사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 오 상 석 이화여자대학교 식품공학과. 1. 연구개요 1.1 연구의 목적 2008년 9월 중국에서 분유의 단백질 함량을 높이기 위하여 유해물질인 melamine을 고의적으로 첨가하여 이를 섭취한 영유아들에게 이상 증상이 발견되면서 melamine에 대한 우려가 국제적으 로 확산되었다. 미국에서는 melamine의 함량 분석 시 melamine뿐만 아니라 ammeline, ammelide, cyanuric acid 등과 같은 유사체들도 함께 melamine 총량으로 정하고 있는데 비하여 국내에서는 melamine만을 분석하고 있다. 이러한 분석 결과가 식품의 수출입시 차이를 나타낼 수 있으므로 melamine 유사 물질들에 대한 조사와 식품 가공 공정 중에 원료나 첨가물에서 melamine이나 그 유 사체들 또는 신종 유해 물질이 대사산물로 생성될 가능성이 있는지에 대한 조사가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 melamine과 그 유사체들의 작용기작에 대한 조사와 식품 제조, 가공 중에 melamine 유사체를 비롯한 신종유해물질이 대사산물로 발생할 수 있는지에 대한 조사, 나아가서는 발생원인 및 저감화 방안과 Gap analysis를 제시하는 것을 목적으로 한다.. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 59. 59. 2012-04-12. 11:20:01.

(2) 1.2. 연구의 필요성 식품안전에 대한 관심 및 분석기술 등의 발달로 신종유해물질들이 지속적으로 발견되고 있다. 중 국에서 단백질 함유량을 과장하기 위해 의도적으로 melamine을 첨가한 분유로 인해 문제가 발생된 후 (Kirti and Manish, 2010) melamine의 유해성에 관한 연구가 진행되어져 현재는 각 국가별로 허 용기준이 정하여져 있다. 하지만 국가별 분석방법의 차이로 인하여 melamine의 분석치가 다른 결 과를 초래할 수 있어 수출입시 문제가 발생할 가능성이 있으므로 melamine과 그 유사체들에 관한 특성과 작용기작에 대한 체계적인 조사가 필요하다. 또한 melamine 유사체들이 melamine과 결합 하여 유해물질을 생성할 가능성도 있으므로 식품의 제조 가공시 가열, 산, 염기에 의해 melamine 과 그 유사체들이 생성될 수 있는지에 대한 조사가 필요하다. 식품안전에 대한 관심과 기대수준이 높아짐에 따라 식품 중 신종유해물질들을 사전 예측하여 관리할 필요성이 대두되고 있으므로 이에 대한 지속적인 연구가 필요하다. 지금까지 밝혀진 대표적인 신종유해물질은 식품제조가공 중 식품 성분과 반응하여 자연적으로 생성되는 것으로 벤조피렌, 퓨란 등이 있으며, 식품의 제조, 가공을 할 때에 필요에 의해서 첨가 또는 혼합 사용하는 첨가물들이 식품 중의 다른 성분과 반응하여 생성되 는 경우도 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 melamine과 그 유사체들과 제조, 가공 공정 중에 발생 할 수 있는 신종유해물질에 대한 조사 연구가 필요하다.. 60. 2012. .indd 60. 2012-04-12. 11:20:01.

(3) 2. 연구 세부 내용 1.1. 멜라민(Melamine) 멜라민의 특성 (1) 물질특성 멜라민은 cyanic acid를 생산하는 중간 단계의 요소로부터 상업적으로 합성된 유기 염기로, 1834 년 독일인 화학자 Justus von Liebig에 의해 처음 합성되었다. 멜라민이라는 용어는 ammonium thiocyanate의 증류 유도체를 뜻하는 Melam과 염기성 작용기인 Amine으로부터 유래 되었다. Melamine의 IUPAC 명칭은 1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine이며, 분자량 126.12 g/mol, 비중 1574 kg/m3 인 백색 고체이다. 멜라민은 분자 내에 3개의 아민 작용기(-NH3)를 가지고 있어 수용액은 약한 염기성을 띄며 분자 내에 6개의 질소 원자를 가지고 있어 전체 분자량 중 질소가 분자량의 66% 를 차지한다. 멜라민은 그 화학구조상에 많은 질소를 가지고 있다(그림 1).. Fig 1. 멜라민의 구조. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 61. 61. 2012-04-12. 11:20:02.

(4) 멜라민은 다음의 전구체를 가지고 있다.. ① Trichloromelamine Trichloromelamine는 분해되어 멜라민을 생성한다. 미국에서는 식품 가공 장치 (우유 탱크 또는 장비를 제외한 조리기구와 다른 식품 접촉 물품)에 세척 용매로 사용이 규제되었다. Trichloromelamine의 구조는 다음과 같다(fig 2).. Fig 2. Trichloromelamine의 구조 구조. ② Cyromazine 농약의 cyromazine의 대사산물로 멜라민이 생성된다. Cyromazine은 과일과 채소의 표면에서 오 랜 시간이 지나면 멜라민으로 전환된다. Cyromazine의 구조는 다음과 같다(fig 3).. Fig 3. cyromazine의 구조. 62. 2012. .indd 62. 2012-04-12. 11:20:02.

(5) (2) 생성경로 멜라민은 요소, dicyandiamide, hydrogen cyanide 등 다른 초기물질로부터 생산될 수 있으나, 가 장 최근에는 요소를 이용하여 melamine을 산업적으로 제조하고 있다.. 6(NH2)2CO → C3H6N6 + 6NH3 + 3CO2. 또, Calcium cyanamide가 dicyandiamide로 전환되고, 융점 이상으로 가열시 멜라민이 생성된다. 요소가 흡열반응에 의해 cyanic acid와 ammonia로 분해된다.. (NH2)2CO → HCNO + NH3. 그리고 cyanic acid의 중합반응으로 인해 멜라민과 이산화탄소가 형성 된다.. 6HCNO → C3H6N6 + 3CO2. 멜라민의 제조과정 중에는 시아뉼산, 아멜린, 아멜라이드 등 멜라민 유사체가 불순물로 생성된다. 그리고 살충제인 시로마진(cyromazine)을 포유동물이 섭취했을 때 대사체로 멜라민이 생성되며 식 물에서 또한 시로마진은 멜라민으로 전환된다고 보고되었다.. (3) 대사경로 멜라민은 체내에서 대사되지 않고 빠르게 소변으로 배설되는데, 멜라민 배출의 생체 내 반감기는 약 3시간 정도로 보고되어 있다(Jeong et al., 2006; Baynes et al., 2008). 실험용 흰쥐의 경우 24시 간 내에 melamine의 90% 정도가 소변으로 배설되었고, 24시간 이후에는 신장과 방광에만 잔류하 였다(Mast et al., 1983). Melamine은 박테리아에 의해 대사되면서 ammeline, ammelide, cyanuric acid로 전환되어 진다(fig 4).. (4) 독성 멜라민의 치사량(보통 사용 동물의 50%를 죽이는 데 필요한 실험 물질의 양, LD50)은 다음과 같다.. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 63. 63. 2012-04-12. 11:20:02.

(6) LD50oral, rat = 3,161 mg/kg LD50oral, mice = 3,296 mg/kg LD50dermal, rabbit > 1,000 mg/kg. 쥐에 10-100g/day 또는 식이의 3% (30,000ppm) 정도로 다량 투여하면 melamine rystalluria, 신증후군, 출혈성 방광염, 신부전이 발생하여 7-31일 내에 쥐가 사망하였다 (Mast et al.,1983). 또한, 13주에 걸친 쥐 독성실험에서 방광 결석의 NOEL (no-observed-effect-level)은 63mg/kg/ day(OECD, 1998)이었다. Melamine 방광 결석의 분석에 의해 melamine과 요산, 또는 단백질 속의 melamine, 요산 및 인으로 방광결석이 구성되어 있다는 것이 밝혀졌으며(Ogasawara et al., 1995; OECD 1999), 장기간 투여하는 경우 신실질의 만성 염증과 허혈성 손상, 번식력 감소, 태아 독성이 관찰되었고, 결석이 발생한 수컷 rat에서 transitional cell carcinoma가 발생하였다(Melnick et al., 1984; Ogasawara et al., 1995).. Fig 4. 박테리아에 의한 멜라민의 주요 대사 경로 (Daniel et al., 1997). 64. 2012. .indd 64. 2012-04-12. 11:20:02.

(7) 멜라민의 유사체 멜라민의 유사체로는 아멜린(Ammeline,C3N6H6), 아멜라이드(Ammelide,C3H4N4O23), 시아뉼산 (Cyanuric Acid,C3H3N3O3)이 있다.. (1) Cyanuric acid (1,3,5-triazine-2,4,6-triol) ① Cyanuric acid의 물질 특성 멜라민의 deaminated 유도체이며, 반추 동물사료의 보존제, 수영장에서의 안정제, 제초제, 염색 제, 수지 등으로 사용된다. Oxytriazine melamine 유사체로 멜라민 생성 시 부산물로 생성되는 것 으로 추정되고, USA에서는 반추동물의 사료등급 biuret의 성분으로 30%까지 허용하고 있다. 수영 장에서 물의 소독을 위해 사용된 sodium dichloroisocyanurate는 chlorine과 cyanurate의 형태로 가 수분해된다.. Fig 5. cyanuric acid의 구조. ② 독성 Cyanuric acid의 치사량(LD50)은 다음과 같다. LD50oral, rat > 10,000 mg/kg LD50dermal, rabbit > 7,940 mg/kg. Cyanuric acid는 포유류에서 낮은 급성 독성을 보이고, 여러 아만성 경구 독성실험에서 Cyanuric acid는 세뇨관 팽창(dilatation of the renal tubules), 괴사(necrosis), 상피관 과형성(hyperplasia of the tubular epithelium), basophilic tubules 증가, neutrophilic infiltration, mineralization and fibrosis를 동반한 신장조직파괴 (renal tissue damage)를 일으키는데, 이것은 세뇨관에 생긴 cyanuric. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 65. 65. 2012-04-12. 11:20:02.

