Enhancement of Cosmeceutical Activities of Berberis koreana Bark by High Pressure and Ultrasonification Extraction Processes

초고압 및 초음파 추출공정을 이용한 매자나무 수피의 향장활성 증진

JIN LING*·하지혜*·최운용**·서용창**·김지선**

김영옥***·차선우***·김진철*·이현용*^,**^†

*강원대학교 바이오산업공학부, **의료바이오신소재융복합연구사업단 강원대학교 바이오산업공학부,

***농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부

Enhancement of Cosmeceutical Activities of Berberis koreana Bark by High Pressure and Ultrasonification Extraction Processes

Jin Ling

^*

, Ji Hye Ha

^*

, Yoon Yong Choi

^*

, Yong Chang Seo

^**

, Ji Seon Kim

^**

, Young Ock Kim

^***

, Seon Woo Cha

^***

, Jin Chul Kim

^*

and Hyeon Yong Lee

^*,**†

*

College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea.

**

Medical & Bio-Material Research Center and Department of Biomaterials Engineering College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea.

***

Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseoung369-873, Korea.

ABSTRACT : This study was performed to investigate the enhancement of cosmeceutical activities of Berberis koreana bark by different extraction processes. The extracts are WE (water extract at 100 ^℃ , control), USE (ultrasonification for 1 hours at 60 ^℃ with water), HPE (high pressure for 5 minutes at 60 ^℃ with water) and USE + HPE (ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60 ^℃ with water), respectively. The cytotoxicity of the extracts was in the range of 24.02~26.94% at 1.0 ^㎎ / ^㎖ concentration. The USE + HPE showed the lowest cytotoxicity. Compared to the WE, total phe- nolic and flavonoid contents in the USE + HPE increased to 121.5% and 154.2%. The USE + HPE showed the highest activity at 1.0 ^㎎ / ^㎖ concentration in 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging, inhibition activity of xan- thine oxidase and superoxide dismutase (SOD)-like test, respectively. Tyrosinase inhibition of WE, USE, HPE and USE + HPE at 1.0 ^㎎ / ^㎖ concentration was measured as 17.72, 19.62, 22.83 and 24.16%, respectively. Hyaluronidase inhibi- tion activities of the USE + HPE were higher than 20.8%~29.5% of the WE. Our results suggested that the extracts from ultrasonification process after high pressure extraction has relatively high cosmeceutical activities, and that the bark of ^Ber-

beris koreana could be considered as a candidate of new functional cosmetic agents.

Key Words : Berberis koreana Bark, Ultrasonification, High Pressure, Cosmeceutical Activities

서 언

최근 사회 및 과학의 발전 , 경제의 성장 , 생활수준의 향상으 로 인간의 평균수명이 연장 , 노령화 추세가 가속화 되고 있으 며 , 노화와 더불어 건강과 젊음을 유지하는 방법에 대한 관심 도 증가하고 있다 . ^{특히 피부의 형태학적 변화를 눈으로 직접}

관찰할 수 있어 사람들은 피부 관리에 대해 많은 신경을 쓰고 있다 . 피부노화는 연령이 증가함에 따라 발생하는 내적 노화 와 외적 요인에 의한 외적 노화로 구분되는데 , 외적 노화는 주로 자외선의 노출에 의한 광노화 및 각종 오염물질에 의해 일어나며 , 또한 내적 노화를 촉진시킨다 . 내적 노화된 피부의

특징은 피부에 미세한 주름 생성 , 탄력의 소실 , 피부 위축 등 의 변화가 관찰되며 , 광노화로 인한 외적 노화는 깊은 주름살 과 잔주름살 생성 , 색소 탈색 , 피부건조 , 탄력성 감소 및 색소 침착 등의 변화가 관찰된다 (Park et al ., 2008; Lim et al .,

2002). 따라서 피부노화 억제를 목적으로 하는 기능성 천연물

소재 개발 연구가 시급하다 .

매자나무 ( Berberis koreana ) 는 미나리아재비목 매자나무과 의 낙엽관목으로 약효를 가지는 한국 특산종 수목중의 하나로 서 주로 경기도 이북에 분포되어 있다 (Jin et al ., 2008). 한 방에서 사용하고 있는 매자나무는 소염 , 진통 , 항염증 , 항균 ,

항결핵 , 항암 , 유아설사 등에 효과가 있다고 알려져 있다

†

Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6455 (E-mail) [email protected]

Received 2010 November 5 / 1st Revised 2011 February 13 / 2nd Revised 2011 February 17 / Accepted 2010 February 21

(Kim and Kwak, 1998). ^{특히 매자나무의 활성 성분중의 하나}

인 berberine ^{는 건위} , ^정장 , ^{설사 방지} , ^항고혈압 , ^소염 , ^지혈

및 항균 등 작용이 있다고 알려져 있으며 (Yoo et al ., 1986),

인간 면역 결핍바이러스 억제 , 항산화 및 항암작용이 있다고 보고된 바 있다 (Hyun et al ., 2008). 또한 국내산 매자나무 뿌리의 methanol 추출물에서 얻은 황색침상결정 Majarine (5,6-dihydro-9,10 dimehoxybenzo [g]-1,3-benzodioxolo [5,6-a]

quinolizinium) ^{는 혈압변동 등 중추신경계에 대해 작용을 한다}

고 보고되어 있고 (Kim, 1986), ^매자나무 methanol ^추출물의 ethyl acetate 분획에서 유효성분인 2-(3,4-dihydroxybenzyl)- ethyl alcohol 이 암세포에 대해 높은 억제 효과를 나타내었다 고 보고되어 있다 (Kim and Kwak, 1998). 국내산 매자나무 에는 다양한 유용성분이 함유되어 있음에도 불구하고 수목자 원으로 목질계 부위가 단단하여 활성성분 용출 및 추출 면에 서 한계를 가지고 있어 활성물질의 활용 극대화가 어려웠다 .

또한 기존의 추출방법으로는 에너지 소비가 많고 열로 인해 단백질 변성 , 가용성분이 열로 인한 불안정성 , 유용성분의 손 실 등 단점이 드러내고 있다 (Kim et al ., 2005). 따라서 초 고압 추출공정과 초음파 추출공정을 이용하여 상기 문제점을 해결할 수 있을 것으로 기대한다 .

