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실험적으로 정계정맥류 및 수신증을 만든 쥐에 있어서 p53및

ɤ-H2AX의 발현

조선대학교 대학원

의 학 과

문 형 윤

2 0 0 9 년 월

박사학위 논문

실험적으로 정계정맥류 및

수신증을 만든 쥐에 있어서 p53및 ɤ-H2AX의 발현

Theexpr essi on ofp53and ɤ -H2AX i n exper i ment al i nducedvar i cocel eandhydr onephr osi si n r at

2009년 8월 일

조선대학교 대학원

의 학 과

문 형 윤

실험적으로 정계정맥류 및 수신증을 만든 쥐에 있어서 p53및

ɤ-H2AX의 발현

지도교수 김 철 성

이 논문을 의학 박사학위신청 논문으로 제출함

2 0 0 9 년 4 월

조선대학교 대학원

의 학 과

문 형 윤

문형윤의 박사학위논문을 인준함

위원장 조선 대학교 교수 장인엽 (인) 위 원 조선 대학교 교수 김철성 (인) 위 원 조선 대학교 교수 유호진 (인) 위 원 조선 대학교 교수 노 준 (인) 위 원 조선 대학교 교수 전제열 (인)

2 0 0 9년 6 월

조선대학교 대학원

목 차

그림 목차···ii

영문초록···iii

I.서론···1

II.대상 및 방법···3

III.결과···6

IV.고찰···8

V.결론···15

참고문헌···16

그림 목 차

Fig.1.Immunohistochemicalstainingforp53invaricocele-inducedrat. Fig.2.Immunohistochemicalstainingforγ-H2AX invaricoceleinducedrat. Fig. 3. Western blotting of p53 and γ-H2AX expressed in the varicocele-inducedrattestes.

Fig.4.Immunohistochemicalstainingforp53inhydronephrosis-inducedrats. Fig.5.Immunohistochemicalstaining for γ-H2AX in hydronephrosis-induced rats.

Fig 6.Western blotting ofthep53andγ-H2AX expressedinrenalparenchyme ofhydronephrosis-inducedrats.

ABSTRACT

Theexpr essi on ofp53and ɤ -H2AX i n exper i ment al i nducedvar i cocel eandhydr onephr osi si n r at

Moon,Hyung-Yoon

Advisor:Prof.Kim Chul-Sung,M.D.,Ph.D.

DepartmentofMedicine.

GraduateSchoolofChosun University

Purpose: Since sperm DNA damage-related apoptosis caused by reactive oxygen species (ROS)is arising concerns with abnormalspermatogenesis and renalparenchymaldamagein urologicpart,weinvestigated thechangesofthe DNA damage-related regulatory proteins during testiculargerm cellapoptotic responsesinducedbyexperimentalvaricocelein ratsandrenalparenchymalcell apoptoticresponsesinducedbypartialureteralobstruction.

Materials and Methods:A totalof16of12-weeksold Sprague-Dawley rats underwentexperimentalleftvaricocele.Outofthe16rats,weoperated12rats fortheirvaricoceleand theother4ratsfortheirsham-operated controls.The testis tissues were prepared on the first,third,and fourth week after the experimentally induced varicocele.The levels ofp53 and gamma-H2AX were examinedbyimmunohistochemistryandwesternblotanalysis.

16Sprague-Dawleyratsthatwere7∼8weeksoldwereused.Partialureteral obstructionwasinducedin12rats.Andfortheother4rats,asham-operation wasdoneasacontrol.Thehydronephrosis-inducedratshadtheirrightkidney removedafter1,2and3weeksandthesham-operatedratsunderwent

nephrectomyafter3weeks.Thoseremovedtissueswereexaminedwith immunohistochemicalstainingandwesternblottoconfirm thedegreeof expressionofp53andγ-H2AX.

