서 론
느타리버섯의 푸른곰팡이병은 균사생장 및 버섯발생기 를 막론하고 감염되어 균사생장 후 불완전세대의 푸른색을 띠는 다양한 병원균에 의해 발생하는 병해로 Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Penicillium(Raper, 1948) 등에 의한 것으로 알려져 있다. 주로 Trichoderma 속에 속하는 곰팡이균에 의해 느타리버섯 균상재배 및 병재배에서 발생 하여 버섯생산량 및 품질에 막대한 피해를 주는 병원균이 다. 푸른곰팡이병, Green mold, Trichoderma disease 등 으로 불리고 있다.
푸른곰팡이병의 병원균인 Trichoderma는 일반적인 작물에서는 발생하는 병원균에 기생하거나 독소, 용해, fungistasis 등의 방법(Dennis와 Webster 1971a, 1971b, 1971c)에 의해 병원균을 사멸시키는 특성을 갖고있어 생물 적 방제의 도구로서 사용하는 이로운 균으로 알려져 있으 며, 주로 버섯병해 방제에 관련한 연구보다는 항균성미생물
및 셀룰로오스 분해효소 생성균 등으로 활용에 관련된 수많 은 연구논문들이 해마다 발표되고 있다. 그 외에 해로운 방 향으로는 인체와 건물, 버섯재배에서는 피해를 주는 균으로 알려져 있다(Cotxarrera, 2002; Elad, 2000; Ejechi, 1997;
Tsror 2001; Viterbo, 2002; Wheatley, 1997).
버섯 병에 관한 연구는 주로 품종 저항성에 대한 것으로는 우리나라의 703, 705호 품종이 양송이의 마이코곤병(유등, 1979, 1981) 등 몇몇의 병원균에 대한 연구가 되어 왔으며, 외국에서는 90년 중반 이후부터 양송이 부패병(Verticillium fungicola) 병원포자의 자실체 갓표면 접종에 의한 품종 간 병저항 구분방법(Mamoun, 1995), 표고버섯재배에서 의 푸른곰팡이병에 대한 품종적 차이와 시험방법(Ohmasa, 1995), 양송이의 푸른곰팡이병원균 Trichoderma hazianum biotype4에 대한 품종별 저항성 검토 결과 Hybrid 백색계통 은 수량감소가 96%, Hybrid-off 백색계통은 56~73%, 갈 색품종은 8~14% 수확량의 감소(Anderson, 2000)를 보였 다는 보고들이 있다. 그러나 느타리버섯의 재배역사가 매 우 짧고 초창기의 재배과정에서 푸른곰팡이병을 발생시켰던 병원균들은 병원성이 매우 약해 방제약제보다는 소석회의
느타리버섯 푸른곰팡이병 저항성 실내검정 방법의 개발
전창성*,윤형식,이찬중,공원식,정종천,장갑열 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 버섯과
Development of Effective Screening Method for Resistance of oyster mushroom to Trichoderma disease in vitro
Chang-Sung Jhune*, Hyung-Sik Yun, Chan-Jung Lee, Won-Sik Kong, Jong-Chun Cheong, Kab-Yel Jang
Mushroom research Division, Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural & Herbal Science, RDA, Suwon 441-707, Korea,
(Received August 10, 2011, Revised August 17, 2011, Accepted August 23, 2011)
ABSTRAC: Trichoderma disease of oyster mushroom has not been effectively detected in the field for testing its resistance against the disease with its varieties. In this study, we investigated the methods to detect its resistance in the laboratory by using media, which enables us to understand the relevant characteristics (e.g., lysis, toxin enzyme, mycelial growth rate). In coculturing with strains of Trichoderma and oyster mushroom, it is possible to observe the difference in the resistance of oyster mushroom against Trichoderma with the phenomena of barrage reaction, overgrowth and lysis. We also observed the inhibition of mycelial growth of oyster mushroom using the dilution method with 48-well plate, but could not observed the inhibition of mycelial growth using the filter paper method of cultural supernatant. In simultaneously culturing both Trichoderma and oyster mushroom, it was possible to detect the inhibition of the mycelial growth of oyster mushroom, but Trichoderma mycelium did not overgrow against oyster mushroom. We found that the pathogenicity was efficient in using solid medium with the phenomena of overgrowth and lysis by inoculating Trichoderma on top of mycelia of oyster mushroom. In conclusion, the methods (e.g., coculture method, dilution method with 48-well plate, post-inoculation method) are recommended to detect the resistance of oyster mushroom against Trichoderma disease.
KEYWORDS : Myelial growth, Oyster mushroom, Trichoderma sp.
* Corresponding author <[email protected]>
생장과 자실체의 생장에 미치는 환경요인이 다양하고 복잡 하여 버섯균의 저항성 유무를 확인하기가 어려운 상태이다.