(8) acid의 결석에 의한 것으로 보인다. 이 증상의 NOAEL(no-observe-effect-level)은 150mg/kg/day 이다(OECD 1999). 인체에서는 투여량의 98%가 대사되지 않은 채로 24시간 내에 소변으로 배설된 다(Allen et al., 1982).. ③ 멜라민과 Cyanuric acid의 수용성 Table 1과 같이 melamine과 Cyanuric acid의 수용성은 각각 3,240mg/L, 2,000mg/L을 나타내고 있으나, melamine과 cyanuric acid 결합 화합물인 melamine cyanurate는 2.2 mg/L의 매우 낮은 수 용성을 나타낸다. 이러한 낮은 수용성에 따른 시너지 효과로 인하여 높은 독성을 나타내는 것으로 추정된다.. Table 1. 멜라민과 멜라민 유사체의 구조와 수용성(mg/L) (Dobson et al., 2008). Compound. Water Solubility (mg/L). Melamine. 3240. Cyanuric acid. 2000. Ammeline. 75. Ammelide. 77. Melamine Cyanurate. 2. ④ 멜라민 - Cyanuric acid의 결합 화합물의 독성. Fig 6. 멜라민과 Cyanuric acid의 결합 구조. 66. 2012. .indd 66. 2012-04-12. 11:20:03.

(9) Cyclic imide과 유사한 구조를 가진 생체분자들과의 작용은 흔히 발생한다. Uracil, riboflavin, barbituric acid, uric acid의 각 imide group은 melamine과 상호작용하여 self-associating complex 의 형태를 이룬다. Melamine과 cyanuric acid (melamine 합성의 부산물)에 함께 노출되는 경우에 는 이들이 그림6과 같이 결합하여 낮은 농도(각 0.2%)에서도 결정을 형성한다. 이와 같은 경우에 동물의 70%에서 급성 신부전증이 발생하였다(Melnick et al., 1984; Ogasawara et al., 1995). 이러 한 melamine과 cyanuric acid의 결합은 여러 개의 수소 결합(fig 6)으로 이루어져 있다(Dobson et al., 2008).. ⑤ 멜라민과 cyanuric acid 혼합 사용 시 독성(Combined toxicity) 멜라민과 cyanuric acid를 동시에 섭취하였을 경우 Malamine cyanurate 결정을 형성한다. 이는 요로 결석, 급성신부전 발생의 원인이 된다. 멜라민이 오염된 사료 섭취 후 개와 고양이가 이상증 세를 보였고(Brown et al., 2007), 고양이 식이에서 멜라민과 cyanuric acid를 증가시키면 신부전 증 및 신장결석이 증가하였다(Brown et al., 2007; Puschner et al., 2007). 쥐 식이에서 melamine, ammeline, ammelide를 단독 사용 시 신장에의 영향이 없었지만, 혼합 사용시 심각한 신부전증과 네프론(nephrons)에서 결석을 야기하였다(Dobson et al., 2008).. (2) Ammelide Melamine 합성의 부산물로 생성되는 monoamino-유사체이다.. Fig 7. Ammelide의 구조. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 67. 67. 2012-04-12. 11:20:03.

(10) (3) Ammeline Melamine 합성의 부산물로 생성되는 diaminooxytriaxine 유사체이다.. Fig 8. Ammeline의 구조. 발생현황 (1) 국외 ① 호주 멜라민의 LOR은 1mg/kg, cyanuric acid의 LOR는 1 또는 10mg/kg 이다. 85개 샘플의 melamine 농도는 LOR-163mg/kg보다 낮았고, cyanuric acids는 LOR을 넘는 샘플은 존재하지 않았다. 정부 당국이 시행한 실험에서는 오스트리아 부근에서 생산된 30가지의 원유에서는 1.0 mg/kg 을 넘는 melamine은 검출되지 않았다. LC-MS/MS방법을 사용한 주요 226개의 샘플의 LOR은 1mg/kg 이고, 두 개의 달걀 알부민 샘플 에서 각각 melamine이 11, 12 mg/kg로 LOR을 초과, 유럽 마늘에서는 0.7mg/kg로 LOR 미만을 나 타냈다.. ② 뉴질랜드 영유아 조제식, 비스킷, 유제품 및 사탕을 포함하는 대부분의 샘플에서 melamine 함유량은 LOR(1mg/kg)을 넘지 않았고, 비스킷 2개 제품은 3.7 및 20 mg/kg의 농도의 melamine이 함유, 밀 크캔디는 180 mg/kg의 melamine과 1.4 mg/kg의 cyanuric acid를 포함하고 있었다. 우유 드링크 제품 3개에서 각각 0.7, 3.3, 그리고 9.0 mg/kg의 농도의 melamine이 검출되었고,. 68. 2012. .indd 68. 2012-04-12. 11:20:03.

(11) 조제식 1개 제품은 cyanuric acid만 0.49 mg/kg 포함, 버섯 통조림에서는 비료나 cyromazine의 사 용에서 비롯된 것보다 초과한 양인 17 mg/kg의 melamine 잔여물이 검출되었다.. ③ 일본 일본은 여러 가지 제과류, 당과제품, 스낵, 가공 식품 및 dried whole egg 제품에서의 melamine 검사결과 검출된 melamine의 양은 0.5-41 mg/kg, frozen dairy-based 디저트, 크로아상 그리고 호 박 번 (pumkin bun) 에서 높은 수치의 melamine이 검출되었다. Dried whole eggs에서 검출된 melamine 농도는 2.8-4.6 mg/kg, 후라이드 치킨에서는 1.6 mg/kg, 냉동 문어 타코야끼에서는 0.6-1.6 mg/kg의 melamine이 검출되었다.. ④ 중국 중국산 총 74개의 제품과 수입산 341개의 제품을 포함한 415개의 분유를 LC-MS/MS 방법으로 분 석하였다(Chen & Kang, 2008). 오염 사건에 연루되었던 두 개의 우유 제품에서 비교적 높은 수치 의 melamine이 검출(312±33mg/kg), cyanuric acid는 거의 검출되지 않았다. “X-company”(under two brand names)에서 67개의 우유 분말 샘플을 검사한 결과 94% 인 63 개의 샘플에서 0.28 ± 0.17 mg/kg의 melamine이 검출되었다. 서로 다른 브랜드의 우유 5개 제품 중 2개 제품에서 평균 0.57 ± 0.57 mg/kg의 melamine이 검출되었다. 중국에서 제조된 분유의 98.5% 가 melamine 양성 반응을 보였지만, 중국 이외의 국가에서 제조된 분유 341개를 분석한 결과 melamine이 검출되지 않았다. 중국산 탄화수소암모늄과 dry mix에 쓰이 는 non-diary creamer 제품 중 1개 제품에서 3726.8-20700 mg/kg에서 melamine이 검출, 이외 제 품에서는 745.2-5500mg/kg의 melamine이 검출(Kuo & Kang, 2008)되었다. 말레이시아 신문은 두 개의 비스킷 브랜드에서 사용된 47개의 탄화수소암모늄 샘플을 검사한 결 과 18개의 제품에서 33.4-508 mg/kg의 melamine이 검출되었다고 보도(BERNAMA, 2008)했다. BFDA는 탄화수소암모늄 샘플에서 말레이시아 정부결과와 유사한 70-80 mg/kg의 melamine이 검출했고, 중국과 대만의 지방 보건 당국은 1590-2470 mg/kg의 melamine이 검출된 탄화수소암모 늄 샘플을 추가적으로 제출했다. AQSIQ(General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine)가 유제품 내 멜라민 함유량 조사 결과 발표(Chan et al., 2008; EFSA, 2007; WHO, 2008a; WHO, 2008b)했다.. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 69. 69. 2012-04-12. 11:20:03.

(12) 당시 영유아 분말 조제식을 생산하고 있는 109개 업체, 491 batch의 샘플 시험결과, 22개 업체의 69 batch에서 0.09-2563 mg/kg의 멜라민이 검출. 생유 시험결과, 5개 업체 중 3개 업체의 1202 batch 중 24개가 melamine에 오염되었으며, 최대 8.6 mg/kg 을 함유(Chan et al., 2008). 총 154개 중 20 개 업체에서 2008년 9월 14일 이전에 생산한 265개 중 31개 lot에서 melamine이 검출, 최대 6196mg/ kg 검출했다(Chinese Centre for Disease Control and Prevention, unpublished data, 2008). 중국 정부는 joint emergency notice를 발행(AQSIQ, the Ministry of Industry and Information Technology, the Ministry of Commerce, the Ministry of Health, the State Administration for Industry and Commerce and the State Food and Drug Administration) (AQSIQ, 2008b) 중국 내 유제품 회사들에 게 2008년 9월 14일 이전에 생산한 모든 유제품의 melamine 유무를 검사할 것을 요구. 최근, AQSIQ 는 17개 지역, 78개 브랜드에서 2008년 9월 14일 이후 생산한 영유아 분말 조제식 1507 batch (1645 batches2)의 조사 결과, 모든 샘플이 정부가 임시적으로 정한 멜라민 허용 기준치보다 낮게 나타났 다(AQSIQ, 2008d). 25개 지역 내 182개 브랜드에서 2008년 9월 14일 이후에 생산한 영유아 조제식 이 아닌 분유 2175 batch (2310 batches)의 시험결과, melamine 허용기준치를 넘지 않는 것으로 조 사. AQSIQ는 28개의 주요 원유 생산 지역 내 52개 도시의 시장에서 2008년 9월 14일 이후 생산된 액상 우유제품 197개 브랜드의 11231 batches (12209 batches)를 수거하여 조사한 결과, 허용 기준치 를 넘지 않는다고 보고했다(AQSIQ, 2008c). Beijing과 Gansu 지방에서 온 Sanlu 영유아 조제식 111개 샘플 중 87개에서 평균 1212 mg/kg (<0.05-4700 mg/kg)의 melamine이 검출됐고(Chinese Centre for Disease Control and Prevention, unpublished data, 2008), Gansu 지방의 Sanlu 제품 52개 샘플에서 평균 melamine (1673.6 mg/kg), cyanuric acid (1.6 mg/kg), ammeline(1.7 mg/kg) 및 ammelide(2.9 mg/kg)가 검출됐다. 2008년 melamine을 첨가해 단백질 함유량을 조작한 Sanlu 그룹의 분유를 섭취한 영유아에서 신 결석을 비롯한 이상 증상이 발생하여 사회적 문제가 되기 시작하며(정경환, 2009; Kirti and Manish, 2010) Sanlu 그룹에서 생산된 분유에는 2.563g/kg의 melamine 분말이 함유되어 있고 이 분유 를 섭취한 영유아는 약 52,857명에 이르며 이 중 99.2%가 3세 미만인 것으로 알려졌다. 중국 정부는 52,857명의 어린이가 신장합병증으로 치료받았으며, 그 중 적어도 4명은 melamine이 함유된 영유 아 조제식과 유제품이 직접적 사인으로 작용하였다고 밝혔다(Chan et al, 2008; WHO, 2008b). 이 후, 신장합병증을 보인 어린이가 290,000명에 이르며, melamine이 함유된 제품이 사망에 직접적인 영향을 준 것은 적어도 6명이라는 비공식적인 응답이 있었다(Chinese Ministry of Health, personal. 70. 2012. .indd 70. 2012-04-12. 11:20:03.