Results:Immunohistochemicalstaining ofthe lefttestes in varicocele-induced ratshowed thatthe expression ofp53 and phosphorylation ofH2AX did not begin2weekspostoperatively,butremarkableresultswereobservedat3and4

weeks.Both testesofthevaricocele-induced ratshowed theexpression ofp53 and phosphorylation ofH2AX at 4 weeks,with the left testes being more distinctiveinimmunohistochemicalstaining comparedtotheright.Western blot ofthe lefttestes in varicocele-induced ratalso showed unclearexpression of p53 and γ-H2AX at2 weeks.Considerable distinction was seen at3 and 4 weekscomparedtothecontrolgroup.

Theexpressionsofp53andγ-H2AX causedbyhydronephrosisintherat increasedastimepassed,andtheseexpressionsofcontrolswereinalow level ortheywerenegative.Theseresultsweresimilarwiththeresultsofthe immunohistochemicalstainingandwesternblot

Conclusions:

Thisstudyisshownthattheproteinexpressionsofγ-H2AX andp53are increased,andtheseexpressionsaretheDNA damage-relatedfactorsinthe varicoceleandrenalparenchymaofhydronephrosisinducedrats.Wesuggested thepossibilitythatDNA doublestrandbreaks(DSBs)mightbethemain mechanism thatinducesabnormalspermatogenesisinexperimentalvaricocele andrenalparenchymaldamageundertheconditionofhydronephrosis

Ⅰ.서 론

정계정맥류는 성인 남성의 10-15%에서 발견되며,불임을 주소로 내원하는 환자들 중 1차성 불임 환자의 30-35%,2차성 불임환자의 69-81%에서 발견되는 것으로 알 려져 있다.^1-3불임이 발생하는 원인은 고환정맥의 확장 및 호르몬 이상,고환의 온 도 상승,신독물의 역류 등으로 인해 남성의 생식 능력에 유해한 영향을 끼치는 것 으로 알려져 있다.⁴최근에는 활성 산소 (Reactiveoxygenspecies;ROS)와 세포자 멸사 (apoptosis)등에 의해 정자 DNA 손상이 발생하며 결과적으로 비정상적인 정 자발생을 일으킨다고 보고하고 있다.^5-9

요로폐색이 일어나면 대부분 수신증 (Hydronephrosis)이 발생하며,이는 신기능에 중대한 영향을 미치는 중요한 비뇨기 질환이다.폐색이 진행되면 폐색의 상부 요로 는 점차 확장되어 수신증을 초래하고 사구체나 혈관의 손상 없는 상태에서도 신세 뇨관의 압박과 간질의 염증성 변화,간질의 섬유화에 이어 신실질의 감소를 가져오 며,¹⁰더욱 진행되면 신위축으로 기능을 상실하게 된다.폐색의 기간이 길수록 비가 역적인 손상이 진행되고,이와 같은 신실질의 손상은 압박 및 국소적 허혈로 인한 세포고사,세포증식 및 섬유화 등에 의해 야기됨이 보고되었다.¹⁰따라서 수신증에 의한 조직의 손상을 예방하기 위한 연구는 중요한 과제라고 할 수 있으며,정확한 병태생리는 아직 많은 연구가 진행 중이다.그 중 특히 수신증 발생 시 DNA 손상 과 관련 인자에 의한 신실질 손상에 관한 연구는 매우 드문 실정이다.

DNA는 여러 내인성,외인성 유해인자에 의해 손상되어 돌연변이을 일으키고 노 화,종양 등의 질병들을 야기하는데,DNA 손상 중 가장 흔한 형태는 이중나선손상 (doublestrand breaks;DSBs)이며 이와 관련된 세포고사의 과정에는 p53에 의한 신호전달이 중요하다는 것은 잘 알려져 있다.¹¹DNA 손상의 종류에 따라 이들을 정상으로 되돌리는 DNA 수복 시스템이 존재하고,그 중 암 등의 질환 발병과 관 련성이 있을 것으로 생각되는 DNA 복구 단백질에 대한 여러 연구가 진행되고 있 다.세포고사에 관련된 단백질로 알려진 p53은 17번 염색체의 단완에 위치하는 p53 유전자(gene)에서 생산되는데,정상 세포의 성장과 기능에 필수적인 요소는 아니지 만 DNA 손상이 발생할 경우 세포주기(cellcycle)를 정지시켜 DNA 복구를 유도하 거나 세포고사를 야기시킨다.¹¹즉 p53단백질의 발현정도를 확인함으로써 DNA 손 상의 정도를 가늠할 수 있다고 볼 수 있다.H2AX는 뉴클레오솜 (nucleosome)을

