 효과를 살펴봄 으로써 세포 손상에 보호 효과를 나타내는 물질을 확인 하는데 유용한 모델이 될 수 있다.³⁰⁾

Table 1은 LLC-PK1 cell에 SNP를 처리하여 NO에 의한 산화적 스트레스를 유발 시킨 후 세포 생존율에 미치는 효과를 검토한 결과이다. NO는 생체 내에서 L-arginine이 nitric oxide synthase의 작용으로 인해 citrulline과 함께 생 성된다. 생체 내에서 과량으로 생성된 NO는 생체 방어 와 활성산소에 의해 유발된 조직 손상에 기여한다. NO 에 의해 유발된 산화제들은 Mn SOD, ascorbate, gluta- thione과 urate 등과 같은 항산화 방어 기전을 소모시킬 수 있으며 주요한 지질과 단백질을 구조적으로 변화시

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Table 2. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.-fermented soymilk on viability of LLC-PK1 cells treated with pyrogallol

100 500 1,000

29.6±5.7â 32.3±2.4âbc 41.4±2.7â

25.2±5.1^ab 27.0±6.9^bc 28.4±3.2^c

19.7±2.8^b 25.2±5.8^c 26.9±1.5^c

24.7±3.4^ab 30.0±4.4^bc 33.4±4.8^b

27.3±5.7â 38.4±6.5â 41.2±2.3â

29.0±4.5^a 34.3±6.1^ab 36.4±2.4^b

Pyrogallol-treated control 17.4±0.4

Normal 100.0±0.7

Abbreviations for soymilk were shown in Table 1.

Fig. 2. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.- fermented soymilk on TBARS generation in SNP-treated LLC-PK1 cells. Abbreviations for soymilk were shown in Table 1. Values are mean±SD. ^a∼cMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.

킬 수 있다.^31,32)NO를 유발시키는데 이용되는 SNP만을 처리한 control군은 세포 생존율이 24.3%로 감소하여 산 화적 스트레스에 의한 세포 손상을 확인할 수 있었고, Bacillus 균 발효 두유를 처리한 결과 세포 생존율이 유의 적으로 증가하였다. 500μg/ml 농도에서 SM의 경우 세포 생존율은 43.8%를 나타내었으나, FSM의 경우 이보다 높 은 세포 생존율을 보였고, 특히 FSM-2와 FSM-4는 각각 52.8%와 49.5%의 세포 생존율을 나타내, 발효에 의해 세 포 생존율이 더 증가됨을 알 수 있다. SNP를 처리한 LLC-PK1 cell에 산화적 스트레스로 유발된 지질 과산화에 대한 발효 두유의 개선 효과를 살펴보면, MDA 수치에서 normal군은 0.023 nmole/mg protein인 반면 SNP 처리로 산

화적 스트레스를 유발시킨 control군은 0.063 nmole/mg protein으로 지질 과산화가 유의적으로 증가하였다(Fig.

2). SM을 1,000μg/ml 처리한 군에서는 MDA 수치가 0.062 nmole/mg protein으로 control 군과 비슷하였으나, FSM군에서는 지질 과산화를 유의적으로 억제하여 FSM-1 의 경우 0.050 nmole/mg protein (20% 감소), FSM-2의 경우 0.037 nmole/mg protein (41% 감소), FSM-3의 경우 0.036 nmole/mg protein (42% 감소), FSM-4의 경우 0.032 nmole/

mg protein (49% 감소), FSM-5의 경우 0.051 nmole/mg protein (19% 감소)로 지질 과산화를 감소시켰다. 특히 FSM-4를 처리한 경우 control군의 거의 절반 수준으로 지 질 과산화를 억제시킴을 확인할 수 있었다.