초고압 처리는 최근 식품에서 영양소와 비영양소의 식물성 화합물질 섭취에 있어 효율적으로 활용될 수 있는 기술이다

(Deliza et al ., 2005). 초고압 기술은 식품에서 열처리가 없거 나 최소 처리하여 식품을 생산할 수 있는 방법으로서 식품의 영양성분 , 맛 , 향기 등의 손실을 최대한으로 줄일 수 있다

(Koo et al ., 2007). 또한 약용식물의 유용성분을 추출하는데 적용할 수 있는데 그에 목적을 두고 사용하는 것을 초고압 추 출이라고 한다 . 초고압 추출은 약용식물의 중요 구성성분의 추 출이 단시간 내에 가능하며 , ^{높은 순도의 단일 성분을 쉽게}

얻을 수 있다 . ^{그것은 초고압 하에서 세포막이 파괴되어 물질}

의 이동이 용이하게 되어 용매가 세포 안으로 들어가 보다 많 은 성분이 세포 밖으로 쉽게 용출되어 나오는 것으로 추정하 고 있다 . 또한 고압 추출을 통하여 에너지 수준이 제한된 수 소결합 , 이온결합 , 반데르발스 결합과 같은 약한 결합들에 의 한 결합은 분리되어 신물질의 용출이 가능한 것으로 보인다

(Zhang ^{et al} ., 2004).

초음파 추출은 초음파 진동에 의한 공동현상 (cavitation) 에 의해 매우 큰 에너지를 발생하게 된다 . 또한 국부온도로 인하 여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고 초음파 에너지 의 충격효과로는 높은 압력을 유도하여 혼합 효과를 높여주게 된다 (Chung et al ., 2000). 초음파 추출공정을 이용하면 추출 시간 단축 , ^{추출수율 향상 및 유용성분의 안전 용출이 가능하}

도록 하게 한다 . ^{그것은 초음파 에너지에 의해 발생되는 공동}

현상으로 인한 높은 압력에 의해 세포조직이 파괴됨으로써 지

방질의 이동거리가 짧아질 뿐만 아니라 공동의 생성 및 소멸 로 인한 교반효과에 의해 확산이 용이하게 일어나 기존의 추 출방법에 비해 빠른 시간에 높은 추출량을 얻을 수 있다고 보 고된 바 있다 (Kim et al ., 2001). 하지만 , 아직까지 초고압 및 초음파 추출공정을 이용한 매자나무의 향장활성에 대한 연 구가 전무한 실정이다 .

따라서 본 연구에서는 초고압 및 초음파 기술을 접목하여 기존의 추출법과 비교하면서 매자나무의 항산화 , ^{미백 등 활}

성을 측정하여 매자나무의 향장 신소재로서의 응용 가능성을 검토하였다 .

재료 및 방법

1. ^{실험재료 및 추출방법}

본 실험에 사용된 매자나무는 한국 특산종으로써 서림종묘 에서 채취한 것으로 , ^{재료를 실온에서 음건시킨 후 사용하였다} .

초음파 추출은 수직환류냉각기가 부착된 추출 플라스크에 매자나무 시료와 증류수를 1 : 10 비율로 60 ℃에서 12 시간 동 안 2 회 반복 추출한 후 60 ㎑ 초음파를 가하여 1 시간 동안 추출하였다 . 초고압 추출은 고압 추출장치 (FOOD CIP-70- 350-80, Ilshin Autoclave, Daejeon, Korea) 를 이용하여 5,000

bar ^{압력으로 상온에서} 5 ^{분간 추출을 실행한 후 매자나무 시}

료와 증류수를 1 : 10 비율로 60 ℃에서 12 시간 동안 2 회 반복 추출하였다 . 초고압 및 초음파 병행추출은 상기 고압 추출이 끝난 후 , 60 ㎑ 초음파를 가하여 1 시간 동안 추출하였다 . 대조

군으로 사용된 일반적인 추출 방법은 100 g 의 매자나무 수피

를 수직 환류냉각기가 부착된 추출 플라스크에 10 배의 증류수 를 사용하여 100 ℃에서 12 시간 동안 2 회 반복 추출하였다 . 얻 어진 각각의 추출물을 감압 여과한 후 감압농축기 (rotary vaccum evaporator N-N series, Evela, Tokyo, Japan) ^{를 이}

용하여 감압농축하고 다시 농축액을 동결건조하여 매자나무 분말을 제조하여 실험에 사용하였다 .

2. ^{세포주 및 세포 생육배지}

본 실험에 사용된 세포주는 인간 피부섬유아세포인 CCD- 986sk (Skin fibroblast cell, human, ATCC, USA), ^마우스

유래 macrophage (J774.1, ATCC, USA) 를 사용하였고 RPMI medium 1640 배지에 10% fetal bovine serum (FBS) 를 첨 가하여 incubator (37 ℃ , 5% CO

2

) 에서 배양하였다 .

3. ^세포독성

매자나무 시료의 정상세포에 대한 독성을 알아보기 위해 인 간 피부섬유아세포인 CCD-986sk ^{를 사용하였으며} sulforho- damine B (SRB) assay (Kim ^{et al} ., 2007) ^{를 이용하여 세포}

독성을 측정하였다 .

SRB assay ^{는 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독}

성을 측정하는 방법으로 실험대상 세포인 CCD-986sk (in

10% FBS media) 의 농도를 4~5 × 10

⁴

cell/ ㎖ 으로 96 well plate 의 각 well 에 100 ㎕ 씩 첨가하여 24 시간 동안 배양 (37

℃ , 5% CO

2

) 한 후 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖로 100 ㎕ 씩 첨가하여 48 시간 배양하였다 . 배

양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v)

trichloroacetic acid (TCA) 100 ^{㎕를 가하여} 4 ^℃에서 1 ^시간

동안 방치한 후 증류수로 4~5 ^{회 세척하여} TCA ^{를 제거하고}

실온에서 plate 를 건조한 뒤 각 well 에 1% (v/v) acetic acid

에 녹인 0.4% (w/v) SRB 용액을 100 ㎕ 씩 첨가하고 상온 에서 30 분 동안 염색시켰다 . 결합되지 않는 잔여 SRB 염색액 의 제거를 위해 1% acetic acid 로 4~5 회 정도 세척 , 건조시 킨 후에 10 mM tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹 여낸 후 540 ^{㎚ 에서} microplate reader (THERMO max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ^{를 이용하여 흡광}

도를 측정하였다 . 4. ^{총 폴리페놀 함량}

Kwon 등 (2006) 의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent 가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청 색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다 . ^{농도별로 조절한 매}

자나무 시료 100 ㎕에 2% Na

²

CO

³

용액 2 ㎖를 첨가하여 3

분간 방치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 ㎕를 가하 여 30 분 동안 반응시켰다 . 이후 반응액을 750 ㎚에서 흡광도 를 측정하였다 . 동시에 gallic acid 의 농도를 31.3, 62.5, 125,

250, 500 ㎍ / ㎖로 조절하여 표준 검량곡선을 작성하여 계산하

였다 .

