미더덕의 생리활성이 향상된 아임계수 추출물의 제조
조민지․한지경․성수창․이승철 경남대학교 식품영양생명학부
Preparation of Subcritical Water Extract with Improved Physiological Activity of Styela clava
Min-Ji Jo, Ji-Kyoung Han, Su-Chang Sung, and Seung-Cheol Lee Division of Food, Nutrition and Biotechnology, Kyungnam University
ABSTRACT For diverse application of Styela clava (Korean name: miduduck) as a food material, subcritical water (SCW) extract was prepared and its physiological activity was evaluated. To accomplish this, S. clava powder (0.1 g) was placed in a stainless vessel containing 10 mL of distilled water, after which SCW extraction was carried out at 50, 100, 200, and 300°C for 10, 30, and 60 min. SCW treatment significantly increased important physiological properties of the extract such as angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity, antioxidant activity, and acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity. The highest ACE inhibitory activity was found in samples subjected to SCW extraction at 200°C for 60 min; however, the activity decreased at higher temperature (300°C). The SCW extract of S. clava prepared at 300°C for 30 min showed the highest antioxidant activity [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging activities] and AChE inhibitory activity. These results indicate that SCW extraction might be a useful method for increasing the physiological activity of S. clava.
Key words: Styela clava, subcritical water, extract, physiological activity
Received 17 August 2018; Accepted 18 October 2018
Corresponding author: Seung-Cheol Lee, Division of Food, Nutri- tion and Biotechnology, Kyungnam University, Changwon, Gyeong- nam 51767, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-55-249-2684
서 론
미더덕(Styela clava)은 해양 무척추동물로서 우렁쉥이 와 같은 미색류에 속하는 부착 생물이다. 그 모습이 더덕과 닮아 미더덕이라 불리며 우리나라 전 연안에 서식한다.
1999년에 경상남도 마산만 진동면 연안의 일부 해역에 미더 덕 양식면허가 인가됨으로써 전국 생산량의 70% 이상이 이 지역에서 생산되고 있으며, 마산의 대표적인 지역 특산물로 알려졌다. 미더덕은 특유의 독특한 향으로 된장찌개나 찜의 재료로 이용되고 있다. 미더덕은 불포화 지방산과 필수 아미 노산을 다량 함유하며(1), 항산화, 항고혈압, 항암 등의 생리 활성에 대한 연구가 수행되었다(2-7). 이러한 기능을 바탕 으로 미더덕이 첨가된 어묵(8), 술(9), 김치(10), 간장(11) 등의 식품개발이 이루어졌으나, 아직은 단순한 가공품만 제 조, 판매되고 있는 실정이다.
미더덕을 활용한 고부가가치의 상품이 개발되기 위해서 는 미더덕으로부터 생리활성이 높은 추출물의 제조가 필요 하다. 일반적으로 식품 소재로 활용되는 유용물질의 추출에
는 물과 에탄올을 이용한다. 물은 주로 친수성 물질만을 추 출하는 한계가 있으며, 에탄올은 친수성 물질과 소수성 물질 을 같이 추출할 수 있지만 유기용매로써 추출 후에 제거해야 하며 환경에 친화적이지 않은 단점이 있다. 이와 같은 추출 용매의 한계를 극복하기 위하여 아임계수를 이용한 추출이 제시되고 있다. 물의 끓는점인 100°C와 임계점인 374°C 사이의 고압 상태의 물을 아임계수(subcritical water)라 지 칭한다. 아임계수 상태에서는 물의 극성이 감소하여 유기용 매와 비슷한 성질을 가짐으로써 다양한 물질을 추출할 수 있는 친환경적인 용매로 작용한다(12). 또한 아임계수는 에 스테르 결합, 에테르 결합, 펩타이드 결합 등의 공유결합을 분해할 수 있어 유용물질의 유리화에도 유리하다(13). 이와 같은 장점으로 아임계수는 수박(14), 잎새버섯(15), 느타리 버섯(16), 차가버섯(17), 감귤박(18), 갈근(19) 등으로부터 생리활성이 우수한 유용물질의 추출에 이용되었다.
따라서 본 연구에서는 아임계수를 미더덕에 적용하여 다 양한 조건에서 추출물을 제조하고 그 생리활성을 분석함으 로써 미더덕의 고부가가치 추출물로써 활용 가능성을 제시 하고자 한다.