(13) communication, 2008).. ⑤ 캐나다 465개의 샘플의 melamine 오염여부를 분석결과, 대부분 (92%) 의 샘플의 melamine 함량은 LOR (1mg/kg) 보다 낮게 나타났다. Health Canada(2008c)는 melamine의 baseline 설정을 위해 80개의 영유아조제식품을 분석했고, 영유아 조제식 80개 중 60개에서 melamine이 검출됐고(구입 제품:0.0043-0.346 mg/kg, 소비된 제 품:0.00053-0.0689 mg/kg), 우유 또는 우유 성분을 포함한 242개의 샘플에 대하여 추가조사를 시 행한 결과, CFIA의 Health Hazard Alert로 회수 조치된 밀크캔디(7.29 mg/kg)에 비해 낮은 범위에 서 검출(0.00435-0.282 mg/kg). 아시아 시장의 액상커피, 밀크티(0.039-0.282 mg/kg)와 농축 우유(0.0176-0.0325 mg/kg)에서 melamine의 함량이 가장 높았다.. ⑥ 미국 44개의 가정에서 조제된 이유식에 대하여 melamine과 cyanuric acid 결과를 제출했다. 샘플은 GC-MS (LOQ 2.5 mg/kg), LC-MS LIB No.4421(Turnipseed et al., 2008) (LOQ 0.25 mg/ kg) or LC-MS LIB No. 4422, version 1(Smoker & Krynytsky, 2008) (LOQ 0.2 mg/kg)로 분석했 고, 멜라민은 일부 제품에서 양성(0.137-0.206 mg/kg)이었지만, 대부분 LOQ (0.25 m g/kg) 이하 로 검출되었으며, cyanuric acid는 유아식 1개 제품에서 0.245- 0.249 mg/kg 검출, 13개의 샘플 추 가 분석 결과 melamine과 그 유사체가 검출되지 않았고, 1428개의 추가 샘플 분석 결과, melamine < LOQ-1817mg/kg, cyanuric acid < LOQ-3.62mg/kg 정도로 검출됐다. 중국에서 수입한 베이커리 제품과 애완동물, 돼지, 가금류 사료의 melamine 및 melamine 유도 체를 시험한 결과, melamine과 cyanuric acid가 기준치보다 높은 농도로 검출, 가금류 사료에서 는 cyanuric acid만이 검출되었고(표 2)(US FDA, 2009), 애완동물용 사료를 섭취한 개와 고양이 약 500마리에서 신장 이상이 발견되었으며, 그 중 14마리가 사망했다. 사료를 제조하는데 사용된 중국 산 밀 글루텐(wheat gluten) 및 쌀 단백질(rice protein)에 멜라민이 고농도 존재하는 것을 확인했다 (Associated Press, 2007).. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 71. 71. 2012-04-12. 11:20:03.

(14) Table 2. 중국으로부터 수입되는 식품과 사료 중 멜라민과 멜라민 유사체 검출량 (US FDA, 2009) food/feed. melamine/analogues. concentration detected (mg/kg). melamine. 9.4-1952. cyanuric acid. 6.6-2180. ammeline. 3.0-43.3. ammelide. 6.0-10.8. melamine. 10.6-59.6. cyanuric acid. 1.8-146.3. ammeline. 1.2-24.9. ammelide. 20.1. melamine. 30-120. cyanuric acid. 6.6-22.5. ammeline. 5.6-10.8. ammelide. 33.6-43.2. melamine. Negative. cyanuric acid. 2.11-2.63. ammeline. Negative. ammelide. 13.9. pet food. bakery meal samples. swine feed samples. poultry feed samples. ⑦ 유럽연합 (EU) The European Commission은 현재 소속 국가 (오스트리아, 키프로스, 체코, 에스토니아, 핀란드, 독일, 헝가리, 이탈리아, 라트비아, 슬로바키아, 스웨덴, 영국, 노르웨이) 의 정부에서 관리하는 다 양한 제품에서 melamine 발생에 관한 데이터를 제출했고, 555개 샘플의 melamine 시험 결과, 0.05 ~ 259 mg/kg 이하로 검출되었고, 높은 melamine 함량을 나타낸 샘플은 제과(초콜릿, 캔디)이었다.. a) 영국 (Food Standard Agency, FSA) 우유 또는 우유 성분을 포함하는 합성 식품 21개에서 melamine이 높게(3.3-259 mg/kg) 검출되었. 72. 2012. .indd 72. 2012-04-12. 11:20:03.

(15) 고(UKFSA, 2008), 초콜릿과 밀크 캔디 같은 제과제품의 melamine 농도는 3.3-259 mg/kg(n=17), 비스킷과 쿠키의 melamine 농도는 4.2-11 mg/kg(n=4) 로 검출되었다.. b) 프랑스 (Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments, AFSSA) 우유 성분이 함유된 아시아 샘플 56개의 melamine을 시험 결과, 5개 제품의 melamine이 LOQs 이상이었으며, 3개의 White Rabbit candy 샘플에서 각각 2, 52, 290 mg/kg, 2개의 crispy 샘플에서 5.30 mg/kg의 melamine이 검출되었다.. (2) 국내 99%의 대부분의 유제품과 육류 및 달걀 제품이 LOQ(limit of quantification; 0.1mg/kg)에서 melamine이 검출되지 않았고, melamine 양성반응은 egg powder(whole egg powder: 0.84-4.00 mg/kg; egg white powder: 1.30-2.50 mg/kg; egg yolk powder: 0.11mg/kg)과 liquid egg yolk(0.48 mg/kg) 제품에서 나타났다. 10개 락토페린 샘플의 HPLC 분석 결과, 2개 샘플(1.9, 3.3 mg/kg)에서 LOQ(1 mg/kg) 이상의 melamine이 검출됐고, 제과용 팽창제인 탄화수소암모늄의 샘플에서 603 mg/kg의 melamine이 검출됐다. 또한, 탄화수소암모늄를 포함한 스낵 샘플에서는 18.1 mg/kg의 melamine이 검출됐다.. 국제 기준 규격 TDI (Tolerable Daily Intake)는 그 지역의 음식 소비 습관과 대상 인구집단을 고려하여 설정한 기준이다. 이것은 특정 식품이 건강에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 가능성을 증가시키는 멜라 민 오염 수치에 대한 지표를 세운 것이다. 한사람이 하루에 섭취할 수 있는 멜라민의 ‘tolerable amount’를 계산하기 위해서는 대상 인구집단의 평균 몸무게를 고려해야 하고, 하루에 섭취하는 각 음식의 양 또한 고려해야 한다.. (1) 국외 ① EU 유럽식품안전청이 설정한 TDI 기준 0.5 mg/kg body weight을 고려하였을 때, 50 kg의 사람이 하. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 73. 73. 2012-04-12. 11:20:03.

(16) 루에 섭취가능 한 멜라민 양은 25 mg이다. 이 사람이 하루에 1 L의 우유를 마신다고 가정하면, 1 L 당 25 mg의 멜라민이 들어있는 우유를 마시게 되면 TDI 수치에 도달하게 된다. 이 수준은 위험도 (level of concern)로 간주된다. 5 kg 유아의 경우 멜라민의 ‘tolerable amount’는 2.5 mg/day 이 다. 이는 Melamine이 3.3 mg/L (ppm) 정도 오염된 유아조제식품을 750 ml 섭취하였을 때 도달할 수 있는 양이다. 이러한 유럽 EFSA의 TDI (0.5 mg/kg bw/day)는 cyanuric acid 2년 독성시험을 근 거로 요결석에 대한 NOAEL 154 mg/kg bw/day와 불확실성 계수 300(10 : 종간차이, 10 : 개체차이, 3 : melamine과 cyanuric acid의 복합독성 및 독성상승효과)을 적용하여 산출된 값이다. 멜라민은 식품 접촉물질들(melamine-formaldehyde plastic, can coating, paper &board, adhesive 등)이 식품과 접촉하면서 생겨난다. 현재 유럽 연합에서 법적으로 정해진 플라스틱 용기의 melamine specific migration limit (SML)은 30 mg/kg food 이다. 그러나 최근에 식품접촉물질로부 터 노출된 멜라민의 SML은 다시 재고되어 지고 있는 상황이다. 현재, 멜라민의 모든 노출원을 고려 하여 WHO에서 설정한 멜라민의 TDI는 0.2 mg/kg b.w. 이다. (WHO, 2008)(EFSA, 2010). ② 미국 영유아 조제식품의 경우에 멜라민 유사체인 ammeline, ammelide, cyanuric acid를 포함하여 1 ppm 이하로 관리되고 있고, 기타 식품의 melamine 기준은 2.5 ppm 이하로 관리되고 있다.. ③ 캐나다 멜라민과 cyanuric acid가 같이 영유아 조제식, 단독영양제품, 식사대용제품에 0.5 ppm 이하, 영 유아 조제식이 아닌 우유를 원료로 하는 기타 식품에는 2.5 ppm 이하로 관리하고 있다.. ④ 호주/뉴질랜드 유제품, 유제품 유래 성분 함유 식품에서 2.5 ppm 이하, 영·유아식에서 1 ppm 이하로 관리하 고 있다.. ⑤ 중국 유제품에서 2.5 ppm 이하, 영·유아식에서 1 ppm 이하로 관리하고 있다.. 74. 2012. .indd 74. 2012-04-12. 11:20:03.