5. ^{플라보노이드 함량}

플라보노이드 함량은 농도별로 조절한 매자나무 시료 1 ㎖ 에 diethyleneglycol 2 ㎖ , 1 N NaOH 20 ㎕를 첨가하여 37

℃ 항온에서 1 시간동안 방치한 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정 하였다 . Quercetin 을 이용한 표준곡선은 5, 10, 20, 30, 40

㎍ / ㎖로 조절하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Boo et al ., 2009).

6. Superoxide dismutase (SOD) ^유사활성

SOD 유사활성은 1.0 ㎎ / ㎖의 농도로 조절한 매자나무 시료

0.2 ㎖에 Tris-HCl 의 완충용액 (50 mM Tris + 10 mM EDTA, PH 8.5) 2.6 ㎖와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ㎖ 가하여 실온에서

10 분간 반응시킨 후 , 1 N HCl 0.1 ㎖를 가하여 반응을 정지 시켰다 . ^{반응액 중 산화된} pyrogallol ^{의 양은} 420 ^{㎚에서 측정}

하였다 . SOD ^{유사활성은 시료 첨가구 및 무첨가구 간의 흡광}

도 차이를 백분율 (%) 로 나타내었다 (Park et al ., 2008).

* As : 시료 첨가구의 흡광도 , Ac : 시료 무첨가구의 흡광도 ,

단 As와 Ac는 대조구의 흡광도를 제외한 수치

7. Xanthine oxidase ^저해활성

매자나무 시료의 항산화 활성 측정을 위해 xanthine oxidase

저해활성을 측정하였다 . 1.0 ^㎎ / ^{㎖ 농도로 조절한 매자나무 시}

료 1 ㎖ 에 40 mU 의 xanthine oxidase 0.1 ㎖ 및 0.07 M phosphate buffer (PH 7.5) 2.9 ㎖를 가하여 25 ℃에서 15 분간 예열시켰다 . 여기에 0.15 mM xanthine 2 ㎖를 가하고 , 다시

30 분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 ㎖를 가하여 반응을 정지시킨 후 290 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Hyun et al ., 2007).

* As : 시료 첨가구의 흡광도 , Ac : 시료 무첨가구의 흡광도

8. DPPH ^{라디칼에 대한 전자공여능}

추출물의 전자공여작용 (electron donating abilities, EDA) ^은

각각의 추출물에 대한 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)

의 전자공여 효과로 각 시료의 환원력을 측정하였다 . 1.0

㎎ / ㎖의 농도로 조절한 각 시료 10 ㎕와 ethanol 1 ㎖ , 100 mM sodium acetate buffer (PH 5.5) 990 ㎕를 분주한 시험 관에 0.4 mM DPPH 용액 (Abs. ethanol soln.) 0.5 ㎖를 넣어 교반하고 암실에서 30 분간 반응을 유도한 후 , 잔존 라디칼의 농도를 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Lee and Lee, 2008).

* As : 시료 첨가구의 흡광도 , Ac : 시료 무첨가구의 흡광도

9. Tyrosinase ^{저해 활성}

Tyrosinase ^{저해 활성 측정은} Cho (2008) ^{의 방법을 변형하}

여 실험을 실시하였다 . 96 well plate ^{에 먼저} 0.1 M sodium phosphate buffer (PH 6.5) 200 ㎕ 분주하고 , 다음으로 농도별 로 조절한 매자나무 시료 20 ㎕ , 그리고 tyrosinase 효소액

(300 units/ ㎖ ) 를 순서대로 첨가하였다 . 이어 1.5 mM 의

tyrosine solution 40 ㎕ 첨가하여 37 ℃에서 10~15 분간 반응 ,

− 4 ℃에서 2~3 분간 배양한 후 ELISA reader 를 이용하여

490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 . SOD 유사활성 (%) = ( 1 − As _Ac ) × 100

Xanthine oxidase inhibition (%) = ( 1 − _Ac As ) × 100

EDA (%) = ( 1 − _Ac As ) × 100

Tyrosinase inhibition (%) = (1 ⁻ ( ( C S

aa

− C − S

bb

) ) × 100

* ^S

^a

: ^{시료 첨가구의 배양 후 흡광도} , ^S

^b

: ^{시료 첨가구의 배}

양 전 흡광도 , ^C

a

: ^{시료 무첨가구의 배양 후 흡광도} , ^C

b

: ^시료

무첨가구의 배양 전 흡광도

10. Hyaluronidase ^{저해 활성}

Hyaluronidase 저해 활성 측정은 sodium-hyaluronic acid 로 부터 형성된 N-acetylglucosamine 을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 P -dimethyl-amino-benzaldehyde (DMAB) ^{로 발색}

시켜 흡광도를 측정하여 효소활성을 측정하였다 . ^{농도별로 조}

절한 매자나무 시료 20 ㎕와 0.1 M acetate buffer (PH 3.5)

에 녹인 hyaluronidase (7900 units/ ㎖ ) 50 ㎕를 혼합하여 37

℃에서 20 분간 배양한 후 12.5 mM CaCl

2

200 ㎕를 가하고 혼합한 후 다시 20 분간 배양하였다 . 기질로서 0.1 M acetate buffer (PH 3.5) 에 녹인 hyaluronic acid (12 ㎎ / ㎖ ) 250 ㎕를 첨가하여 37 ^{℃에서 다시} 40 ^{분간 배양하였다} . ^이후 0.4 N potassiumtetraborate 100 ^{㎕ 및} NaOH 100 ^{㎕를 반응 혼합물}

에 첨가하여 3 분간 100 ℃ 수욕 상에서 가열한 후 완전히 냉 각시켰다 . 냉각 시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3.28 ㎖ 를 가하여 37 ℃에서 20 분간 배양한 다음 585 ㎚에서 흡광도 를 측정하여 저해 활성을 산출하였다 (Park et al ., 2008).

* As : 시료 첨가구의 흡광도 , Ac : 시료 무첨가구의 흡광도

11. ^{대식세포에서의} nitric oxide ^생성능

마우스 유래 대식세포인 J774.1 를 이용하여 매자나무 시료 의 첨가를 통해 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는

nitrite ^{의 양을} microplate assay ^{를 이용하여 정량하여 측정하였}

다 . 대식세포를 4~5 × 10

⁴

cell/ ㎖의 농도로 조절하여 96 well plate 에 분주하여 incubator (5% CO

2

, 37 ℃ ) 에서 24 시간 전배 양하였다 . 이후 전배양 배지를 제거하고 Lipopolysaccharide

(LPS) 가 함유되거나 함유되지 않은 배지로 시료를 농도별로

조절하여 well 에 분주하여 48 시간 배양하였다 . 배양이 끝난 후 상등액을 50 ㎕를 취하여 동일 부피의 Griess 시약을 첨가하 여 실온에서 10 ^{분간 반응시킨 후} ELISA reader ^{를 이용하여} 540 ㎚의 흡광도를 측정하였다 . Nitrite 의 표준물질로 sodium nitrite 를 사용하였으며 농도는 32 µM 에서 0.25 µM 까지 단계 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다 (Lee and Cho, 2007).