재료 및 방법
시약
Acetylcholinesterase(AChE), acetylthiocholine iodide, L-ascorbic acid, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazo- line-6-sulfonic acid)(ABTS), captopril, 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH), 5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB), eserine, hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL), rabbit lung acetone powder는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 기타 시약 및 용매는 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
미더덕의 아임계수 추출물 제조
미더덕은 2015년 6월 미더덕영어조합법인(Changwon, Korea)으로부터 제공받았다. 미더덕을 증류수로 세척하고 껍질 부위를 제거한 후, 가식부(육질 부위)를 -70°C의 Deep freezer에서 하루 동안 동결시켰다. 동결 미더덕은 동결건 조기(Freeze Dryer FD 5512, Ilshin Lab Co., Seoul, Ko- rea)로 건조 후 분쇄기(HBL-3500S, Samyang Electronic Co., Gunpo, Korea)로 작은 입자로 만들고 25 mesh 체에 걸러 균질화하였다.
건조 미더덕 분말(0.1 g)을 10 mL의 증류수와 함께 스테 인리스 관(14×1 cm2)에 넣고 뚜껑으로 단단히 막은 후 원하 는 온도의 고온 가마(Daeil Engineering, Seoul, Korea)에 방치하였다. 추출 온도는 50, 100, 200, 300°C로 조절하였 고 추출 시간은 각각 10, 30, 60분으로 설정하여 추출하였 다. 이때 스테인리스 관의 내부 압력은 0.002~5 MPa이었 다. 추출 후 스테인리스 관을 고온 가마에서 꺼내어 실온에 서 30분간 냉각하였으며, 추출한 시료는 여과지(WhatmanⓇ No. 3, GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire, UK)로 1차 여과한 후, 미세 여과지(AdvantecⓇ membrane filter 0.2 μm, Advantec MFS, Inc., Dublin, CA, USA)를 통과한 여과액을 -70°C에 저장하면서 필요 시 꺼내어 분석에 이용 하였다. 또한 이 여과된 추출물을 동결건조 하여 무게를 측 정하여 수율을 구하였다. 각 생리활성 분석의 경우에는 미더 덕 아임계수 추출물을 증류수로 10배 희석하여 시료로 이용 하였다.
Angiotensin-converting enzyme(ACE) 저해능
ACE 저해능은 Cushman과 Cheung(20)의 방법에 따라 측정하였다. 먼저 50 mM sodium borate buffer(pH 8.3) 20 mL에 1 g의 rabbit lung acetone powder를 4°C에서 24시간 동안 교반한 후 5,000×g에서 10분간 원심분리 하 여 ACE 조효소액을 얻었다. 미더덕 아임계수 추출물 시료 50 μL에 ACE 조효소액 50 μL를 가하여 37°C에서 10분간 방치한 후 25 mM HHL 100 μL를 첨가하여 37°C에서 60분 간 반응시켰다. 여기에 1 M HCI 250 μL를 가하여 30초간 교반하여 효소 반응을 중지시킨 후 원심분리(4°C, 10분,
5,000×g) 하여 상징액 200 μL를 얻었다. 이 상징액을 80°C 에서 30분간 완전히 건조시켜 증류수 1 mL에 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 를 가하여 실험하였으며, 양성대조군으로 captopril을 사용 하였다. ACE 저해능은 다음 계산식을 이용하여 구하였다.
ACE 저해능(%)＝
(
1－ 시료첨가구의 흡광도)
×100무처리구의 흡광도
DPPH 라디칼 소거능
DPPH 라디칼 소거능은 Jeong 등(21)의 방법에 따라 미 더덕 아임계수 추출물 시료 0.1 mL에 0.041 mM DPPH 용액 0.9 mL를 가한 후 상온에서 30분간의 암반응을 거쳐 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.
DPPH 라디칼
소거능(%) ＝
(
1－ 시료첨가구의 흡광도)
×100무처리구의 흡광도
ABTS 라디칼 소거능
ABTS 라디칼 소거능은 Pellegrini 등(22)의 방법에 따라 측정하였다. 미더덕 아임계수 추출물 시료 100 μL에 0.1 M의 phosphate buffer(pH 5.0) 125 μL와 10 mM의 hy- drogen peroxide 10 μL를 가하고 이 혼합물을 37°C에서 5분간 예비반응을 시켰다. 이 반응물에 1.25 mM의 ABTS 15 μL와 peroxidase(0.25 U/mL)를 30 μL 넣고 다시 37°C 에서 10분간 반응시킨 후 405 nm에서 Multiplate Reader (Sunrise RC/TS/TS Color-TC/TW/BC/6Filter, Tecan Austria GmbH, Grodig, Austria)를 이용하여 흡광도를 측 정하였다. 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 다음 계산식을 이용하여 구하였다.