(17) ⑥ 홍콩 유제품에서 2.5 ppm 이하, 영·유아식에서 1 ppm 이하로 관리하고 있다.. Table 3. 국가별 멜라민 및 멜라민 유사체 관리기준(식약청 위해분석연구과 보고서, 2009. 12). 국가/기구. 한국. 멜라민 및 그 유사체. 멜라민. 멜라민 미국. 관리기준(mg/kg). ·특수용도식품 중 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식, 기다 영·유아식, 특수 의 료용도 식품 등 ·「축산물의 가공기준 및 성분규격」에 따른 조제분 유, 성장 기용 조제우유, 기타조제분유, 기타조제 우유. 불검출(검출한계 : 0.5 ppm). 상기 제품 이외의 모든 식품 및 식품첨가물. 2.5 ppm 이하. 식품. 2.5 ppm 이하. 아멜린 아멜라이드 시 영·유아식 아뉼산. 1 ppm 이하. 멜라민 시아뉼산. 유제품. 2.5 ppm 이하. 영·유아식, 단독영양제품, 식사대용제품. 0.5 ppm 이하. EU. 멜라민. 유제품. 2.5 ppm 이하. 호주 뉴질랜드. 유제품, 유제품 유래 성분 함유 식품. 2.5 ppm 이하. 멜라민 영·유아식. 1 ppm 이하. 유제품. 2.5 ppm 이하. 캐나다. 중국. 멜라민 영·유아식 유제품. 홍콩. 1 ppm 이하 2.5 ppm 이하. 멜라민 영·유아식. 1 ppm 이하. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 75. 75. 2012-04-12. 11:20:03.

(18) (2) 국내 현재 한국에서는 EU, 호주, 뉴질랜드, 중국 홍콩과 마찬가지로 멜라민 관리 기준인 2.5 ppm만 설 정되어 있고, 멜라민 유사체에 대한 정보는 포함되어 있지 않은 실정이다(KFDA, 2009). 멜라민은 가열, 산, 염기 등 가공 공정에서 유사체인 ammeline, ammelide, cyanuric acid를 생 성한다. 멜라민은 그 자체로서의 독성보다는 그 유사체인 cyanuric acid와 결합하여 melaminecyanuric acid crystal을 형성함으로써 독성이 급격히 증가한다. 따라서 식품 내 멜라민을 분석하는 데 있어서 멜라민 및 그 유사체를 포함한 총량을 확인해야 될 것으로 판단된다. 이를 위해서는 멜라 민 및 유사체의 생성경로, 국내 식품 중 멜라민 및 유사체의 총량, 국제 기준규격 등에 대한 지속적 이고 체계적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.. 저감화방안 2008년 중국에서 멜라민 파동이 일어나면서 아시아와 서구 각국 등으로 그 파장이 번져가고 있 으며 이에 따라 식품 안전관리에 대한 업무가 국제적인 공조 아래 이루어져야 한다는 여론이 일고 있다. 유럽연합(EU) 회원국들은 “식품 및 사료 신속 경보 시스템(RASFF)”을 갖추고 1주일 단위 로 위해식품 경보 리스트를 공개하고 있으며, 정확한 분석과 투명한 정보 공개와 예방 대책이 필요 한 실정이다. 멜라민의 경우 극미량일 때 검출하는 것이 어렵고, 그 결과에도 이견의 소지가 많다. 이에 따라 식약청에서는 최근 미국 식품의약국 시험법과 같은 방식으로 시험 가이드라인을 공표했 다. 따라서 정확한 분석과 투명한 정보 공개 그리고 예방 대책이 요구된다. 멜라민을 검사하는 방 법에는 여러 가지가 있다. 또한 멜라민의 경우 산업적으로 생성하고 있는데 멜라민 사건의 경우 의도적으로 유해물질을 첨 가한 것이다. 이 것 뿐만 아니라 비의도적으로 혼입이 될 수 있는데 멜라민이 공업용으로 식기나 식 품 조장재 제조에 널리 쓰이고 있기 때문에 음식이 이런 포장재에 담겨 있을 경우는 자연적으로 멜 라민이 음식에 녹아들 수 있다. 이 경우는 2007년 식약청에서 101건에 대해서 모니터링 결과값이 0.02~0.71ppm으로 수행된 멜라민수지 중 멜라민에 대한 용출시험 결과가 모두 적합하였고, 미국 FDA의 기준인 2.5ppm에도 못 미치는 양인 것으로 알려져 있다. 국내의 경우는 대부분 중국에서 주문자 생산으로 만든 제품, 그리고 중국에서 생산되어 수입된 제 품과 중국산 원료를 들여와 만든 식품에서 멜라민이 포함되어 있음이 드러났다. 또 과자 등 가공식. 76. 2012. .indd 76. 2012-04-12. 11:20:03.

(19) 품뿐만 아니라 양어장 사료, 식용 개 사료 등에서도 멜라민 성분이 확인되었다. 멜라민의 경우는 생 성되는 것보다 의도적으로 첨가하는 부분에서 더 많은 위해가 발생할 수 있기 때문에 정부에서 이 를 관리할 수 있는 방안을 내놓고 있으며 허술한 원산지 표시제를 강화하고, 식품유해업자에 대한 처벌을 강화하겠다는 방침을 내놓고 있다. 이러한 조치들이 멜라민 사태를 줄이는데 기여할 것으로 사료되지만, 아직 멜라민의 저감화에 대한 근본적인 대책은 미흡한 것으로 여겨진다.. 분석기술 멜라민은 액체크로마토그래피(HPLC), 가스크로마토그래피(GC/MSD), LC/MS/MS 방법을 이용해 서 분석하며(식품의약품안전청, 2009), 그 유사체인 Cyanuric acid도 멜라민과 동일한 방법으로 가 스크로마토그래피(GC/MSD), LC/MS/MS를 이용해서 분석한다.. (1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 시험법 (가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 식품 (나) 분석원리 : 시료 중의 멜라민을 아세토니트릴.물(50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석 한다. (다) 장치 ① 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS) ②정 제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것 (라) 시약 및 시액 ① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 ② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 ③표 준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1% 개미산.아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용 액으로 녹여 정확히 100 mL로 한다. ④표 준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 0.1% 개미산.아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준 용액으. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 77. 77. 2012-04-12. 11:20:03.

(20) 로 한다(사용 시 조제한다). ⑤ 0.1% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다. ⑥ 4% 개미산용액 : 개미산 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다. ⑦0 .1% 개미산.아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1% 개미산 용액 5mL에 아세토 니트릴 95 mL를 가하여 100 mL로 한다. ⑧0 .2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토 니트릴을 가하여 100 mL로 한다. ⑨2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다. ⑩2 0 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄(Ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다. ⑪ 기타시약 : 특급 (마) 시험용액의 조제 ①추 출 : 시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL를 가하여 심하게 흔들어 섞고 30 분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤 브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼 화시킨 후 여과한다). ②정 제 : 미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL 를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디 에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감 압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 mL를 4 mL 바이알에 취 하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 0.1% 개미산.아세토니트릴(5:95, v/v) 혼합용 액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. (바) 시험조작 ① 액체크로마토그래프의 측정조건. 78. 2012. .indd 78. 2012-04-12. 11:20:04.

(21) ㉮ 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 ㉯ 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다. 이동상 A : 0.1% 개미산.아세토니트릴(5:95, v/v) 이동상 B : 20 mM 개미산암모늄.아세토니트릴(50:50, v/v). 시간(분). 이동상 A. 이동상 B. 0.0. 100. 0. 5.0. 100. 0. 10.0. 25. 75. 11.0. 25. 75. 13.0. 100. 0. 15.0. 100. 0. ㉰ 유속 : 0.25 mL/분 ㉱ 주입량 : 10 μL ㉲ 칼럼온도 : 35℃ ② 질량분석기/질량분석기의 조건 ㉮ Ionization : ESI (Positive) ㉯ Source voltage : 4.8 kV ㉰ Capillary Temp. : 350℃ ㉱ Auxiliary gas : 질소 ㉲ Collision gas : 아르곤 또는 질소 ㉳ Source collision energy : 15 ~ 30 V ③검 량선 작성 : 표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻 어진 크로마토그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성 한다. ④정 성시험 : 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간 과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 79. 79. 2012-04-12. 11:20:04.

(22) 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백 분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다.. 물 질. Precursor ion(m/z). Fragment ion(m/z). 멜라민. 127. 85 68. ⑤정 량시험 : 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다. ⑥ 계산 - 멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL) V : 시험용액의 최종 부피 (mL) S : 시료 채취량 (g) D : 시험용액의 희석배수 ⑦ 정량한계 : 0.5 mg/kg. (2) 액체크로마토그래피에 의한 시험법 (가) 시험법의 적용범위 : 불검출 기준 적용대상 이외의 식품 (나) 분석원리 : 시료 중의 멜라민을 아세토니트릴.물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온 교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다. (다) 장치 ① 액체크로마토그래프 : 자외선검출기(UV detector)를 사용한다. ②정 제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것 (라) 시약 및 시액 ① 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것 ② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 ③ 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.. 80. 2012. .indd 80. 2012-04-12. 11:20:04.