12. HPLC ^{를 이용한 매자나무 추출물의} phenolic acids ^에

대한 정량분석

추출공정에 따른 매자나무 추출물의 phenolic acids 에 대한 정량분석을 알아보고자 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC;

High-peroformance Liquid Chromatography) ^{를 이용하여 비교}

분석하였다 .

HPLC 기기는 UV absorbance detector (280 ㎚ , 0.05 AUFS) 가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Waters M600E, Milfold, MA) 를 사용하였으며 , 유리 phenolic acids

를 분리하기 위하여 Waters Spherisord ODS2 Column [250

㎜ × 4.6 ㎜ (inside diameter), 5 ㎛ ] 을 사용하였다 . 공정에 따 른 매자나무 추출물들의 성분분석을 위해 시료를 HPLC ^분석

용 water ^{에 녹여} 0.2 ^㎛ syringe filter ^{로 여과하고} Injection volume 20 ㎕ 로 측정하였다 . 이동상은 용액 A [1 mM trifluoroacetic acid (TFA) 가 함유된 10% (V/V) acetonitrile],

용액 B [1 mM TFA 가 함유된 40% (V/V) methanol 과 40%

(V/V) acetonitrile] 를 사용하였고 용액의 비율은 시간에 따라

(0 min 90% A 와 10% B; 0~10 min 90% A 와 10% B;

10~15 min 60% A ^와 40% B; 15~24 min 60% A ^와 40%

B; 24~40 min 0% A ^와 100% B; 40~45 min 90% A ^와 10% B; 45~50 min 90% A 와 10% B) 설정하였으며 유속은

1.0 ㎖ /min 로 흘려주었다 . Phenolic acids 의 표준물질인

vanillin, vanillic acid, p -hydroxybenzoic acid, p -hydroxy- benzaldehyde, trans - p -coumaric acid, trans -cinnamic acid,

trans -ferulic acid 를 10, 50, 100 ㎎ / ㎖으로 희석하여 검량선을 구하였다 (He ^{et al} ., 2010).

13. Scanning electron microscope (SEM) ^관찰

추출공정에 따른 매자나무 추출물들의 조직 파괴의 형태를 관찰하기 위하여 저진공 주사전자현미경 (Low Vacuum- Scanning Electron, × 100) 을 이용하여 매자나무 수피의 구조 와 형태를 관찰하였다 . 먼저 3% glutaraldehyde 용액으로 실 온에서 3 ^{시간 동안 전고정한 후} , 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8~7.2) ^로 15 ^분씩 3 ^{회 세척하였다} . ^{세척된 시료는} 2% aqueous osimium tetroxide 에 의해 4 ℃에서 2~6 시간 후 고정 (postfixation) 처리되어 다시 0.1 M sodium phosphate buffer 로 세척되었다 (15 분 3 회 ). 이어 30% acetone 을 시작으 로 10% 씩 상승된 graded acetone series 탈수과정을 거치고 ,

탈수된 시료들을 isoamyl acetate 에 3~4 회 교체된 후 4 ℃에서 냉장 보관되었다 . ^{이후 이들 시료는} Hitachi HCP-2 critical point dryer 를 이용하여 liquid CO

²

에 의한 임계점 건조과정

(critical point drying, CPD) 을 거쳐 Hitachi E-1030 putter

장치로 약 10 ㎚ 두께의 금속피막 (Au gold coating) 을 입힌 후 저진공 주사전자현미경으로 관찰하여 수집된 image data 는

file 에 저장된 후 출력되어 각각의 조직 형태를 관찰하고 비교

하였다 (Kim and Lee, 2005).

14. ^통계처리

모든 분석 수치는 mean ± S.D. 으로 나타났다 . 모든 실험 결

Hyaluronidase Inhibition (%) = ( 1 − As _Ac ) × 100

과는 통계 프로그램이 SPSS 16.0 을 사용하였으며 , 유의차 검 증은 분산분석 (ANOVA: analysis of variance) 을 한 후 α = 0.05 수준에서 Duncan 의 다중 검증법 (DMRT: Duncan's multiple range test) 에 따라 분석하였다 .

결과 및 고찰

1. ^{추출 수율}

Fig. 1 은 매자나무 수피의 추출공정별 수율을 나타낸 것이

다 . 모든 추출조건에서 초고압 처리 후 초음파 병행한 추출물 이 8.26% 로 가장 높은 수율을 나타내었으며 , 일반 열수추출물 이 5.21% ^{로 가장 낮은 수율을 나타내었다} . ^{일반 열수추출물에}

비교했을 때 초음파 추출물 , ^{초고압 추출물} , ^{초고압 처리한 후}

초음파 병행 추출물의 수율이 각각 30%, 39%, 59% 로 증진

된 것을 확인할 수 있다 . 기존의 열수 추출물에 비해 초음파 추출물의 수율이 높게 나타나는 것은 초음파 조사 시 형성된 공동현상 (cavitation) 에 의한 높은 압력으로 세포 내부조직이 파괴되어 추출물의 이동거리가 짧아지고 확산이 용이하게 일 어나기 때문이며 , ^{또한 고분자 등은 원자 간의 결합이 끊어지}

게 되어 기존의 추출방법으로 용출이 어려웠던 성분의 용출도 가능해졌기 때문이다 (Kim et al ., 2001; Kim and Choi,

2009). 초고압 추출물의 수율이 높게 나타난 것은 초고압 처

리를 통해 조직 및 세포벽의 변형 및 파괴로 조직과 세포내의 활성성분이 대량으로 용출되며 , 특히 매자나무와 같은 표면이 단단한 시료인 경우에는 활성성분의 용출에 걸림돌로 작용하 였던 목질계의 단단한 조직을 느슨하게 함으로써 용매와의 접 촉 면적을 증가시켜 유효성분의 확산 및 용출이 용이하게 되 어 수율이 높게 나타난 것으로 사료된다 . 상기결과를 통해 초 음파 및 초고압 추출공정이 매자나무 추출수율 증가에 기여하

였음을 확인할 수 있었으며 , 또한 초음파 및 초고압 추출공정 을 통한 추출물에 보다 많은 유효성분이 함유되어 추출물의 생리활성에도 영향을 끼칠 것으로 기대되어 이후의 실험을 진 행하였다 .