ABTS 라디칼
소거능(%) ＝
(
1－ 시료첨가구의 흡광도)
×100무처리구의 흡광도
AChE 저해 활성
AChE 저해 활성 측정은 acetylcholine iodide를 기질로 사용하는 Lee 등(23)의 방법을 변형하여 측정하였다. 미더 덕 아임계수 추출물 시료 90 μL에 DTNB 용액(39.6 mg of DTNB and 15 mg of sodium bicarbonate dissolved in 10 mL phosphate buffer pH 7.7) 175 μL를 넣고 혼합하 여 AChE(0.2 U/mL) 20 μL를 가하여 25°C에서 5분간 반응 시킨 후, 기질(10.85 mg of acetylthiocholine iodide in 5 mL of phosphate buffer) 15 μL 넣고 25°C에서 30분간 반응하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으 로 eserine을 사용하였으며, 아래의 식을 이용하여 AChE 저해 활성을 계산하였다.
AChE 저해
활성(%) ＝
(
1－ 시료첨가구의 흡광도)
×100무처리구의 흡광도
Table 1. Extraction yield of extracts from subcritical water ex- tracts from Styela clava (unit: %)
Temperature (°C)
Time (min)
10 30 60
50 100 200 300
27.91) 32.6 46.8 72.6
46.9 53.1 80.0 82.0
27.4 46.9 79.5 61.4
1)Each is average value of 3 different experiments.
b a c
a
b a
a a b
a
a a
0 10 20 30 40 50 60 70
50 100 200 300
Temperature (oC) ACE inhibitory activity (%) . 10 min
30 min 60 min
Fig. 1. Angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activ- ity of subcritical water extracts from Styela clava. Each value is mean±SD. Values with different letters (a-c) above the bars in each extraction temperature are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
통계처리
모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 그 결과 SPSS software(Ver. 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하고, 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하 여 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검정하였다.
모든 처리값의 차이는 신뢰 수준 95%(P<0.05)로 비교 분석 하였다.
결과 및 고찰
미더덕 아임계수 추출물의 수율
각 조건에서의 미더덕 아임계수 추출물의 수율을 Table 1에 나타내었다. 대체로 추출 온도와 무관하게 추출 시간이 30분이었을 때 비교적 높은 수율을 나타내었다. 또한 같은 추출 시간일 때는 온도가 증가함에 따라 수율이 증가하는 경향을 보였으나, 300°C에서는 감소하였다. 아임계수는 온 도가 증가할수록 유전상수가 감소하여 소수성 물질의 추출 도 증가시키고 일부 공유결합도 분해하여 추출 수율을 향상 시킨다(13). 그러나 추출된 물질들이 식는 과정에서 엉키어 서 여과되지 못할 가능성이 높다. Han 등(24)은 홍합의 아임 계수 추출물을 제조하였을 때에도 300°C, 60분 추출물에서 수율이 감소한다고 보고하여 본 결과와 동일한 추출 경향을 나타내었다.
ACE 저해능
체내에서 ACE에 의해 생성된 angiotensin Ⅱ는 동맥 혈 관을 수축하여 혈압을 상승시키고, 부신에서 aldosterone 의 분비를 촉진하여 신장의 나트륨 및 수분의 재흡수를 증가 시킴으로써 고혈압 발병에 관여한다(20). 따라서 ACE의 저 해능을 측정하여 고혈압 억제의 소재 발굴에 이용하고 있다.
희석한 미더덕 아임계수 추출물의 ACE 저해능을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 추출물의 ACE 저해능은 추출 온도가 높아질수록 증가하다가 200°C, 60분 추출물에서 59.35±4.31%로 가장 큰 활성을 보였으며, 300°C 추출물에 서는 30분까지는 활성이 증가하였으나 60분에서 급격히 감 소하여 13.88±0.85%를 나타냈다. 이는 미더덕으로부터 유 래한 ACE 저해능 물질이 200°C에서 잘 추출되지만, 300°C 의 장시간 조건(60분)에서는 불활성화, 분해, 또는 엉킴 등 의 다양한 이유로 소실되는 것으로 추정된다. 100°C에서
60분간 추출한 경우(11.32±2.06%)보다 200°C에서 60분 간 추출하였을 경우(59.35±4.31%) ACE 저해능은 5.2배 증가하였다.