(23) ④표 준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 물에 녹여 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다. ⑤ 4% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다. ⑥0 .2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아 세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다. ⑦2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하 여 100 mL로 한다. ⑧ 기타시약 : 특급 (마) 시험용액의 조제 ①추 출 : 시료를 분쇄한 후 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30 분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤 브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼 화시킨 후 여과한다). ※동 물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 분쇄한 검체 5 g을 취한 후 물 10 mL를 가하여 습 윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다. ②정 제 : 미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카 트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유 출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2 % 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에 틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압 펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다*. 용출액 2 mL를 4 mL 바이알에 취하 여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. (바) 시험조작 ① 액체크로마토그래프의 측정조건 ㉮ 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것 ㉯ 이동상 : 완충용액.아세토니트릴 (85:15, v/v) 완 충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950mL의 물에. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 81. 81. 2012-04-12. 11:20:04.

(24) 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다. ㉰ 검출파장 : 240 nm ㉱ 유속 : 1.0 mL/분 ㉲ 주입량 : 10 μL ②검 량선 작성 : 표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피 크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다. ③정 성시험 : 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간 과 일치하여야 한다. ④정 량시험 : 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다. ⑤확 인시험 : (1) 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 멜라민 시험법 (바) 시 험조작 ④ 정성시험 또는 (3) 기체크로마토그래피/질량분석기 (라) 시험조작 ② 정성시험 에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 한다. (사) 계산 - 멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL) V : 시험용액의 최종 부피(mL) S : 시료 채취량(g) D : 시험용액의 희석배수. (3) 기체크로마토그래피/질량분석기를 이용한 확인시험법 (가) 장치 ① 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS) (나) 시약 및 시액 ①표 준용액 : (2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (라) 시약 및 시액 ④ 표준용액 을 사용한다. ② 피리딘 : 특급을 사용한다. ③ 유도체시약(BSTFA) : N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide. 82. 2012. .indd 82. 2012-04-12. 11:20:04.

(25) (1% trimethyl-chlorosilane 함유)를 사용한다. (다) 시험용액의 조제 ①추 출 및 정제 : (2) 액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 (마) 시험용액의 조제 ① 추 출 및 ② 정제에 따라 *까지 시험하여 용출액으로 사용한다. ②유 도체화 : 표준용액 및 위의 용출액 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소로 건고한다. 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약(BSTFA) 200 μL를 넣고 마개 를 닫은 후 70℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다. (라) 시험조작 ① 기체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건 ㉮ 칼럼 : DB-5MS(0.25 mm × 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것 ㉯ 주입부 온도 : 250℃ ㉰ 검출기 온도 : 250℃ ㉱오 븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상 승시켜 2분간 유지한다. ㉲ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분) ㉳ 주입방법 : splitless ㉴ 주입량 : 1.0 μL ㉵ 이온화 방법 : EI mode ㉶ 이온화 전압 : 70 V ②정 성시험 : 위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무 름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래표와 같이 확인되 어야 하고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 327 이온에 대한 각 이온의 백 분율, response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다. 물 질. 이 온 342(M). 멜라민. 343(M+1) 344(M+2) 327(M-15). 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 83. 83. 2012-04-12. 11:20:04.

(26) Gap analysis 멜라민은 식품제조·가공에 사용할 수 없는 물질이며 여러 국가 및 국제규격식품위원회(CODEX) 등도 국제적으로 식품에 사용을 허용하지 않는 물질이다. 미국의 경우 FDA에서는 멜라민 및 관련 화합물에 대한 식품 및 사료의 내용일일섭취량(TDI)를 일일 체중 1kg 당 0.63 mg으로, 유럽 식품 안전청은 TDI를 일일 체중 1kg 당 0.5 mg로 적용할 것을 권고하고 있다. 국내의 경우 멜라민수지 를 사용한 식품용기에 대해서 멜라민의 용출규격을 30㎎/ℓ이하로 두고 있으며, EU도 용출규격을 30㎎/㎏으로 두고 있다. 일본과 미국에서는 멜라민에 대한 용출규격을 별도로 규정하고 있지 않다. 현재 미국의 경우는 식품에 관해서는 2.5ppm, 영.유아 조제식품의 경우 멜라민 유사체인 ammeline, ammelide, cyanuric acid를 포함하여 1 ppm 이하로 관리하고 있다. 국내의 경우는 EU, 호 주, 뉴질랜드, 중국 홍콩과 마찬가지로 멜라민에 관한 관리 기준인 2.5 ppm만 설정되어 있고, 멜라 민 유사체에 대한 정보는 포함되어 있지 않은 실정이다(KFDA, 2009). 따라서 멜라민은 그 유사체 인 cyanuric acid와 결합하여 melamine-cyanuric acid crystal을 형성함으로써 독성이 급격히 증가 하기 때문에 식품 내 멜라민을 분석하는데 있어서 멜라민 및 그 유사체를 포함한 총량을 확인해야 될 것으로 판단된다.. 1.2. 퓨란(Furan) Furan의 특성 (1) 물질특성 퓨란은 총칭하여 “furans”라 불리는 퓨란 유도체들의 parent compound로서 클로로포름과 유 사한 냄새가 나는 무색의 휘발성 액체이며 5원자 방향족헤테로 고리화합물(그림9)이다. 퓨란은 일 반적으로 가정에서의 조리 과정이나 식품 제조·가공 중 가열처리 시에 자연스럽게 생성되며 탄수 화물 및 아미노산 등의 열분해 과정이나 지질의 가열 등에 의해 생성되는 유해물질로 커피, 빵, 조 리된 가금류, 카제인 나트륨, 콩 및 통·병조림 식품 등의 가열처리 제품에서 주로 생성된다. 또한 식품의 관능적 성질에 영향을 미치는 화합물로 알려져 왔으며, 미국 FDA(Food and Drug Administration), 캐나다 보건국(Health Canada), 유럽식품안전청 (EFSA, European Food Safety Authority) 에서는 퓨란에 대해 통조림 가공 등과 같이 전형적인 열처리를 하는 동안 형성된다고 여러 연구자. 84. 2012. .indd 84. 2012-04-12. 11:20:04.

(27) 들이 보고하였다. 최근 오염물질에 대한 과학적 분석기술이 발달함에 따라 식품 중에 잔존하는 퓨란을 검출하게 되 었으며, 2007년 SPME-GC/MS 방법으로 퓨란에 대한 모니터링을 실시한 용역연구사업 결과에 의 하면 과거 퓨란은 커피, 통조림 고기, 구워진 빵, 조리된 닭고기 등 몇몇 열처리식품에서만 검출되 었지만, 최근 측정 기술의 발전으로 통조림으로 된 스프, 콩 유아용 식품 등 더 다양한 식품류에서 도 일정농도 수준으로 검출되고 있으며, 가공식품 300건에 대한 모니터링를 실시한 결과, 분석된 식 품 중 가장 높은 퓨란 농도가 검출된 식품군은 육가공 캔통조림이었다. 이렇게 여러 식품에서 퓨란 이 검출되기 시작하였고, 퓨란을 고농도로 투여한 일부동물실험에 의하면 발암성이 있는 것으로 알 려지고 있어 인체의 암 발생에 기여할 가능성이 있으므로 미국의 DHHS(Department of Health and Human Services)의 발암물질 목록에 등재되어 있다. 또한 IARC(International agency for Research on Cancer)에서도 퓨란을 인체 발암 가능 물질로 규정하여 Group 2B로 분류하고 있으며(표 4), 미 국 환경부는 음용수 중 제거되어야 할 물질로 구분하고 있다. (식품의약품안전청, 2006; 식품의약 품안전청 위해예방정책국, (사)한국식품안전연구원 편집). Table 4. 국제 암연구소의 발암물질 분류기준 Group 1. 확인된 발암물질(The agent is carcinogenic to humans). 2A. 인체 발암유력 물질(The agent is probably carcinogenic to humans) 인체 발암 증거가 제한적이거나 부정확하고, 실험동물의 발암 증거는 충분한 경우. 2B. 인체 발암가능 물질(The agent is possibly carcinogenic to humans) 인체 발암 증거가 제한적이거나 부정확하고, 실험동물 발암증거도 충분하지 아니한 경우. Group2. Group 3. 인체 발암성있는 물질로 분류할 수 없는 물질(The agent is not classifiable as to its carcinogenicity in to humans) 인체 및 실험 동물 발암 증거가 제한적이거나 부정확한 경우. Group 4. 인체 비발암성 물질(The agent is probably not carcinogenic to humans) 발암성을 증명할 증거가 부족한 경우. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 85. 85. 2012-04-12. 11:20:04.

(28) Fig 9. 퓨란의 구조. ※ 퓨란은 쓰레기를 태울 때 많이 발생하는 환경오염물질인 다이옥신과 유사한 특성과 독성을 가 진 내분비계 장애물질인 dibenzofuran(통상적으로 “Furan” 또는 “Furan계 다이옥신류”로 불 림)과는 다른 물질이다(식품의약품안전청, 2010).. Fig 10. 다이옥신류. 퓨란계 다이옥신류. (식품의약품안전청, 2010). (2) 생성경로 퓨란 혹은 퓨란 유도체들이 식품 중에 어떤 형태로 존재하는지는 알려져 있지 않다. 하지만 식 품제조 과정에서 아미노산이나 당과 같은 탄수화물을 가열하거나, 비타민C나 다중 불포화 지방산 (polyunsaturated fatty acids, PUFA) 등의 성분이 가열 분해되었을 때, Maillard reaction의 중간 생 성물로서 식품 중에 퓨란이 생성되는 것으로 보고되었다(Julia et al., 2006). 퓨란의 형성경로는 ① 환원당의 열분해와 Maillard reaction 혹은 아미노산의 존재 시 환원당의 열. 86. 2012. .indd 86. 2012-04-12. 11:20:04.