2. ^세포독성

각 공정별로 추출한 매자나무 시료의 세포독성 변화를 확인 하고자 인간 피부섬유아세포인 CCD-986sk 를 이용하여 측정

하였다 . Fig. 2 에서 보여 주는 바와 같이 각각의 매자나무 추

출물에서 세포독성이 농도 의존적으로 상승하는 것을 관찰할 수 있었으며 , ^{최고 농도인} 1.0 ^㎎ / ^{㎖에서 비교하였을 때 초고}

압 처리한 추출물인 HPE ^가 26.94% ^{로 가장 높은 세포독성을}

나타내었고 초고압 처리한 후 초음파 병행한 추출물인

USE + HPE 가 24.02% 로 가장 낮은 세포독성을 나타내었는데 ,

이는 WE 의 25.79% 에 비해 6.86% 독성저감 효과가 있었다 .

한편 초음파 추출만 실시할 경우 세포독성이 다소 감소되었으 나 초고압 및 초음파 병행 추출물의 독성저감 효과까지 도달 하지 못했다 .

상기의 결과를 살펴보면 단순히 초고압 추출만 실시할 경우 에는 일반 열수추출물에 비해 세포독성이 증가되는 경향을 나 타내었는데 , 이는 초고압 처리를 통해 기존의 활성성분이 용 출되는 동시에 독성을 나타내는 물질도 용출되어 추출물의 독 성이 상승된 것으로 사료된다 . 그러나 매자나무의 초음파 추 출물 , 초고압과 초음파 병행 추출물의 독성이 감소되는 경향 을 나타냈다 . ^{이는 기존의 연구결과에 미루어 보아 초음파 병}

행 공정을 통해 유도된 공동현상으로 추출물내의 독성성분의

변성 및 파괴로 인해 독성이 감소된 것으로 사료되며 (Kwon

et al ., 2008), 초고압 및 초음파 병행 추출시에는 고압으로 인

Fig. 1.

Comparison of the extraction yields from

Berberis koreana

bark according to different extraction processes (WE:

water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water.

USE + HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water)

^.

Fig. 2.

Cytotoxicity of

Berberis koreana

bark on human skin fibroblast, CCD-986sk (WE: water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water. USE + HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water)

^.

※

Each value represents the mean±S.D..

하여 매자나무 수피의 내부조직이 느슨해진 상태에서 초음파 를 가하여 초음파의 에너지가 내부조직에 더욱 쉽게 들어가 독성성분을 변성 또는 파괴하여 독성이 감소된 것으로 사료된 다 . 따라서 매자나무와 같은 수목자원들의 목질부 조직이 단 단하여 유용활성 물질 용출 추출 면에서의 한계점을 나타내는 것과 , ^{또한 천연물로서 자체가 독성을 갖고 있는 등 단점을}

감안했을 때 초고압과 초음파 추출공정을 도입하면 효율적으 로 생리활성 물질을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 독성저감 효과 도 기대할 수 있을 것으로 사료된다 .

3. ^{총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량}

폴리페놀은 식물에서 발견되는 화학물질의 일종으로서 한 분자 내에 2 ^{개 이상의} phenolic hydroxyl (OH) ^{기를 가진 방}

향족 화합물들을 가리키는데 일반적으로 타닌 (tannin), 리그 닌 (lignan), 플라보노이드 (flavonoid) 로 분류되어 있다 . 폴리 페놀계의 물질은 식물체에 특수한 색깔 , 향기를 부여할 뿐만 아니라 항산화 , 항암 , 항노화 , 고혈압 억제 , 콜레스테롤 저하 등 다양한 기능성 작용을 하고 있다 (Park et al ., 2008; Ju

et al ., 2009; Kim 2008).

추출공정에 따른 매자나무 수피의 총 폴리페놀과 플라보노 이드의 함량을 측정한 결과 Fig. 3 에 나타내었다 . 총 폴리페놀 함량은 농도 의존적으로 증가되는 경향을 관찰할 수 있었으 며 , 최고 농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서 초고압 처리한 후 초음파 병 행한 추출물인 USE + HPE 가 38.75 ㎍ / ㎖으로 가장 높았고 ,

초고압 추출물인 HPE 가 36.38 ㎍ / ㎖ , 초음파 추출물인 USE

가 33.05 ^㎍ / ^㎖ , ^{일반 열수추출물인} WE ^가 31.88 ^㎍ / ^{㎖ 순으}

로 함량을 나타내었다 . 한편 플라보노이드의 함량은 총 폴리 페놀 함량과 비슷한 경향을 보였으나 함량 면에서 다소 적게 나타내었으며 , 1.0 ㎎ / ㎖ 농도에서 USE + HPE, HPE, USE,

WE ^{는 각각} 8.02 ^㎍ / ^㎖ , 7.60 ^㎍ / ^㎖ , 6.80 ^㎍ / ^㎖ , 5.20 ^㎍ / ^㎖

이 측정되었다 . ^이는 Boo ^등 (2009) ^{보고한 총 폴리페놀 함}

량이 가장 높은 한국 재래종인 여주의 품종별 ethanol 추출물

이 1.0 ㎎ / ㎖ 농도에서 총 페놀함량 16.82 ㎍ / ㎖을 나타낸다는 것과 , 플라보노이드 함량이 가장 높은 일본 품종인 ‘peacock’

의 총 플라보노이드 함량이 4.38 ㎍ / ㎖으로 나타난 결과보다 높은 수치를 기록한 것으로 미루어 매자나무 수피에는 많은 페놀류 화합물이 함유되어 있을 뿐만 아니라 초고압 및 초음 파 병행 추출을 통해 유용활성 성분이 대량으로 용출된 것으 로 사료된다 .

총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량은 서로 밀접한 상호 관계가 있다고 보고된 바 있는데 (Jeong et al ., 2007) 본 연 구에서 매자나무 수피의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함 량을 회귀 분석으로 분석한 결과 결정계수 R

²

는 0.87 로 총 폴 리페놀과 플라보노이드 함량의 연관성이 높게 나타내었다 ( ^P

< 0.05).

4. ^{항산화 활성}

1) SOD 유사활성

SOD 는 생체에 매우 유해한 환원산소종 (superoxide anion radical) 을 과산화수소로 전환시키는 반응 (2O

2−

+ 2H

⁺

→

H

²

O

²

+ O

²

) ^{을 촉진하는 효소이며} , SOD ^{에 의해 생성된 과산화}

수소는 peroxidase 나 catalase 에 의해 최종적으로 무해한 물과 산소로 분해한다 . 하지만 이러한 SOD 는 단백질로 열과 pH 에 불안정하는 단점을 갖고 있기에 현재 안정적이고도 SOD 와 유 사한 활성을 갖고 있는 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되 고 있다 (Lim et al ., 2007).