시기별로 채취한 미더덕의 항고혈압능을 조사한 연구(7) 에서 4월의 미더덕의 육질 부위만을 25°C로 24시간 동안 교 반 추출한 결과 5 mg/mL의 농도에서 ACE 저해능이 54.93
±1.72%로 나타났다. 본 연구에서 10 mg/mL 농도로 아임 계 장치를 이용하여 200°C에서 60분간 추출한 경우 80%
수율로 최종 농도가 8 mg/mL이며, 이를 10배 희석(0.8 mg/
mL)하여 측정한 결과 ACE 저해 활성이 59.35±4.31%였 다. 한편 대조구인 captopril은 0.2 μg/mL의 농도에서 41.62
±0.77%의 활성을 보였다.
이상의 결과는 적절한 조건의 아임계수가 짧은 시간 내에 매우 효과적으로 미더덕의 ACE 저해능을 가진 물질을 추출 할 수 있음을 의미한다. 식품 소재의 ACE 저해능은 주로 펩타이드에 의해 발생하며(25), 단백질이 가수분해되었을 때 효과가 큰 것으로 보고되었다(26). 따라서 아임계수 조건 에서 미더덕 단백질이 가수분해되어 생성된 펩타이드에 의 해 ACE 저해능이 증가하였음을 유추할 수 있으나 추후 보완 연구가 필요하다.
항산화능
미더덕 아임계수 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능으로 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 미더덕 아임계 수 추출물은 300°C, 30분에서 가장 높은 활성(34.70±0.13
%)을 나타내었으며, 50°C, 10분에서 가장 낮은 활성(5.34±
0.25%)을 나타냈다. 100°C에서 30분간 추출한 경우(9.38
±0.33%)보다 300°C에서 30분간 추출하였을 경우(34.70±
0.13%) DPPH 라디칼 소거능은 3.7배 증가하였다. 한편 대조 구로 사용한 L-ascorbic acid는 60 μg/mL 농도에서 84.96
±0.23%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거능은 주로 지용성 물질의 항산화능을 측정하는 데에 반해 ABTS 라디칼 소거능은 지용성, 수용성
c c c b
a
a b
a a b
b b 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
50 100 200 300
Temperature (oC) DPPH radical scavenging . activity (%) .
10 min 30 min 60 min
Fig. 2. DPPH radical scavenging activity of Styela clava extracts.
Each value is mean±SD. Values with different letters (a-c) above the bars in each extraction temperature are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
c
c c c
a
b a a
b
a
b b
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
50 100 200 300
Temperature (oC) ABTS radical scavenging . activity (%) .
10 min 30 min 60 min
Fig. 3. ABTS radical scavenging activity of Styela clava extracts.
Each value is mean±SD. Values with different letters (a-c) above the bars in each extraction temperature are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
b b b
b
a
a b a
a
a
a b
0 10 20 30 40 50 60 70
50 100 200 300
Temperature (oC)
AChE inhibition activity (%) . 10 min
30 min 60 min
Fig. 4. Acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity of Styela clava extracts. Each value is mean±SD. Values with different letters (a,b) above the bars in each extraction temperature are sig- nificantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.
항산화 물질 모두를 측정하는 데 유용한 항산화능 측정 방법 이다. 극성, 비극성의 성질을 모두 가지는 아임계수의 특징 이 추출물의 항산화 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아 보기 위해 미더덕 아임계수 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 을 측정하고 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 아임계수 처리 온도가 증가할수록 미더덕 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 이 증가하여 300°C, 30분 추출물이 98.13±0.09%로 가장 높았다. 100°C에서 30분간 추출한 경우(38.09±0.69%)보 다 300°C에서 30분간 추출한 추출물의 ABTS 라디칼 소거 능은 2.6배 증가하였다. 대조구로 사용한 L-ascorbic acid 는 20 μg/mL 농도에서 87.94±0.14%의 ABTS 라디칼 소 거능을 보였다.
미더덕을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 물로 각각 18시간 동안 추출하여 DPPH 라디칼 소거능을 분석하였을 때 아세톤>
에탄올> 메탄올 순으로 라디칼 소거능을 보였으나, 물 추출 물에서는 매우 낮은 활성을 나타낸다고 보고한 바 있다(5).
본 연구에서도 ABTS 라디칼 소거능의 결과는 DPPH 라디 칼 소거능과 비교하였을 때 월등히 높은 활성을 보였으며,
이는 미더덕에 존재하는(또는 분해된) 항산화 물질이 수용 성보다는 지용성의 성질을 띠는 것이 우선하고, 아임계수는 이들 물질의 추출물의 항산화능 활성에 수용성 물질과 지용 성 물질 모두가 관여하였음을 알 수 있다.