따라서 실내 한천배지 상에서 푸른곰팡이균의 저해 유무를 확인할 수 있는 실내에서 검정할 수 있는 시험방법을 검토 하여 농가 보급 품종에 대한 저항성의 판단유무가 가능 및 적용여부를 검토한 결과를 보고하고자 한다.
재료 및 방법
시험방법및공시균주
병원균의 특성별 느타리버섯균 균주의 저항성 유무를 효 과적으로 잘 판단 할 수있는 시험방법으로 느타리버섯균과 푸른곰팡이균의 대치배양, 배양여액을 이용한 저지원판법, 분리형 petri dish을 이용한 방법, 느타리버섯 균사배양 후 병원균 접종 방법을 사용하고, 느타리버섯은 육성 대표품종 에 대하여 시험을 수행하였다.
대치배양
대치배양법은 PDA배지를 사용하여 petri dish의 가장자 리에 느타리버섯균을 접종하여 4일간 배양하고 반대의 끝부 분에 푸른곰팡이균을 접종한 후에 1-2일 간격으로 느타리 버섯균과 푸른곰팡이균의 균사생장정도와 대치선 발생 유 무, 푸른곰팡이균의 버섯균에 대한 over growth(OG), 대치 과정에서 발생하는 특이적인 현상 등을 조사하였다.
배양여액
배양여액을 이용한 시험에서는 PD배지에 푸른곰팡이균 주를 4일간 배양하여 0.27㎛ 여지에 여과하여 멸균하였고, 저지원판법에 활용할 배양여액 희석농도를 정하기 위하여 0, 5, 10, 50 배액으로 검정용 희석 배양여액을 준비하였으 며, petri dish당 6개의 멸균된 항생물질 검정용 Filter paper disk(8mm)를 가장자리에 놓고, 그 위에 0.2ml 씩 배양여액 을 처리하였으며, 여지가운데에 느타리버섯균을 접종하여 저지원의 형성정도를 조사하였다. 그러나 이 방법은 효율 적 방법이 되지 못하여 48 wellplate를 이용하여 배양여액 을 0, 0.1, 0.3 0.5, 0.7, 0.9 1.0ml를 각각의 cell에 넣고 그 곳에 총 1ml가 되도록 0.27㎛ 필터에 여과한 PD배지를 첨
17균주를 접종한 다음 비닐테이프로 밀봉하여 배양하여 느 타리버섯균주의 생장정도를 조사하여 푸른곰팡이균에 의한 fungistasis의 효과의 의한 느타리버섯의 균주별 저항성 검 정가능성을 확인하였다.
배양후접종
배양후 병원균 접종법은 느타리버섯 공시균주를 15일간 배양하여 완전히 자란 느타리균사 위에 배양된 병원균 균주 의 4mm 직경의 균총을 접종하여 균사의 용해정도와 over growth의 정도를 조사하였다. 각각의 시험에서는 푸른곰팡 이 균주의 침투정도와 Lysis의 가능성을 조사하였다.
결과 및 고찰
대치배양
느타리버섯균에 대한 발생 빈도가 높은 푸른곰팡이병원균 별로 대치배양에 따른 형태적 특징을 구분해보면 다양한 다 른 형태를 나타난다 (Fig. 1, 2). T. longibrachitum은 대치현 상이 뚜렷하며, 접종 20일후에는 느타리버섯균의 활력 좋으 면 느타리균이 아주 서서히 over growth 되는 증상이 발생 할 수 있으며, T. hazianum은 초기에는 T. longibrachitum과 유사하나 Trichoderma virens는 대치선이 형성되지 않으며, 후기에 느타리균의 over growth 현상보다는 푸른곰팡이균이 over growth되었다. 이런 결과들은 느타리버섯 균주에 의한 저항성유무에 따른 것이기보다는 병원균의 종류에 따라 다
T. virens T. longibrachitum
Fig. 1. characteristic of pathogens by co-cultures
양한 증상들이 나타나고 있으며, 다양한 증상에 따른 각기 다른 병원성 검정방법이 필요할 것으로 판단되었다.
이런 품종에 따른 경향들과 대치현상을 잘 표현할 수 있 다면 느타리버섯 병저항성의 정도를 판단할 수있는 가능성 이 있을 것이라고 판단되며, 더욱 많은 느타리와 푸른곰팡 이병원균의 균주에 대한 대치배양 시험이 수행된다면 저항 성 유무를 실내검정 통해서도 간단히 판단할 수 있는 방법 이 개발될 것으로 판단된다.