Pyrogallol은 O2󰠏

의 생성제이며 H2O2의 전구체이다. 생 체 조직 중에서의 O2󰠏

의 생성은 생체 내의 산화 환원 과 정 중 산소 분자가 전자 수용체로 관여하는 경우가 많으 며, 그 결과 활성산소의 생성이 가능하다 할 수 있다. 특 히 미토콘드리아는 진핵세포에 있어서 에너지 획득의 경로이며, 세포 내에서 산소의 소비가 가장 많은 과립이 기에 그것의 내막에 존재하는 전자 전달계에서 O2󰠏

를 생 성하게 된다고 한다.³³⁾ Table 2는 Bacillus 균 발효 두유의 O2󰠏

독성에 대한 세포 생존율을 나타낸 결과이다. Pyro- gallol만 처리한 군은 세포 생존율이 17.4%로 산화적 스 트레스에 의해 세포 생존율이 크게 감소했다. Pyrogallol 에 의해 유도된 독성에 대해 발효 두유의 MeOH 추출물 처리 시 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하였으며 특히 FSM-4가 41.2%의 세포 생존율로 우수한 효과를 나 타내었다. Pyrogallol로 O2󰠏

을 유발시켜 세포에 지질 과산 화를 유도한 뒤 지질 과산화 저하 효과를 살펴본 결과 (Fig. 3), normal군의 경우 0.023 nmole/mg protein, control군 은 0.050 nmole/mg protein으로 normal군에 대해 control군

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Table 3. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.-fermented soymilk on viability of LLC-PK1 cells treated with SIN-1

100 500 1,000

94.7±5.4^b 107.2±2.4^ab 111.8±2.7^a

71.5±2.6^a 104.5±2.7^bc 116.1±1.2^bc

96.8±1.9^a 96.8±2.4^a 115.9±3.2^b

88.2±1.8^c 109.2±3.9^c 119.4±2.9^c

96.8±4.1^ab 106.4±1.7^ab 124.8±0.8^d

92.0±3.7^ab 101.0±2.6^c 111.2±0.7^a

SIN-1-treated control 63.1±3.2

Normal 100.0±0.7

Abbreviations for soymilk were shown in Table 1.

a∼dMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.

Fig. 3. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.- fermented soymilk on TBARS generation in pyrogallol- treated LLC-PK1 cells. Abbreviations for soymilk were shown in Table 1. Values are mean±SD. ^a∼bMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.

Fig. 4. Protective effect of MeOH extracts from Bacillus sp.-fermented soymilk on TBARS generation in pyrogallol- treated LLC-PK1 cells. Abbreviations for soymilk were shown in Table 1. Values are mean±SD. ^a∼bMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.

이 약 2배 정도 지질 과산화 정도가 증가했음을 확인할 수 있었다. 이에 대해 1,000μg/ml의 각 sample을 처리한 결과에서 SM과 FSM-1은 각각 0.047 nmole/mg protein, 0.046 nmole/mg protein으로 control군과 유사한 수준을 보 였고, 청국장에서 분리한 균으로 발효 시킨 FSMs 중에서 특히 FSM-4의 경우는 0.034 nmole/mg protein (약 32% 감 소)의 지질 과산화 정도를 나타냈다. 이러한 결과로부터 O2󰠏

에 의한 산화적 스트레스 개선효과가 Bacillus sp.로 발 효시킨 두유 중 특히 FSM-4가 우수한 효과를 보임을 확 인할 수 있었다.

ONOO^󰠏는 생체 내에서 NO와 O2󰠏

의 반응에 의해 생성 될 수 있으며, 이는 세포 내 표적물과 반응해서 산화 및

질화를 유도하고 세포 신호전달체계의 혼란을 야기하 며, 지질, 단백질, DNA의 손상을 일으키므로 관절염, 동 맥경화, 피부 염증 등 여러 질환과 관련되는 것으로 보고 되고 있다.^34,35) SIN-1은 NO와 O2󰠏

를 생성하고 이들은 급 속히 반응하여 ONOO^󰠏를 형성하며, 이는 강력한 cytotoxic oxidants로 분해되기 때문에 독성 효과를 나타내게 된다. ONOO^󰠏의 독성에 대해 LLC-PK1 cells의 세포 생존 율을 살펴본 결과(Table 3), SIN-1만을 처리하여 산화적 스트레스를 받은 control군은 63.1%의 생존율을 나타냈 으나 SIN-1을 처리한 후 SM 또는 FSMs를 처리한 시료 처리군의 경우 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가했 다. 특히 100μg/ml FSM-2와 FSM-4는 95% 이상의 세포