이루고 있는 histone분자 중 H2A의 주요 구성 성분으로¹²세포대사와 유전체 안 정성의 유지에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀져 있으며,세포가 DNA 손상 을 받게 되면 급격히 H2AX의 세린(serine)에 인산화가 발생하게 된다.¹³ 특히 Rogakou등¹⁴은 DNA 손상의 한 형태인 이중나선손상 (DSBs)주위에 H2AX가 대 량으로 인산화됨을 보고하여,γ-H2AX를 염색하는 것이 흔히 발생하는 DNA 손상 형태인 이중나선손상 (DSBs)을 검출하는 유용한 방법으로 여겨지고 있다.

본 연구는 정계정맥류 및 수신증을 유발한 흰쥐를 실험동물로 사용하여 DNA 손 상 표지자인 p53,DNA 손상 여러 형태 중 이중나선손상 (DSBs) 표지자인 γ -H2AX의 단백 발현 양상을 관찰하여 첫째,정계정맥류 모델의 고환 생식세포에서 DNA 손상과 연관성을 비교 분석하였으며,둘째,수신증 신실질 손상 모델에서 DNA 손상과의 연관성을 알아보고자 하였다.

Ⅱ.대상 및 방법

1.동물 및 정계정맥류 수술

12마리의 생후 12주령 Sprague-Dawley 흰쥐를 pentobarbital(3mg/100g)으로 복강마 취 후 복부정중절개를 통하여 좌측신장으로 접근한 후 대정맥과 연접한 좌 신정맥을 노출시켰다.그 다음 좌 신정맥과 평행하게 0.8mm probe을 댄후 3.0silk로 결찰을 시 도한 후 probe을 제거하고 신정맥의 직경을 50%로 감소시켰다(수술군).4마리의 흰쥐 를 마취하에 복부정중절개를 통하여 좌측신정맥을 박리한 다음 다시 봉합하여 대조군 (sham-operated)group으로 삼았다.

2.고환조직

술 후 14일,21일,28일에 흰쥐를 마취시킨 후 복부정중절개를 통해 각각 4마리씩 좌측 고환을 적출하였고,28일에 양측 고환을 적출하였다.대조군은 28일째 양측 고환을 적출하였다.적출한 고환으로부터 고환조직을 채취하여 면역조직형광염색 및 Westernblot을 각각 나누어 시행하였다.

3.동물 및 수신증 수술

12마리의 생후 7-8주령 Sprauge-Dawley흰쥐를 pentobarbital(3mg/100g)으로 복 강마취 후 측복부절개를 통하여 우측상부요관을 노출시켰다.그 다음 우측상부요관 과 평행하게 0.8mm probe을 댄 후 3.0silk로 결찰한 후 probe을 제거하고 우측상 부요관의 직경을 50% 이하로 감소시켰다(수술군).4마리의 흰쥐를 마취 하에 측복 부절개를 통하여 우측요관을 박리한 다음 다시 봉합하여 대조군 (sham-operated) 으로 삼았다.

4.신장조직

수술군은 술 후 1주,2주,3주에 각각 4마리씩 흰쥐를 마취시킨 후 복부정중절개 를 통하여 우측 신장을 적출하였다.대조군은 3주 후에 우측 신장을 적출하였다.

적출한 신장으로부터 신장조직을 채취하여 면역조직형광염색 및 Western blot을 각각 나누어 시행하였다.