배양여액
푸른곰팡이병원균을 액체배양하여 0.27㎛ 여과지에 여과 하고 농도별로 희석하여 Fig. 3와 같이 petri dish의 가운데에 검정용 느타리버섯균을 접종하고 가장자리에 일정간격으로 petri dish당 6개씩 항생물질 검정용 Filter paper(8mm)를 놓고 그 위에 배양여액을 0.2ml씩 떨어뜨리고 저지원의 형 성정도를 조사 결과.
Fig. 3에서와 같이 초기에는 약간의 느타리버섯균의 억 제효과가 있는 듯하였으나 후기에는 over growth되었다.
이러한 결과는 푸른곰팡이병원균이 분비하는 Toxin에 의한
억제효과가 없거나, 여지에 접종한 Toxin성분이 배지에 확 산되어 효과가 없는 것으로 판단되어, 배양여액을 이용한 저지원판법은 효과적인 저항성 판정방법으로 사용할 수 없 었다. 그러나 이 방법을 well plate에 배양여액을 PD배지 로 희석하고 그곳에 분쇄 느타리버섯 균사체를 0.05ml씩 접종하여 시험한 결과에서는, Fig. 4와 같이 억제되는 정도 가 버섯균과 푸른곰팡이균의 종류와 희석 농도에 따라 다 르게 나타나 well plate를 이용한 방법은 매우 효과적인 것 으로 판단되었다.
Fig. 4.에서는 배양기간 초기에는 균사생장의 억제정도가 다양하게 구분이 되나 억제정도를 명확히 구별할 수 없으며, 후기에는 억제정도의 구분이 차이가 확실하게 구분이 가능 하나 처리간의 정도의 차이를 구분하는 데에는 비효율적이 다. 그러므로 조사시기는 2회에 걸쳐 조사하므로서 정확한 저항성에 필요한 자료가 가능할 것으로 판단된다.
Fig. 5에서와 같이 균사생장이 억제된 것과 정상인 균 사체의 형태적 특징은 현미경상에서의 형태적 특징은 차 이가 없는 것으로 확인되었다. well plate를 이용한 배양 여액을 방법으로 버섯 균사체의 균사생장정도를 수치화
co-culture line over growth lysis
Fig. 2. The appearance of co-culture with mushroom and pathogens
Fig. 3. inhibition zone test of oyster mushroom with culture filtrate
first stage after stage
하는 것은 가능하였으나, 육안적 관찰에 의한 방법은 개 인차에 의한 편차가 심할 것으로 판단되어 균사활력을 검 정하는 방법으로 종양, 독성물질, 활성정도를 조사하는 데 에 사용하는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5- diphenyltetrazoliumbromide)를 활용하여(최, 1999; 이, 1997; 한, 1999; 지, 2000) mitocondria dehydrogenase활 성효소를 yellow tetrazolin 반응하여 purple formazon 변 하는 기작을 이용하여 정량화하려고 하였으나 시험결과는 Figure 6에서와 같이 색깔도 puple보다는 훨씬 진한 흑청 색으로 변하며, 변색시간은 일반적으로 4시간이 소요된다 고 하였으나 12시간이 소요되었으며, 적갈색으로 변화되었 던 purple formazon이 Fig. 6과 같이 균사체에 달라붙어 효 소 활성도를 측정하는 데에는 실패하였다.
분활petridish
분리형 petri dish를 이용하여 푸른곰팡이병원균이 발생 하는 가스에 의하여 생장이 억제되는 효과를 보기 위하여
시험을 한 결과, Fig. 7 에서와 같이 대개는 푸른곰팡이균 이 petri dish의 분리벽을 넘어 버섯균을 over growth하였 으며, 극히 일부의 균주에서는 느타리버섯균이 생장하여 petri dish 분리벽을 넘는 경우도 있어 효과적이지 못하였 다. 따라서 fungistasis 효과는 확실하게 나면서 푸른곰팡 이균 생장의 억제정도를 효율적으로 판단할 수 있는 개선 된 방법이 필요하였다.
배양후접종
느타리버섯 배양후에 푸른곰팡이균을 접종하여 생장여부 를 검정하는 방법은 Fig. 8에서 보는 바와 같이 Lysis, over growth, Lysis+over growth의 3가지의 형태로 나타나며, 이 시험방법은 포장에서 종균접종후 느타리버섯균이 표면에 어느 정도 생장이 되고 난 다음에 후기감염에 의한 저항성 정 도를 구분하는 데에 매우 효과적인 방법으로 생각되었다.