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생존율을 보였다. SIN-만 처리하여 ONOO^󰠏에 의한 지질 과산화를 유도한 그룹은 0.063 nmole/mg protein을 나타내 어 normal군(0.023 nmole/mg protein)보다 지질 과산화 정 도가 3배 상승되었다. SIN-1을 처리한 후 시료를 1,000μg/

ml 농도로 처리한 군에서는 SM은 약 8% 감소한 0.058 nmole/mg protein가 나타났으나 FSMs을 처리한 경우에는 모두 30% 이상의 지질 과산화 억제 효과를 나타냈고, 특 히 FSM-3와 4가 각각 43% (0.036 nmole/mg protein)와 44%

(0.035 nmole/mg protein)로 지질 과산화를 유의적으로 감 소함을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이상의 연구 결과로부 터 NO와 O2󰠏

의 반응으로 생성되어질 수 있는 ONOO^󰠏에 의한 산화적 스트레스 개선효과가 FSM이 SM에 비해 우 수하며, 특히 FSM-4가 가장 뛰어난 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

선행 연구들로부터 콩은 양질의 단백질과 지질원으로 항산화력이 뛰어나고, 각종 성인병을 예방할 수 있는 건 강기능성을 갖춘 식품으로 알려졌다. 또한 콩이 갖는 phytochemicals은 phytic acid, saponin, isoflavene, protease in- hibitor 등이며, 항산화, 항암, 면역증진 효과 등을 가지는 것으로 보고되어지고 있다.³⁶⁾ 이런 콩의 생리활성기능들 이 미생물 발효에 의해 증가된다는 보고가 있는데 발효 대두식품의 항산화 효과는 amino acid, peptide, phenolic compound 및 갈색 물질 등으로 추정하였고, 이들은 발효 과정 중, 원료 대두의 분해에 의해서 생성된 성분, 대두 자체에 용출된 phenolic compound 그리고 maillard 반응 등 에 의한 갈색물질인 melanoidin일 것으로 추정하였다.³⁷⁾ 더불어 발효를 하여도 콩이 가진 건강에 유익한 특성은 그대로 가지는 것으로 보고되었다.³⁸⁾위장기능 개선, 체 내 콜레스테롤 흡수 저해, 면역조절, 영양소 흡수 및 이 용률을 높이는 등의 기능을 갖고 있는 Lactobacillus나 Bifidobacteria 등과 같은 유산균으로 우유를 발효시키거나, 유당 불내증 환자나 우유의 cholesterol 함량이 건강에 영 향을 줄 수 있다는 단점을 보완하여 lactose나 cholesterol 을 함유하고 있지 않은 두유를 이용하여 발효 두유 요구 르트 등을 개발하려는 시도가 이루어지고 있다.³⁹⁾ 이에 비해 Bacillus 균을 이용한 연구는 거의 행해지지 않은 실 정이다. 본 연구 결과로부터 free radical에 의한 산화적 스 트레스로부터의 개선효과를 Bacillus 균을 이용한 발효두 유가 나타냄을 확인 할 수 있었고, 특히 기능성이 뛰어난 청국장에서 분리한 Bacillus 균을 이용한 발효 두유 FSM-4 가 LLC-PK1 cell에서 NO, O2󰠏

, ONOO^󰠏에 의한 산화적 스 트레스에 대해 세포 생존율을 높이고 지질 과산화도 가

결 론

본 연구는 청국장에서 직접 분리한 Bacillus 균을 이용 하여 발효 두유를 제조하고 항산화 효과를 확인하기 위 하여 발효 두유의 MeOH 추출물을 돼지의 신장 상피 세 포인 LLC-PK1에 처리하여 세포 생존율과 지질 과산화 억 제 정도를 살펴보았다. LLC-PK1, SNP, pyrogallol, SIN-1을 처리할 경우 세포 생존율이 감소하고 지질 과산화 정도 가 증가한 반면 발효 두유를 처리한 결과 농도 의존적으 로 세포 생존율이 상승하였고, 지질 과산화 정도가 낮아 졌다. 특히 Bacillus subtilis 2829 PNU-015로 발효한 두유의 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

감사의 글

본 연구(과제 고유번호: M-02-20070131134352)는 교육 과학기술부와 한국산업기술재단의 지역혁신인력양성사 업으로 수행된 연구결과임.

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