5.면역조직형광염색

1)냉동절편제작:고환을 적출하여 백막을 절개한 후 고환실질을 노출시켰으며,신 장조직은 신장을 적출하여 절개한 후 신장실질을 노출시켜 고정액(4%

paraformaldehyde)이 잘 침투하도록 한 다음 4C에서 24-36시간 고정하였다.이후 30% sucrose가 희석된 인산염완충액에 담궈 (4C,36-48시간)탈수시켜 냉동조직손 상을 방지한 다음, 냉동절편포매액(OCT compound)에 담궈, 드라이아이스와 isopentane이 혼합된 용액에서 급속히 냉각시킨 후,8-10㎛ 두께로 절편을 얻어 젤 라틴이 발라진 슬라이드에 부착시켰다.

2)면역조직형광염색:조직이 부착된 냉동절편을 PBS에서 20분씩 3회 세척한 후, 0.3% Triton X-100이 함유된 PBS를 실온에서 1시간동안 반응시킨 후,재차 PBS 로 씻은 다음 1% BSA와 정상 말혈청이(normalhorseserum;VectorLaboratoies, Burlingame,CA,USA)함유된 PBS(실온,1시간)에 반응시켜 비특이적 반응을 억 제하였다.일차항체로는 생쥐에서 추출한 p53에 대한 항체(1:100inPBS,4℃,48h;

Santa Cruz biotechnology,Inc,Santa Cruz,CA,USA)와 토끼에서 추출한 γ -H2AX에 대한 항체(1:100 in PBS,4℃,48h;Upstate,NY,USA)를 사용하였다.

PBS로 수차례 세척한 후,형광표지물질인 2차 항체는 Alexa Fluor 488(horse anti-rabbit,0.5㎍/㎖,1hr,실온 ;Molecularprobe,Eugene,OR,USA)와 Alexa Fluor555(horseanti-mouse,0.5㎍/㎖,1hr,실온 ;Molecularprobe,Eugene,OR, USA)를 이용했다.음성대조군은 일차항체 대신 인산염 완충식염수를 사용하였다.

수차례 PBS로 세척한 후 습윤봉입하여 관찰하였다.

3)공초점 레이저 주사현미경 :면역형광 염색된 조직표본은 공초점 레이저 주사 현미경(FV300,Olympus,Japan)를 사용하여 관찰하였다.레이저 광선의 흥분파장 으로는 488nm 파장과 555nm 파장을 각각 사용하였다.1.5㎛ 간격으로 주사영상 을 얻었는데 8～10㎛ 두께까지 주사하였다. Flow View Softwave program (Olympus,Japan)을 사용하여 최종 3차원적 영상으로 재조립한 후 컴퓨터에 저장 하고 인쇄하였다.

6.Westernblotting

신선 고환조직 및 신장조직을 드라이아이스와 isopentane이 혼합된 용액에서 급 속히 냉각시켜 냉동상태로 보관하여 다음 실험에 사용하였다.조직 0.5mg을 300㎕

용해 완충액 (lysis buffer;20mM Hepes,pH 7.4,2mM EGTA,50mM-glycerol phosphate, 1% triton X-100, 10% glycerol, 1mM dithiothreitol(DTT), 1mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF),10㎍/mlleupeptin,10㎍/mlaprotinin,1mM Na3VO4, and 5mM NaF)으로 30분 동안 0°C에서 용해시킨 후 균질화 (Homogenization)시켰다.Ultra-sonicator를 이용해서 세포를 파괴시켜 원심분리시 키고(18.000rpm, 4℃ 15min), 상층액을 재차 원심분리하였다(18,000rpm, 4℃ 10min).5분 동안 열판에서 가열한 후,전기영동을 위해 단백질 농도를 Bio-Rad dye-binding microassay (Bio-Rad,Hercules,CA,USA)로 결정하였는데,20㎍의 단백질을 10% SDS polyacrylamide gels로 전기영동 시킨 후 단백질들을 Hybon ECL membranes(Amersham-Phamacia, Biotech)로 옮겨서 염색을 하였다.