(29) Fig 11. 퓨란의 생성경로((Vranováand Ciesarová 2009). 분해와 Maillard reaction ② 특정한 아미노산의 열분해 ③ 아스코르빈산의 열산화 ④ PUFA의 열산 화 ⑤ 카르티노이드의 열산화가 있다(Yaylayan, 2006). 또한 식품에서 퓨란은 주로 glucose, lactose, fructose와 같은 탄수화물의 열분해로부터 생성되며(Maga, 1979), 미국 FDA에 따르면 다양한 탄수 화물과 아미노산 혼합물 혹은 알라닌, 시스테인, 카제인 등과 같은 단백질, 아스코르빈산, 디하이드 로아스코르빈산, 티아민 등과 같은 비타민들이 식품에서 퓨란을 생성하는데 사용된다. 퓨란의 형성에 관여하는 PUFA의 경우 118℃에서 30분 동안 열처리를 한 모델 시스템을 사용해서 수행한 연구를 보면 리놀렌산과 리놀레산과 같은 다중불포화지방산이 열처리를 통해 퓨란을 형성 할 수 있으며, 리놀렌산의 퓨란 생성 등은 리놀레산보다 4배 더 높다(Becalski and Seaman, 2005). 이러한 지질 과산화물은 불포화지방산(PUFA)으로부터 반응성이 높은 산소에 의해 비효소적으로 생성되거나 lipoxygenase에 의해 효소적으로 생성되며, PUFA 과산화물의 등방성분해 이후 전이금 속이온에 의한 촉매에 의해 2-alkenals, 4-oxo-2-alkenals and 4-hydroxy-2-alkenals를 형성한. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 87. 87. 2012-04-12. 11:20:04.

(30) 다 (Fig 12). 이렇게 생성된 PUFA 과산화물은 계속 분해되어 철이온의 촉매하에 2-alkenals, 4-oxo-2-alkenals, 4-hydroxy-2-alkenals 등이 생성된다. 이 중 4-hydroxy-2-nonenal(4-HNE)과 같이 세포독 성이 강한 4-hydroxy-2-alkenal 화합물들은 단백질, DNA, 지단백질(LDL)의 변화를 야기시킬 수 있는 것으로 알려지고 있다. 이와 같이 퓨란은 4-hydroxy-2-butenal이 환을 형성한 후 물분자가 제거되어 생성되는 것으로 알려져 있으며 세포독성이 강한 4-hydroxy-2-alkenals은 4-hydroxy2-butenal과 같은 과정을 거치면서 독성이 약해지고 휘발성이 강한 퓨란 모체로 전환된다(Carolina and Varoujan, 2004). 아스코르빈산, 트레오닌, α-알라닌과 같은 아미노산들은 퓨란을 형성하기 위해서 당을 필요로 하고, 아스코르빈산이 퓨란을 형성할 가장 높은 잠재성을 가지고 있으며 뒤이어 glycoaldehyde/ alanine > erythrose > ribose/serine > sucrose/serine > fructose/serine > glucose/cysteine이 잠재성 을 가지고 있다(Perez Locas and Yaylayan 2004).. Fig 12. 퓨란 형성의 지방 산화 경로(Perez and Yaylayan, 2004). 또한 2005년, 아스코르빈산과 그것의 유도체들로부터 퓨란의 형성이 보고되었고, 덧붙여 퓨란이 높은 온도에서 PUFA의 산화로부터 형성될 수 있으며, 상업적으로 이용되는 항산화제를 추가할 경 우 70%까지 퓨란의 형성을 감소시킬 수 있다(Becalski and Seaman 2005).. 88. 2012. .indd 88. 2012-04-12. 11:20:05.

(31) (3) 대사경로(식품의약품안전청, 2007) 퓨란의 대사경로를 보면 퓨란(C14-labelled, 8 mg/kg b.w./day)을 수컷 쥐에 반복 경구 투여하였 을 경우 여러 장기(간장, 신장, 대장 등)에서 빠르게 흡수되었으며, 생체막을 쉽게 통과하여 다양한 기관으로 분포된다. 이것은 퓨란(C14-labelled, 8 mg/kg b.w./day)을 쥐에 1회 경구 투여한 결과, 24시간 후 간장, 신장, 대장, 소장 등에서 방사능이 확인되었다. 퓨란(C14-labelled, 8 mg/kg b.w./day)을 쥐에 1회 경구 투여한 결과, 주요 대사체는 cis2-butene-1,4-dial, CO2, methylfuran유도체, α,β-unsaturated dialdehyde로 확인되었고, cytochrome P450 enzyme에 의해 cis-2-butene-1,4-dial로 대사체를 형성하며 이것이 퓨란의 독성 과 발암성에 관여하는 것으로 추정되고 있다. 또한 퓨란은 생체변환(biotransformation)을 거친 후 독성을 나타내며 Rat를 이용한 실험에서 8 mg/kg의 퓨란을 투여한 결과, 투여량의 84%가 24시간 이내에 대사물로 전환되었다. 주요 대사산 물에는 이산화탄소가 총 투여량의 26%를 차지했으며, 24시간 후에 상당량 간에서 단백질과 결합 한 형태로 검출되었다. 퓨란 대사의 첫 반응은 P450의 촉매작용에 의한 산화 반응에 의해서 cis-2butene-1,4-dial(BDA)로 전환되고, 이후 다시 산화반응으로 maleic acid, fumaric acid를 거쳐 최종 적으로 이산화탄소가 생성되는 것으로 추정된다. 중간 생성물인 BDA는 반응성이 강하여 세포의 GSH, amino acids, DNA 등의 친핵성 물질들 에 alkylating agent 로 작용하므로, 퓨란을 투여한 Rat의 소변에서 monoglutathione -BDA-N[4-carb oxy-4-(3-mercapto-1H-pyrrol-1-yl)-1-oxobutyl]-L- cysteinylglycine cyclic sulfide, S-[1-(1,3-dicarboxypropyl)-1H-pyrrol-3-yl] methyl thiol 등의 대사체들이 검출되었다 (Lu and Peterson, 2010). 또한 퓨란 (8mg/kg b.w./day)을 수컷 쥐에 1회 경구 투여한 결과, 호흡기 (parent compound, CO2), 뇨 (다양한 대사체), 변을 통해 24시간 이내에 80%가 배설되었다.. Fig 13. 퓨란의 생체 변환(Bakhiya and Appel, 2010). 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 89. 89. 2012-04-12. 11:20:05.

(32) 발생현황 식품의약품안전청은 국내 유통 중인 유아용 식품, 통조림 및 커피류를 포함한 총 170건에 대해서 퓨란 모니터링을 실시한 결과, 유아용 분유 47개 시료를 분석한 결과에서 평균 3.60 ppb, 이유식 40 개의 시료를 분석한 결과에서 평균 21.03 ppb, 유아음료의 경우 20개 시료를 분석한 결과에서 평균 5.47 ppb로 나타났다. 이유식의 퓨란 함량이 유아용 분유와 유아음료에 비해 높은 것으로 조사되었 고, 통조림식품 50건을 분석한 결과에서는 과일 통조림이 2.28 ppb로 가장 낮았으며 곡류, 두류, 통 조림 5.61 ppb, 채소류 통조림 6.24ppb로 조사되었다. 하지만 육류, 참치 그리고 기타수산물 통조림 에서는 이들에 비해 상대적으로 높은 수준으로 분포하였다. 인스턴트 커피류는 퓨란이 22.6~224.5 ppb 수준으로 검출되었으며 커피의 경우 미국은 커피 추출물의 퓨란 함량을 나타내고 있고, 우리나 라와 독일은 인스턴트커피 고형물과 원두 분말커피의 퓨란 함량을 나타내고 있으며, 스위스는 두 경 우 모두를 고려하였다. 따라서 미국, 스위스와 같이 음용상태(추출)로 환산할 경우 퓨란 함량은 미 국, 스위스 보다 낮거나 비슷한 수준일 것으로 예상된다(식품의약품안전청, 2007). 미국 FDA의 경우 또한 2005년 9월, 퓨란 관련 정책기본계획(Action Plan)에 의해 광범위한 식품 중 퓨란 모니터링을 실시(2004년∼2009년, 6회에 걸친 모니터링 자료 발표)하였다. 이를 통해 식품 중 퓨란 생성 메커니즘에 대해 규명하는 연구와 퓨란의 저감화에 대한 전략을 도출하기 위한 계획 을 하고 있으며, 캐나다, 독일, 스위스, 일본, 대만 등 다른 나라에서도 이와 유사한 사업을 하고 있 다(식품의약품안전청, 2006; Food Exploratory Data on Furan in Food: Individual Food Products).. (1) 국외 ① 미국 2007년 11월에서 2008년 9월 사이 미국 내에서 판매된 다양한 식품군별로 퓨란 농도에 대 한 모니터링을 실시한 결과, baked goods(ND∼30.1 ppb), beverages(ND∼1.4 ppb), breakfast cereals(ND∼25.4 ppb), dried fruit(ND∼2.2 ppb), infant foods(ND∼11.6 ppb), meat(ND), mixtures(13.5∼28.0 ppb), snacks(ND∼62.8), sweeteners(ND∼17.7 ppb), vegetables(ND∼2.1 ppb)로 나타났다(Exploratory data on furan in food: individual food products, FDA, 2008).. ② 유럽 EFSA는 2007년에서 2008년 사이 유럽 국가들에서 판매되고 있는 열처리 식품들에 대한 퓨란 함. 90. 2012. .indd 90. 2012-04-12. 11:20:05.