추출공정에 따른 매자나무 수피의 SOD 유사활성을 측정한 결과 Table 1 ^{에 나타내었다} . 1.0 ^㎎ / ^{㎖ 농도로 조절한 매자나}

무 각 추출물들의 SOD ^{유사활성은} WE (20.27%) < USE (26.63%) < HPE (27.78%) < USE + HPE (28.89%) 의 순으로 증가 되었으며 일반 열수추출물에 비교했을 때 초고압 추출 물 , 초음파 추출물 , 초고압 및 초음파 병행 추출물의 SOD 유

사활성은 30% 이상으로 통계적으로 유의성 있게 증가 되었다

( P < 0.05). 82 종의 약용식물을 대상으로 SOD 활성을 측정한 결과에서 원지 , ^백편두 , ^백개자 , ^대황 , ^{감초 등} 5 ^{종의 약용식물}

은 매자나무 수피에 비해 30% 이상으로 활성이 높았지만 연

자육 , 지황 등 77 종이 30% 미만으로 매자나무 수피와 유사하 거나 적은 활성을 나타내었다 (Lim et al ., 2004).

2) Xanthine oxidase 저해활성

Xanthine oxidase 는 xanthine 을 기질로 하여 uric acid 를 형 성하는 과정에서 superoxide radical ^{을 생성하는 효소로서 생체}

내에서 주로 purine ^{체의 대사산물인} hypoxanthine ^을 xanthine

으로 , xanthine 을 다시 산화시켜 uric acid 를 생성하는 반응의

Fig. 3.

Total phenolic contents (bar chart,

^㎍

/

^㎖

) and flavonoid

contents (line chart,

^㎍

/

^㎖

) from

Berbeis koreana

bark according to different extraction processes. (WE: water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water. USE + HPE:

ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water.)

※

Each value represents the mean±S.D..

촉매로 작용한다 (An et al ., 2006). 혈장내에 uric acid 가 증 가되면 골절에 축적되어 통풍을 유발하며 , 신장에 침착되어 신 장 질환을 일으킨다고 알려져 있다 (Hyun et al ., 2007).

Xanthine oxidase ^{를 저해하게 되면 통풍과 신장 질환을 예방}

할 수 있을 뿐만 아니라 free 라디칼의 생성이 억제되어 항산

화 및 항노화 효과도 기대할 수 있다 .

추출공정에 따른 매자나무 수피의 xanthine oxidase 저해활 성은 Table 1 과 같다 . 결과에서 확인할 수 있듯이 기존의 열 수추출물에 비해 초음파 혹은 초고압 추출공정을 이용한 시료 들의 xanthine oxidase ^{저해활성이 약} 1.2 ^{배 이상 유의적으로}

증가되었으며 ( ^P < 0.05), ^{그중에서 특히 초고압 처리한 후 초}

음파 병행한 추출물인 USE+HPE 가 53.40% 의 저해활성으로 가장 높았다 . 식물성 페놀류 중 galloyl 기를 함유한 플라보노 이드 화합물이 많을수록 xanthine oxidase 저해효과가 우수하 였다는 것으로 보고된 바 있는데 (Song et al ., 2008) 본 실 험에서 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 가장 많은

USE+HPE 가 xanthine oxidase 에 대한 저해효과가 가장 우수 한 것으로 상기 결과와 일치하였다 .

3) DPPH 라디칼에 대한 전자공여능

전자공여능의 측정에 사용된 DPPH 는 분자 내에 라디칼을 함유하여 다른 free 라디칼들과 결합하여 안정한 complex 를 만들고 있어 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 소

거되며 , ^이때 DPPH ^{의 고유의 청남색이 옅어지면서 흡광도가}

감소하게 되는데 이런 비색정량 , ^{흡광도 변화를 통해 전자공}

여능을 측정하였다 (Ju et al ., 2009). 매자나무 각각의 추출물 들을 1.0 ㎎ / ㎖ 농도로 조절하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측 정한 결과 , WE (58.06%), USE (62.45%), HPE (70.78%), USE + HPE (73.25%) 의 순으로 라디칼 소거활성이 증가되었 다 . 기존의 열수 추출물에 비해 초고압 혹은 초음파 추출공정 을 거친 시료들이 8% 이상 활성 증가를 나타냈는데 , 그중에

서 초고압 및 초음파 병행 추출물이 73.25% ^{로 가장 높은 라}

디칼 소거활성을 나타내었다 (Table 1). 이는 Jung 등 (2004)

이 발표한 약용식물에 대한 전자공여 활성을 측정한 결과 1.0

㎎ / ㎖의 농도에서 괴화 (76.9%) 보다 낮았으나 녹차 (64.6%),

작약 (57.1%), 생강 (48.3%) 등 보다는 유사하거나 높게 나타 내었다 .

상기 연구한 결과로부터 초고압 및 초음파 추출공정이 매자 나무 수피의 항산화 활성성분의 용출 및 항산화 활성 증진에 기여하였음을 확인할 수 있다 . 그중에서도 특히 초고압 처리 한 후 초음파 병행 추출공정의 효과가 가장 뚜렷하였다 . 이는 초고압 추출 후 이어 초음파 병행 추출 시 지속적으로 형성된 압력과 열로 매자나무의 조직 및 세포벽이 변형 , 파괴되어 세 포내의 활성 성분이 대량으로 용출되거나 또는 기존의 열수추 출법으로 용출이 어려웠던 성분의 용출도 가능해졌기 때문으 로 사료된다 . 따라서 초고압 및 초음파 추출공정을 도입하면 매자나무 향장 신소재로서의 응용 가능성도 기대할 수 있다 . 5. Tyrosinase ^{저해 활성}

화장품 산업에서 매우 중요한 부분으로 되고 있는 미백효능 은 멜라닌 생성 및 색소 침착을 촉진시키는 효소인 tyrosinase

에 대한 저해활성을 통해 측정하였다 (Kwon ^{et al} ., 2008).