anti-p53(1:1,000,4℃,24h;SantaCruzbiotechnology,Inc,SantaCruz,CA,USA) 과 anti-γ-H2AX(1:1,000,4℃,24h;Upstate,NY,USA )를 1차 항체로 각각 사용하 였다. 염색된 단백질을 enhanced chemiluminescence detect system(iNtRON, Biotech.,Seoul,Korea)을 이용하여 특정단백질의 발현여부를 확인하였다.

Ⅲ.결 과

1.정계정맥류를 유발한 흰쥐 고환에서 p53및 γ-H2AX의 발현

흰쥐 16마리 중 정계정맥류를 유도한 군(n=12)과 대조군(n=4)에서 p53및 γ -H2AX의 발현정도를 확인하기 위해 면역조직형광염색과 westernblot을 시행하 였다.대조군의 고환조직은 sham operation4주 후에,정계정맥류 유도한 군은 2주,3주,4주 후에 조직을 획득하여 검사하였다.면역조직형광염색 결과 p53은 실 험군의 좌측 고환조직에서 2주째 발현이 되지 않았고,3주와 4주에서는 대조군에 비해 발현이 증가되었다.특히 3주에서는 약 70% 정도에서 발현이 되었으며,4주 에서는 거의 전부에서 발현이 되었다.4주째 실험군의 양측 고환조직을 비교하였 을 때 p53발현 정도는 좌측 고환에서 좀 더 저명했다.발현된 부위는 정모세포에 서 주로 발현이 되었으며,버팀세포와 정세관의 중심부위는 발현이 잘 되지 않았 다.간혹 정세관의 중심부위에서 발현이 된 부위는 미미하였다(Fig.1).γ-H2AX 의 경우도 실험군의 좌측 고환조직에서 2주째에는 발현이 되지 않았고,3주와 4주 에서는 발현이 증가되었다.주로 발현이 된 곳은 p53과 마찬가지로 정모세포를 포 함한 가장자리에서 주로 발현되었으며,3주와 4주째 발현이 증가되었다.대조군의 경우는 양측 고환에서 p53및 γ-H2AX의 발현이 없었다(Fig.2).Western blot의 경우는 실험의 객관성을 위해 먼저 actin에 대한 발현을 실시하였으며,두 군 모두 에서 일정하게 발현된 것을 확인하였다.정계정맥류를 유도한 군에서는 2주,3주,4 주째 좌측 고환조직을,대조군의 경우는 4주째 좌측 고환조직에 대한 Westernblot 를 실시하였다.실험군에서 2주째 p53및 γ-H2AX의 발현이 되지 않았으나 3주와 4주째는 발현이 유의하게 증가하는,즉 시간경과에 따라 증가되는 변화양상을 관찰 할 수 있었으며,대조군에서는 p53및 γ-H2AX의 발현을 거의 관찰할 수 없어 면 역조직형광염색의 결과와 일치하는 소견을 보였다(Fig.3).

2.수신증을 유발한 흰쥐 콩팥에서 p53및 γ-H2AX의 발현

흰쥐 16마리 중 수신증을 유도한 군 (n=12)과 대조군 (n=4)에서 p53과 γ-H2AX의 발현정도를 확인하기 위해 면역조직형광염색과 westernblot을 시행하였다.수신증

을 유도한 군의 신장조직은 수술 1주,2주,3주 후에,대조군은 sham operation3 주 후에 신장 조직을 획득하여 검사하였다.면역조직형광염색결과,수신증을 유도 한 군은 p53과 γ-H2AX의 발현이 대조군에 비해 증가되었으며 시간에 따라 조 금씩 증가하는 양상이었다.특히 사구체보다는 주위 신세뇨관에서의 발현이 두드러

졌으며,간혹 사구체의 중심부에서 발현이 된 부위는 미미한 증가를 보였다(Fig.