푸른곰팡이병원균에 대한 저항성 판단방법으로 시험한 4가지 시험법인 대치배양법, wall plate 활용 배양여액법, 배양후 접종방법 등 은 느타리버섯의 저항성을 판단하는 기 준으로 사용가능 할 것으로 판단되지만 시험하는 과정에서 느타리버섯과 푸른곰팡이균의 활력관계에서 상당한 차이를 나타내었고, 반복 간에 차이가 클 뿐만 아니라 시험에 사용 하는 시기에 따라 사용하는 균의 활력이 다르다면 일정한 결과를 얻을 수가 없으며, 또한 느타리버섯을 배양하는 과 정에서 접종원 상태에 따라 엄청난 차이가 있다는 것을 확 인하였다. 특히 느타리버섯 ASI 2172 경우에는 균총의 직 Fig. 4. inhibition test of well plate of oyster mushroom with culture
filtrates
Fig. 5. Mycelial morphology of oyster mushroom with the culture filtrates of Trichoderma
Trichoderma by MTT.
Fig. 7. effect examination of fungistasis by 2 section petri- dish(green mold oG, mushroom oG)
경이 6-7Cm 정도의 활력이 좋은 접종원을 사용한 것과 균 사생장이 완료되고 오랫동안 보관 배양한 균사체를 접종한 것은 4-5cm이상의 균사체 생장의 차이를 보임으로서, 실 내에서의 저항성균주의 판정은 접종원의 정확한 관리 즉 접 종원의 활력을 얼마만큼 균일하게 유지하는냐에 따라 결정 될 수 있음을 알 수 있었다.
푸른곰팡이병원균의 Toxin, Lysis, Fungistasis, Hyper- parasite 등의 발병 기작에 따른 저항성 검정방법을 시험해 본 결과(Fig. 9), 각 시험방법들의 개선해야할 문제점들은 배양여액을 이용한 방법에서는 저항성정도를 계량화 할 수 있는 방법을 개발해야만 육안 검사에 의한 문제점을 개선될 수 있을 것이라고 생각되며, 또한 대치배양법에서 간혹 반
복간의 차이가 나타나는 것은 느타리버섯균과 병원균의 접 종원의 미세한 활력차이에 의해 나타나는 것으로 추측되어 접종원 활력의 균일화에 신경을 써야할 것으로 판단되며, 대치거리를 조사는 하는 과정에서 Fig. 9에서와 같이 표면 에서의 대치거리도 중요하지만 이면에서 볼 수 있는 침입 양상도 정확히 판단하여야 함은 물론, 느타리버섯균이 over growth 된다고 하여 무조건 병원성이 없는 것으로 판단하 여서는 안된다. 배양 후 접종에 따른 증상 중에서 균주에 따 라 lysis와 over growth의 특성을 나타내는 경우에는 각각 에 나타난 증상에 대한 평가를 어떻게 할 것인가의 평가기 준을 설정해야 하고, 느타리버섯을 over growth 하는 푸른 곰팡이 균주는 육안적으로 감염된 부위를 정확히 판단하기 가 곤란하므로 선명한 over growth를 나타낼 수 있는 방법 을 고안해야 할 것이다.
저항성을 구분하는 방법에서는 over growth 되는 것은 병원균의 병원성이 강하거나 느타리버섯균이 감수성일 때 에 나타나는 증상으로 보이며, 특정의 균주가 대치되었을 때에는 그 느타리버섯균은 저항성이 강하거나 병원균이 병 원성이 약한 것으로 판단하면 가능할 것이며, 대치배양에 서 대치선 형성부위에 lysis 현상이 나타나는 것은 느타리버 섯균이 저항력은 있으나 병원균이 별도의 병원학적 특성인 lysis의 능력이 있는 것으로 판단된다.
적 요
느타리버섯 푸른곰팡이병에 대한 품종 저항성은 포장에 서 효과적인 검토가 불가능하여 한천 배지상에서 푸른곰팡 이균이 균을 저해하는 특징 fungistatic, lysis, toxin enzyme 등에 대한 각각의 특성을 실내에 검정할 수있는 방법을 검토 하기 위하여 균사생장과 특이 현상을 조사하였다.
대치배양에서는 느타리버섯 균주에 따라 대치선 형성 위치, 푸른곰팡이균의 느타리균사 생장부분 위로 생장
over growth over growth + lysis lysis
Fig. 8. effect of green mold on myceium growth of oyster mushroom
Co-culture remainder culture solution
2 section petri dish inoculation after culture Fig. 9. Method of resistance test of green mold
팡이균이 버섯균 생장 부분 위로 덮어 효과검정이 불가능 하였다. 버섯균을 petri dish 전체에 배양한 후 그 위에 병 원균의 균총을 접종하는 방법은 overgrowth, lysis등의 현 상이 발생하여 병원성의 검정이 용이하였다. 실내에서의 느 타리버섯균의 푸른곰팡이병에 대한 저항성 검정은 대치배 양, 배양여액법, 생장후 접종법에 의한 방법으로 가능한 것 으로 판단되었다.
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