매자나무 추출물의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖로 조 절하여 tyrosinase 효소의 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4 과 같다 . 모든 추출물에서 시료의 농도가 증가함에 따라

tyrosinase 저해율도 증가하였으며 , 최고 농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서

USE + HPE 가 24.16% 로 가장 높았고 , HPE 는 22.83%, USE

는 19.62%, WE ^는 17.72% ^의 tyrosinase ^{저해활성을 나타내었}

다 . ^이는 Jung ^등 (1995) ^{의 약용식물류 및 초본류의} tyrosinase

활성 저해활성 탐색에서 오매 , 계피 , 상백피 , 토사자 등 30%

이상의 저해활성을 나타내었다는 결과보다 낮은 저해율을 보 였으나 오가피 , 박하 , 감초 등 일부 약용식물 22% 이하의 저 해율과 비교하면 추출공정에 따른 매자나무 수피가 tyrosinase

에 대한 저해활성이 유사하거나 높게 나타내었다 . 6. Hyaluronidase ^{저해 활성}

추출공정에 따른 매자나무 시료의 항염증 효과를 확인하기 위하여 hyaluronidase 저해활성을 조사하였으며 측정 결과는

Table 1.

Comparison of antioxidant activities from

Berberis koreana

bark according to different extraction processes.

Sample SOD like activity (%) Inhibition ratio of xanthine

oxidase activity (%) DPPH radical scavenging activity (%)

†

WE 20.27±1.77

^a※

40.50±2.07

^a

58.06±2.67

^a

‡

USE 26.63±0.72

^b

48.11±1.68

^b

62.45±2.20

^a

§

HPE 27.78±1.85

^b

50.09±2.95

^b

70.78±3.30

^b

#

USE + HPE 28.89±2.33

^b

53.40±3.28

^b

73.25±3.34

^b

†

WE: water extraction at 100

℃

, control.

‡

USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

℃

with water .

§

HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

℃

with water.

#

USE + HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

℃

with water.

※

Each value represents the mean±S.D.. Means followed by different letters in each column differ significantly (

^P

< 0.05).

Fig. 5 ^{에 나타내었다} . ^{모든 추출물은 농도 의존적으로} hyaluronidase ^{에 대한 저해율도 증가하였으며} 0.2~1.0 ^㎎ / ^{㎖ 농}

도로 조절한 각각의 추출물에서 WE 는 28.69%~49.03%, USE

는 28.92%~53.72%, HPE 는 32.38%~55.21%, USE + HPE 는

34.65%~63.36% 의 저해활성을 나타내었다 . 최고 농도인 1.0

㎎ / ㎖에서 초고압 추출물 , 초고압 및 초음파 병행 추출물이 일반 열수추출물에 비해 hyaluronidase 에 대한 저해활성이

18% ^{이상 유의적으로 증가되었는데} ( ^P < 0.05), ^{이는 초고압}

및 초음파 추출로 인해 매자나무의 활성성분의 용출이 증가된 결과로 사료된다 .

7. ^{대식세포에서의} nitric oxide ^생성능

대식세포를 이용하여 NO

⁻

생성능을 측정한 결과는 Fig. 6

에 나타내었다 . 대식세포의 nitric oxide synthase (NOS) 는 항 상 존재하는 것이 아니라 interferon- ^γ , tumor necrosis factor-

γ (TNF- ^γ ), tumor necrosis factor- ^α (TNF- ^α ) ^{와 같은 여러 가}

지 cytokine 과 LPS (E. coli derived lipopoly-saccharide) 와

같은 세균 내독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도

되기 때문에 (Kim et al ., 2007) 본 연구에서는 매자나무 추 출물을 LPS 와 같이 투여하여 대식세포로부터 NO

⁻

생성능을 확인하였다 . 결과를 통해 대식세포의 NO

⁻

생성능이 시료의 농 도 의존적으로 증가되는 경향을 확인할 수 있었으며 , ^최고농

도인 1.0 ㎎ / ㎖에서 매자나무 시료의 첨가군이 7.49~21.30 µM

로 아무처리도 하지 않은 대조군 (control) 에 비해 4.5 배 이상 의 활성이 증진되었다 . 이는 매자나무 자체의 독성물질의 기 인한 것으로 추측해 볼 수 있으며 , USE + HPE 의 NO

⁻

생성 능이 HPE 에 비해 낮은 것은 초고압과 초음파 병행 추출을 통 해 독성물질의 변형 및 파괴로 독성저감 효과로 사료된다 . 하 지만 , ^{매자나무 추출물과} LPS ^{를 동시에 처리한 결과에서} NO

⁻

생성능이 13.60~37.87 µM ^{로 큰 폭으로 증가되었는데} , ^{이는 매}

자나무 시료의 첨가를 통해 LPS 등 세균 내독소와 함께 상증

작용을 나타내어 NO

⁻

생성능을 증진시킴으로써 면역체계에 활성 증진 효과를 나타냄을 확인할 수 있는 결과로 사료된다 .

Fig. 4.

Inhibition ratio of

Berberis koreana

bark according to different extraction processes on tyrosinase (WE: water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water. USE + HPE:

ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water)

^.

※

Each value represents the mean±S.D.. Means followed by different letters differ significantly (

^P

< 0.05).

Fig. 5.

Inhibition ratio of

Berberis koreana

bark according to different extraction processes on hyaluronidase (WE:

water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water.

USE+HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water)

^.

※

Each value represents the mean±S.D.. Means followed by different letters differ significantly (

^P

< 0.05).

Fig. 6.

Production of nitric oxide with treatment with different concentration of extracts from

Berberis koreana

bark (WE: water extraction at 100

^℃

, control. USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

^℃

with water. HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water. USE+HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water).

※

Each value represents the mean±S.D.. Means followed by different letters differ significantly (

^P

< 0.05).

면역 활성을 가진 것으로 알려진 전통발효를 통한 오미자에 관한 연구 (Kim ^{et al} ., 2007) ^{에서 오미자 시료만은 첨가했을}

때의 5.8~9.1 µM 과 오미자 시료와 LPS 를 함께 첨가했을 때의

11.0~14.3 µM 의 결과와 비교했을 때 매자나무 시료가 보다 높 은 NO

⁻

생성능을 가진 것으로 확인할 수 있었다 . 상기 결과 로부터 보면 매자나무 수피는 대식세포의 NO

⁻

생성능을 증진 시킴으로써 면역 활성이 있었으며 , LPS 등 내독소와 함께 상 승작용을 나타내었음을 확인할 수 있다 .

8. HPLC ^{를 이용한 매자나무 추출물의} phenolic acids ^{에 대}

한 정량분석

Phenolic acid 는 식물성 식품계에 널리 분포하여 있는 성분 으로서 높은 항산화성을 가지는 물질로 알려져 있다 . 이는 생 체에서도 유지 산패 억제 , 이에 따른 변이원성 억제 , 또한 미 생물 생육을 억제하는 생리기능을 나타난다고 한다 (Kwak and

Lim, 2007). ^{추출공정에 따른 매자나무 수피에 함유된}

phenolic acids 를 정량분석하기 위하여 p -hydroxybenzoic acid, vanillic acid, p -hydroxybenzaldehyde, vanillin, trans - p -coumaric acid, trans -ferulic acid, trans -cinnamic acid 등 7 가지 표준물

질을 사용하였으며 , HPLC ^{를 이용하여 측정한 결과 각각} 9.99

분 , 11.40 ^분 , 13.57 ^분 , 16.74 ^분 , 20.06 ^분 , 21.04 ^분 , 30.68 ^분에

검출되었다 (Fig. 7).