(33) 량 농도 조사 결과들을 수집하였다. 14개국에서 보고된 2,908건의 자료들을 종합한 결과, 퓨란 평 균 농도는 맥주와 과일주스는 6㎍/kg, 볶은 커피 원두는 2,272㎍/kg로 나타났으며, Grinding한 커 피원두에서는 1,114㎍/kg, 인스턴트커피에서는 589㎍/kg로 나타났다. 또한 시리얼, 육류, 스프 등 에서 퓨란 농도의 최대값은 100㎍/kg 이상이었으며, 영아용 분유는 8㎍/kg, 병포장 이유식의 평균 농도는 25㎍/kg이었다(EFSA, 2009).. ③ 대만 대만에서는 식품 섭취로 인한 하루 퓨란 노출량을 1999년 Nutrition and Health Survey in Taiwan(NAHSIT) 자료와 2010년 식품 중 퓨란 모니터링 연구를 통해 산출한 결과, EFSA의 결과 와 마찬가지로 커피로 인한 섭취량이 가장 높았다(남성 299.89 ng/kg b.w./day; 여성 177.18 ng/kg b.w./day)(Liu et al., 2010).. ④ 영국 영국의 식품안전국(Food Standards Agency, FSA)에서는 2007년부터 2009년에 걸쳐 열처리 식 품(병조림 및 통조림류, 커피류, 소스류, 이유식 등)의 퓨란 함량을 모니터링 하였다(EFSA,2010).. ⑤ 호주 · 뉴질랜드 호주 · 뉴질랜드 식품기준청(Food Standards Australia New Zealand, FSANZ)의 2008년 보고 서에 따르면 퓨란이 문제가 되는 주요 식품군인 커피의 종류별(cappuccino, latte, flate white, long black, short black, mocha, instant black, instant white, ground coffee)로 퓨란 의 함량에 대해서 모니터링을 실시하였다(FSANZ, 2008).. ⑥ 일본 일본농림수산성(Japan Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, JMAFF)의 2009년 보고 서에 따르면 레토르트 식품, 통조림 및 병조림 식품, 소스류, 일본 전통 장류, 커피, 차 등의 퓨란 함 량 모니터링을 실시하였다(JMAFF, 2009).. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 91. 91. 2012-04-12. 11:20:05.

(34) (2) 국내 ① 이유식 중 발암가능물질 퓨란 함량 큰 폭 증가 미국 보건복지부(DHHS)의 발암물질 목록에 등재되어 있고 국제암연구소(IARC)가 인체 발암가능 물질로 규정한 ‘퓨란(Furan)’의 국내 일부 식품 중 함량이 최근 몇 년 새 가파른 증가세를 보이 고 있는 것으로 나타났다. 2005년부터 2007년 국내식품 중 조사 대상이었던 이유식, 육류통조림, 참치캔통조림, 야채캔통조림 등 4개 품목의 퓨란 함량을 비교한 결과 평균 검출량을 기준으로 이유 식은 21.03ppb에서 29.93ppb로 42.3% 증가했고, 육류통조림은 14.09ppb에서 32.16ppb로 128.2%, 참치캔통조림은 25.2ppb에서 26.87ppb로 6.6%, 야채캔통조림은 6.37ppb에서 22.86ppb로 258.9% 각각 증가했다.. 국제 기준·규격 미국의 DHHS(Department of Health and Human Services) 발암물질 목록에 퓨란이 등재되어 있 고, IARC (International agency for Research on Cancer)에서는 퓨란을 인체 발암가능 물질로 규정 하여 Group 2B에 분류되어 있으나 퓨란과 관련된 정책을 시행하고 있는 나라는 아직까지 없는 실 정이다. 그러나 퓨란을 고농도로 투여한 일부 동물 실험에서 발암성이 있는 것으로 알려지고 있다. 미국 FDA, 유럽 EFSA, 독일, 스위스를 비롯한 여러 국가 및 기관에서 다양한 식품군을 대상으로 퓨란에 대한모니터링을 수행하고 있으며, 국내 식품의약품안전청에서도 다양한 식품군들에 대한 퓨란 모니터링을 실시하고 있으나, 현재 퓨란에 대한 노출과 인체 암 발생과의 연관성에 관한 역학 조사 자료는 없어 식품과 관련된 법적인 기준이 필요하다. 유럽의 EFSA(European Food Safety Authority)는 식품 중 정확한 퓨란 함량결과 자료를 기초로 하여 위해평가를 수행하기 위해서 2007년 1월부터 2010년 12월에 걸쳐 식품과 음료수 중의 퓨란 함 량에 관한 자료를 수집하였다. 그 결과 2009년 보고서에서 가정에서 만든 홈메이드 식품의 레시피 에 따른 가열조리 중 생성되는 퓨란 함량 모니터링 결과를 제시하였다(EFSA, 2009). 또한 미국 National Institute of Environmental Health Sciences/National Toxicology Program (NIEHS/NTP)에서는 2009년 퓨란에 대하여 넓은 범위의 농도에 걸친 대규모 bioassay 실험과 메커 니즘 규명을 위한 보조 연구를 수행하였다. 그 결과 발암성을 나타내는 퓨란이 간 부위에서 선택적 으로 축적된다(NCTR, 2009). 퓨란이 문제가 되는 주요대상 식품인 커피의 경우 미국, 유럽, 호주, 뉴질랜드 등의 선진 국가에. 92. 2012. .indd 92. 2012-04-12. 11:20:05.

(35) 서는 제조사별, 마시는 형태, 커피의 종류 등 다양한 시료에 따라 퓨란 함량결과를 제시하고 있으 나, 국내의 경우에는 커피가 다소비 식품임에도 불구하고 커피의 종류, 커피 원두를 사용하는 다양 한 방법 등에 따른 퓨란 함량의 결과가 없어, 이에 따른 연구의 필요성이 시급하다. 현재 식품 섭취 및 조리를 통한 퓨란의 섭취량 자료 수집과 그 위해성 여부에 대한 연구가 진행 중에 있으며 최종 위해평가를 발표한 국가는 없어 인체안전기준은 설정되어 있지 않지만, 국내에 서 노동환경건강연구소에서 퓨란을 인체 발암성 추정물질인(Probable Human Carcinogen) 발암 물질목록 2등급에 등록되어 있으며 세계보건기구 산하 국제암연구소인 IARC에서 1995년 인체 발 암 가능물질인 2B로 퓨란을 지정하였다. 또한 1998년 미국국립독성프로그램 National Toxicology Program(NTP)에서 퓨란이 인간에게 암을 일으킬 수 있는 가능성이 있다고 지정하였으며, 유럽연합 (EU)에서도 인간에게 발암물질이 가능한 물질로 규정되어 있다.. 저감화방안 가공 식품의 취식 및 조리과정 중 퓨란의 함량 변화를 조사한 결과, 같은 제품군이라 하여도 제품 에 따라 많은 차이를 보였으며, 개봉 후 시간이 지날수록, 가열 후 섭취할수록, 냉장 보관일수가 증 가할수록 퓨란의 농도가 감소하는 것을 볼 수 있었다(식품의약품안전청, 2006). 영·유아용 제품의 경우 제품을 개봉하여 5~10분 후에, 가열 후 및 하루이상 냉장보관 후 섭취 하고, 통조림류의 경우 제품의 뚜껑을 개봉하여 냉장보관 후 섭취하도록 권고하고 있다. 특히 수산 물 및 육류 통조림식품은 가열. 조리 후 섭취하며, 커피류의 제품은 시간이 경과 할수록 퓨란 농도 가 감소한다. 식품의약품안전청에서 용역연구를 통하여 퓨란 저감화 방안에 관한 연구 자료들을 발표하고 있 으며, 미국 FDA의 퓨란에 관련된 Action Plan을 번역하여 연구발표 자료들과 함께 제시하고 있다. 현재 식품 내 퓨란에 대한 연구는 아직 활발히 이루어지지 않고 있으며, 식품에서 그 함량이 적다할 지라도 많은 식품에서 널리 분포하기 때문에 식품의약품안전청은 퓨란의 정확한 위해평가를 위하 여 2005년 연구과제로 시작된 국내 식품 중 퓨란 함량에 대한 모니터링을 지속적으로 실시할 계획 이다. 또한 퓨란을 검출하는 퓨란 분석법을 개선하고, 식품의 조리·가공 과정 중 퓨란 함량에 대 한 변화를 연구하여 퓨란 생성을 줄일 수 있는 최적의 조리·가공 방법을 제시하기 위한 연구 사업 을 추진하고 있다.. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 93. 93. 2012-04-12. 11:20:05.

(36) 미국 FDA는 2005년 9월 작성된 퓨란 관련 정책기본계획(Action Plan)에 따라서, 광범위한 식품 중 퓨란 모니터링 실시하여 식품 중에서 퓨란을 생성하는 메커니즘을 규명하는 연구와 함께 퓨란 의 저감화 방안을 도출할 계획을 하고 있다. 캐나다, 독일, 스위스 등 다른 나라에서도 유사한 사업 을 추진하고 있는 중이다. 조리와 취식방법에 의한 퓨란 저감화 연구는 세계적으로도 많이 연구되지 못하고 있는 실정이다.. 분석 기술 현재 퓨란의 분석방법은 대부분 FDA에서 공인된 방법(HeadSpace-GC/MS)과 SPME-GC/MS 방 법으로 이루어지고 있다. 두 방법 모두 퓨란의 동위원소인 d4- 퓨란과 gas chromatographymass spectrometry를 이용한다. 국내에서는 미국 FDA에서 제시한 가공식품 중의 퓨란 분석방법과 SPME 법을 비교하여 국내 실정에 적합하며, 보다 효율적이고 경제적인 SPME를 이용한 시험방법을 제시 한 연구결과가 있다.. (1) Auto sampler를 이용한 Headspace 방법 (미국 FDA 방법) 표준물질첨가 정량법(Standard Addition Method)으로 1개의 시료분석을 7개의 농도가 다른 표준 물질을 가지고 분석, 자동 시료 주입기가 부착된 고가장비, 시간, 노동력이 많이 소요되는 단점이 있다(검출한계 : 1 ppb).. (2) SPME-GC/MS (Solid Phase Micro-Extraction Gas Chromatography Mass Spectrometry)법 내부표준물질과 SPME를 이용한 방법, 용매와 함께 가온 후 SPME의 흡착력을 이용하여 휘발성분 을 흡착한 후 GC/MS의 고온 주입기 내에서 탈착하여 분리 동정한다(검출한계 : 1 ppb).. FDA 공시법은 고가의 장비를 갖추어야 하고 Standard Addition Method로 7개의 농도가 다른 sample을 가지고 실험을 하기 때문에 시간과 노동력이 너무 많이 드는 단점을 가지고 있는 반면, SPME를 이용한 방법은 수동식 SPME 장치만을 요구하기 때문에 초기 기기비용이 저렴하고 시료 수를 줄일 수 있어 Auto sampler를 이용한 headspace 방법에 비해 시간과 노동력이 단축된다. 또 한 많은 문헌에서 SPME를 이용한 분석방법이 휘발성이 강한 퓨란의 분석에 우수한 방법이라 언급. 94. 2012. .indd 94. 2012-04-12. 11:20:05.