AChE 저해 활성
인지기능 저하는 콜린성 신경세포 퇴화에 의한 acetyl- choline(ACh)의 부족이 주원인 중 하나로 알려져 있다. ACh 은 신경의 자극을 전달하는 화학물질로 신경세포에 존재하 며, 신경말단에서 분비되어 자극의 전달을 마친 ACh은 AChE에 의해 분해된다. AChE의 과도한 증가는 ACh의 감 소로 이어지게 되고 이로 인하여 인지능력이 감소한다(27).
따라서 AChE 저해 활성은 인지기능 개선과 관련된 소재 발굴에 이용된다. 본 연구에서 제조한 미더덕 아임계수 추출 물의 AChE 저해 활성을 Fig. 4에 나타내었다. 추출 온도가 높을수록 AChE 저해 활성은 증가하여 300°C, 30분의 추출 조건에서 57.79±1.21%로 가장 높았으며, 이는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
100°C에서 30분간 추출한 경우(11.99±0.50%)보다 300
°C에서 30분간 추출하였을 경우(57.79±1.21%) AChE 저 해 활성은 4.8배 증가하였다. 양성대조군인 eserine은 10 μg/mL 농도에서 54.88±0.36%의 AChE 저해 활성을 나타 내었다.
저자들이 조사한 바로 지금까지 미더덕의 AChE 저해 활 성이 보고된 경우는 없으며 본 연구에서 처음 보고된다. 특 히 300°C, 30분 또는 60분의 아임계수 조건에서 AChE 활 성이 급증하는 것은 이 조건에서 추출될 수 있는 물질이 함 유되어 있거나 이 조건에서 펩타이드 결합, 에테르 결합 등 의 공유결합이 분해되어 활성을 가진 물질이 추출되기 때문 으로 추정된다. 300°C, 30분에서 추출한 경우 수율이 82.0%
이고(Table 1), 이는 앞에서 서술한 바와 같이 희석 배율을 고려하면 0.82 mg/mL의 농도에서 측정한 결과로 향후 어떤 물질에 의한 것인지 이에 관한 보완 연구가 필요하다.
Table 2. Correlation between angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activity (IA), DPPH radical scavenging activity (RSA), ABTS RSA, and acetylcholinesterase (AChE) IA
ACE
IA DPPH
RSA ABTS
RSA AChE IA ACE IA
DPPH RSA ABTS RSA AChE IA
1 0.637 1
0.530 0.812 1
0.366 0.781 0.930 1 Correlation is significant at P<0.01.
상관관계 분석
미더덕 아임계수 추출물로 분석한 ACE 저해 활성과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 그리고 AChE 저해 활성 간의 상관관계를 분석하여 Table 2에 나타내었 다. 항고혈압능을 분석한 ACE 저해 활성과 나머지 실험과 의 상관계수는 DPPH 라디칼 소거능(0.637), ABTS 라디칼 소거능(0.530), AChE 저해 활성(0.366) 순으로 매우 낮았 다. 항산화 활성 정도를 의미하는 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능 간의 상관계수(0.812)는 비교적 높았 으며, ABTS 라디칼 소거능과 AChE 저해 활성 간의 상관계 수가 0.930으로 가장 높은 값을 보였다. 이러한 결과는 각각 의 생리활성 간의 연관성을 시사한다.
요 약
미더덕의 이용 다변화를 위하여 아임계수 추출물을 제조하 고 생리활성을 평가하였다. 미더덕은 동결건조 분말 상태로 10, 30, 60분 동안 다양한 온도(50, 100, 200, 300°C)에서 추출되었다. 아임계수 조건은 ACE 저해 활성, 항산화 활성, AChE 저해 활성과 같은 중요한 생리학적 특성을 상당히 증가시켰다. 200°C, 60분 추출물에서 가장 높은 ACE 저해 활성을 나타냈으나 더 높은 온도 조건인 300°C에서는 급격 히 감소하였다. DPPH 라디칼 소거능과 ABTS라디칼 소거 능은 300°C, 30분 추출물에서 공통적으로 가장 높은 값을 보였고, AChE 저해 활성 또한 같은 경향을 나타냈다. 이러 한 결과는 아임계수 추출이 미더덕의 생리활성을 증가시키 는 유용한 가공방법이 될 수 있음을 시사한다.
감사의 글
이 논문은 2017년 해양수산부 재원으로 한국해양과학기술 진흥원의 지원을 받아 수행된 연구(해역별 특성을 고려한 전통수산가공식품 개발 및 상품화)의 일부입니다.
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