Table 2 는 추출공정에 따른 매자나무의 phenolic acids 함량

을 HPLC 로 분석한 결과이다 . 전체적으로 보면 초고압 혹은

초음파 추출을 이용한 매자나무 시료의 phenolic acids 함량이 일반 열수추출물에 비해 높게 나타내었으며 , 또한 매자나무 추 출물에 함유한 phenolic acids 중에서 vanillic acid 함량이

13.71~63.48 ^㎎ /100 g ^{로 가장 높게 나타낸 한편} , ^{반대로 p} - hydroxybenzaldehyde 와 trans -cinnamic acid 는 매자나무에서 검출되지 못했다 . P -hydroxybenzoic acid 경우 USE 의 함량이

17.61 ㎎ /100 g 로 가장 높았고 , 다음으로는 HPE 16.65 ㎎ / 100 g, USE + HPE 는 10.48 ㎎ /100 g 로 , WE 는 9.30 ㎎ /100 g

로 가장 낮은 것으로 나타내었다 . Vanillic acid 경우 HPE (63.48 ^㎎ /100 g) > USE + HPE (56.43 ^㎎ /100 g) > USE (30.29

㎎ /100 g) > WE (13.71 ^㎎ /100 g) ^{순서로 나타내었다} . ^Trans - ^p - coumaric acid 와 trans -ferulic acid 경우 USE + HPE 의 함량 이 각각 15.27 ㎎ /100 g 및 10.27 ㎎ /100 g 로 가장 높게 나타 내었으며 , WE 에 비해 각각 2.0 배 , 0.9 배 증가되었다 . Vanillin

Fig. 7.

Typical HPLC chromatogram of phenolic acid standards (A:

^p

- hydroxybenzoic acid. B: vanillic acid. C:

^p

-hydroxybenzaldehyde.

D: vanillin. E:

^trans

-

^p

-coumaric acid. F:

^trans

-ferulic acid. G:

^trans

-cinnamic acid).

Table 2.

Comparison of phenolic acids in the extracts of

Berberis koreana

bark according to different extraction processes. (

㎎

/100 g) Sample

p

-hyeroxybenzoic acid Vanillic acid Vanillin

trans

-

p

-coumaric acid

trans

-ferulic acid

†

WE 59.30 13.71 57.52 55.01 55.20

‡

USE 17.61 30.29 15.36 59.71 55.46

§

HPE 16.65 63.48

−

57.49 59.48

#

USE + HPE 10.48 56.43

−

15.27 10.27

†

WE: water extraction at 100

℃

, control.

‡

USE: ultrasonification extraction for 1 hours at 60

℃

with water.

§

HPE: high pressure extraction for 5 minutes at 60

℃

with water.

#

USE + HPE: ultrasonification process for 1 hours after high pressure for 5 minutes at 60

℃

with water.

의 경우 WE 와 USE 에서만 검출되었고 HPE 와 USE + HPE 에 서는 검출되지 못했다 .

상기의 결과를 통해 초고압 또는 초음파 추출공정이 매자나 무 수피의 내부 조직에 영향을 주어 phenolic acids ^{의 용출을}

용이하게 하였음을 알 수 있었으며 , 초고압 추출물과 초고압 및 초음파 병행 추출물에서 vanillin 을 검출하지 못한 결과를 미루어 보아 vanillin 성분이 고압에 견디지 못하여 구조가 쉽 게 변형되거나 파괴된 것으로 사료된다 .

9. Scanning electron microscope (SEM) ^관찰

추출공정에 따른 매자나무 수피의 조직형태 변화를 관찰하 기 위하여 저진공 주사현미경을 이용하여 관찰하였다 (Fig. 8).

A 는 열수 추출물 제조 후의 매자나무 수피조직의 형태로서 표 면조직이 대부분 파괴되지 않고 정상 상태를 유지하고 있는 한편 초음파 , 초고압 , 초고압 및 초음파 병행 추출한 B, C, D ^{에서는 표면조직이 손상} , ^{변형 또한 파괴되어 일반 추출물에}

비해 현저한 차이가 나타났다 . ^{특히 초고압과 초음파 병행 추}

출한 D 에서는 작고 균일한 절편으로 조각나 망상구조로 남아 있음을 확인할 수 있는데 , 이는 고압 처리시 생성된 압력으로 내부조직을 느슨하게 함으로써 이어서 초음파를 가하여 형성

된 공동현상에 의해 느슨해진 조직을 가일층 변형 , 파괴하여 더욱 많은 절편과 망상구조가 형성된 것을 확인할 수 있었다 .

앞의 활성측정 실험에서 일반 열수 추출물에 비해 초고압 또 는 초음파 추출공정을 통한 추출물의 활성이 더 높은 것으로 볼 때 , 초고압 및 초음파 공정을 통해 추출물의 조직이 파괴 되어 망상구조로 형성하여 매자나무 수피속의 활성물질이 용 매에 따라 쉽게 흘러나오거나 , 극한공정을 통해 생성된 높은 압력과 에너지로 신규물질의 용출도 가능해짐으로써 활성이 증진된 것으로 사료된다 . 또한 초음파 에너지로 인해 매자나

무의 berberine ^{과 같은 독성성분이 변성되거나 파괴되어 독성}

저감 효과가 나타난 것으로 사료된다 . 따라서 본 연구를 통해 초고압과 초음파 병행 추출공정이 활성증진 및 독성저감 효과 가 있음을 확인할 수 있었는데 , 향후 활성 증진의 원인을 찾 기 위해 유효성분에 대한 연구도 수반되어야 한 것으로 사료 된다 .

감사의 글

본 논문은 농촌진흥청 공동연구사업 ( 과제번호 : PJ007479)

의 지원에 의해 이루어졌으므로 이에 감사드립니다 .

Fig. 8.

Morphology observation of

Berberis koreana

bark by SEM (A: water extraction at 100

^℃

, control. B: ultrasonification extraction

for 1 hours at 60

^℃

with water. C: high pressure extraction for 5 minutes at 60

^℃

with water. D: ultrasonification process for 1

hours after high pressure for 5 minutes at 60

^℃

with water).

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