(37) 되어 지고 있다. 퓨란의 분석법은 고상 도는 반고상의 검체를 물이나 포화염화나트륨용액으로 희석하고 액상 검 체는 희석 없이 중수소로 치환된 퓨란 내부표준물질을 첨가하여 시험용액의 헤드스페이스 중 퓨란 을 기체크로마토그래프/질량분석기(GC/MS)로 분석하고 표준물질첨가법으로 정량하는 방법이다( 식품오염물질포털, 식품 중 신종물질 분석방법 총서, 2008).. (1) 측정기기 ① 헤드스페이스 포집장치 ② 기체크로마트그래프 : 질량분석기(GC/MS)를 사용한다.. (2) 시약 및 시액 ① 메탄올 : HPLC용 또는 이와 동등한 것 ② 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것 ③포 화염화나트륨용액 : 과량의 염화나트륨(순도 99% 이상의 것)을 물 500ml에 녹여 포화용 액을 조제한다. ④ 표준원액 : 퓨란 표준물질을 정밀히 달아 메탄올에 녹혀 2.5mg/ml로 조제한다. ⑤내 부표준원액 : 중수소로 치환된 퓨란(furan-d4) 표준물질을 정밀히 달아 메탄올에 녹혀 2.5mg/ml로 조제한다. ⑥ 표준용액 : 표준원액에 물을 가해 5㎍/ml로 조제한다. ⑦내 부표준용액 : 내부표준원액에 물을 가해 5㎍/ml로 조제한다. (단, 표준용액 및 내부표준 용액은 당일 조제하여 사용하여야 하며, 상기의 표준용액과 내부표준용액의 농도는 모든 검체의 시험에 적합하지 않을 수 있다.). (3) 검체 중 퓨란 농도 예측 ①검 체 균질화 : 모든 검체는 4시간 이상 냉장 보관한 비커에 취하여 얼음물에 담그고 분쇄 하여 균질화 한다. 고상 검체는 5g을 헤드스페이스용 바이알(20ml)에 취하고 물을 가하여 10g이 되도록 하고 밀봉한다. (단, 땅콩 및 땅콩버터와 같이 분석 중 발효가 될 수 있는 검체 와 수분함량이 낮고 지방함량이 높은 비스켓 등과 같은 검체는 1g을 헤드스페이스용 바이. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 95. 95. 2012-04-12. 11:20:05.

(38) 알(20ml)에 취하고 포화염화나트륨용액을 가하여 10g이 되도록 하고 밀봉ㅎ란다. 모든 검 체는 층의 분리를 막기 위하여 vortex를 이용하여 균질화하고, 10분간 방치 후 다시 vortex 를 이용하여 균질화한다. ②검 체 중 퓨란 농도 예측 : 예측시험용액은 상기의 균질화한 시험용액에 내부표준용액 20㎕ 을 첨가하여 조제하고, 대조용액은 물 10g에 퓨란 표준용액 10㎕ 및 내부표준용액 20㎕을 첨가하여 조제한다. (단, 표준 용액과 내부표준용액은 냉장보관된 실린지를 이용하여 첨가 한다.) 예측 시험용액과 대조용액은 시험조작 조건으로 분석한다. 검체 중 퓨란 농도 예측 은 대조용액 중 표준물질(m/z 68)과 내부표준물질(m/z 72)의 피크 면적비 및 대조용액 중 퓨란의 양(ng)을 이용하여 다음 식에 따라 계산한다.. - 퓨란농도(㎍/kg) = F×. AIS ASAM 1 × × AS ASAMIS S. F : 대조용액 중 퓨란의 양(ng) AS: 대조용액의 표준물질(m/z 68) 피크면적 AIS: 대조용액의 내부표준물질(m/z 72) 피크면적 ASAM: 예측시험용액의 퓨란 피크면적 ASAMIS: 예측시험용액의 내부표준물질 피크면적 S : 검체 채취량(g). (4) 표준물질첨가 시험용액의 조제 : 표준물질첨가 시험용액은 (3)에서 얻어진 퓨란 농도 (X°)에 따라 표 1의 제시와 같이 조제한다. 총 7개의 헤드스페이스용 바이알(20ml)에 (3)과 같이 균질화한 시험용액 10g을 각각 취하고 X° 의 1.0배 농도가 되도록 내부 표준 용액을 각각 첨가한다. 이 중 2개 의 헤드스페이스용 바이알(20ml)에 X° 의 0.5배 농도가 되도록 표준용액을 첨가한다. 다른 1개의 헤 드스페이스용 바이알(20ml)에 X°1.0배 농도가 되도록 표준용액을 첨가한다. 나머지 1개의 헤드스 페이스용 바이알(20ml)에 X° 의 2.0배 농도가 되도록 표준용액을 첨가한다.(단, 표준용액과 내부표 준용액은 냉장 보관된 실린지를 이용하여 첨가한다.). 96. 2012. .indd 96. 2012-04-12. 11:20:05.

(39) Table 4. 고상 검체(X° =20㎍/kg)의 시험시 표준물질첨가 시험용액의 조제(예시) 검체(5g). 표준용액 첨가량(㎕). 내부표준용액 첨가량(㎕). 첨가된 퓨란의 양(ng). 0X˚. 0. 20. 0. 0X˚. 0. 20. 0. 0X˚. 0. 20. 0. 0.5 X˚. 10. 20. 50. 0.5 X˚. 10. 20. 50. 1.0 X˚. 20. 20. 100. 2.0 X˚. 40. 20. 200. (5) 시험조작 ① 헤드스페이스의 조건 ㉮ 상평형 온도 및 시간 : 60℃, 30분 ㉯ 주입량 : 1ml ② 기체크로마토그래프의 측정조건 ㉮ 칼럼 : HP-PlotQ(15m × 0.32mm, 20㎛) 또는 이와 동등한 것 ㉯ 주입부 : splitless, 200℃ ㉰ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 2.0ml/min ㉱오 븐온도 : 초기의 온도 50℃에서 10℃/분 비율로 225℃까지 온도를 상승시킨 후 12.5분 간 유지한다. ㉲ 이온화 방식 : Electron impact ㉳ 이온화에너지 : 70eV ㉴ 이온스캔 : m/z 35~150 ㉵ 특성이온 : m/z 39, 68, 72. (6) 정성시험 : 시험용액의 크로마토그램 상의 특성이온 m/z 68의 피크 머무름 시간(Retention time)은 퓨란 표준물질의 특성이온 m/z 68의 피크 머무름 시간과 일치하여야 하며, 시험용액. 신종유해물질의 발생 기작과 특성에 관한 연구. 2012. .indd 97. 97. 2012-04-12. 11:20:05.

(40) 의 스펙트럼 특성이온 m/z 39, 68, 72가 확인되어야 하고 특성이온 m/z 39와 68의 반응세기비 는 퓨란 표준물질의 m/z 39와 68의 반응세기비와 비교할 때 ±25% 이내에서 일치하여야 한다.. (7) 정량시험 : 표준물질첨가 시험용액(0X˚~2.0X˚)은 직선성을 나타내어야 하고(r²≥ 0.99), 이 때 표준물질첨가 시험용액 중 표준물질(m/z 68)과 내부표준물질(m/z 72)의 피크 면적비 [AS / AIS]를 Y축으로 하고 첨가된 퓨란 표준물질의 양을 X축으로 하여 표준물질첨가 검량곡 선을 작성하고 다음과 같이 X절편을 구하여 검체 채취량으로 나누어 퓨란을 정량한다. (정량 한계 1 ㎍/kg). - 퓨란함량(㎍/kg) = -. b 1 × a S. a : 표준물질 첨가 검량선의 기울기 b : y값이 0일 때의 X값 (X 절편의 값) S: 검체 채취량 (g). Gap analysis 미국에서는 퓨란 함량 모니터링을 수행하고 있으며 각 식품군별, 제조사별 퓨란 함량을 모두 공 개하고 있다. 또한 유럽, 캐나다 등과 함께 퓨란 노출량 결과를 유아의 경우 개월 수 및 연령대별로 2004년부터 조사된 자료가 있다(FDA, Exploratory Data 2004, 2005, 2006, 2007, 2009), (EFSA, 2004). 국내의 경우 2005년 식약청 용역사업을 통해 국내 유통 중인 유아용식품(100건), 통조림류(50건) 및 커피류(20건)를 포함한 총 170건에 대해 퓨란 모니터링을 실시한 이후 2010년까지 지속적으로 식품 내 퓨란 함량을 모니터링 하고 있으며, 다른 나라의 검출량과 비교하였을 때 분유·이유식류 와 통조림식품은 미국, 독일, 스위스와 비슷하거나 낮은 수준이며 커피류도 독일, 스위스와 비슷하 거나 낮은 수준이다. 미국 FDA, 유럽 EFSA, 독일, 스위스 등 여러 국가 및 기관에서 다양한 식품군을 대상으로 퓨란에 대한 모니터링을 수행하고 있으며, 국내 식약청에서도 다양한 식품군들에 대한 퓨란 모니터링을 하. 98. 2012. .indd 98. 2012-04-12. 11:20:05.