4-5).Western blot에서도 마찬가지로 위 물질들의 발현이 증가되었으며,시간 경 과에 따라 증가되는 변화 양상을 관찰 할 수 있었다(Fig.6).대조군의 p53과 γ -H2AX의 발현은 매우 낮은 수준이거나 음성이어서 면역조직형광염색의 결과와 일 치하는 소견을 보였다.

Ⅳ.고 찰

1.정계정맥류를 유발한 흰쥐 고환에서 p53및 γ-H2AX의 발현

정계정맥류는 남성불임의 가장 흔한 원인으로 수술로 치료 가능한 질환이지만 현 재까지 발생기전 및 불임을 일으키는 정확한 병태생리는 밝혀지지 않고 있다.하지 만 호르몬의 이상,고환의 온도상승,신독물의 역류,그리고 변화된 동맥혈류 등이 정계정맥류를 가진 남성에서 비정상적인 정자형성을 일으킬것이라고 추측하고 있 다.최근에는 정자 DNA 손상에 대한 연구를 통해 정계정맥류와 감정자증과의 연 관성을 파악하고 있으며 여기에는 활성산소와 세포자멸사가 중요한 기전으로 고려 되고 있으나 이를 규명하기 위한 합의된 방법은 아직까지 도출되지는 않았다..^5-9 세포자멸사는 1972년 Kerr등¹⁵에 의해 처음으로 생체의 정상적인 발달과 항상성의 유지에 중요한 역할을 담당하며 종양,후천성 면역질환,퇴행성 신경장애,동맥경화 증 및 심근질환 같은 여러 가지 질병의 병인에 관여한다고 보고하였다.또한 비뇨 기계의 악성 및 양성질환들도 부적절한 세포자멸사의 활성에 의해서 발생한다고 알려져 있으며 정상적인 정자형성 과정을 조절하는 중요한 요인으로도 작용하여, 감정자증 등과 같은 불임환자에서 세포자멸사가 의의 있게 증가함을 보고하였다.^7-9 Barqawi등¹⁶도 실험적으로 정계정맥류를 발생시킨 쥐에서 sham operation 군과 비교한 결과,수술 후 14일째부터 동측의 세포자멸사 지수 (apoptoticindex;AI)가 의미있게 증가하였으며 대측의 세포자멸사 지수 또한 시간이 경과함에 따라 증가 함을 보고하였다.또한 Simsek 등¹⁷은 정계정맥류로 인해 고환조직의 손상이 야기 된 환자에서 세포자멸사가 중요한 역할을 담당한다고 하면서 세포자멸사가 정자형 성 부전에 중요한 역할을 한다고 보고하였다.그러나,Kilinc등¹⁸은 정계정맥류에서 세포자멸사가 증가하는 이유를 실험적으로 정계정맥류를 유발한 쥐에서 신정맥의 수술적 조작이 염증을 만들고 이것이 생식세포의 세포자멸사를 야기했을 거라 주 장하면서 정계정맥류와 세포자멸사와의 연관관계를 부인하였다.Fujisawa등⁵도 정 상인 남자와 정계정맥류를 가진 불임 환자의 고환을 조직검사 하여 정계정맥류의 정도에 따른 세포자멸사 정도와 세포자멸사 지수를 비교한 결과 정계정맥류의 정

도와 세포자멸사의 정도에 의미있는 차이가 보이지 않았으며 도리어 환자군에서 세포자멸사의 정도가 더 감소한다고 보고하였다.또한,Tanaka 등¹⁹은 정계정맥류 환자에서 세포자멸사를 조절하는 단백질인 caspase-3의 발현을 연구한 결과 caspase-3의 발현이 감소함으로써 결국 세포자멸사가 억제된다고 보고하였다.이에 최근에는 세포자멸사와 관련된 많은 유전자 산물에 대한 연구가 진행되고 있으며 이러한 연구를 통하여 세포자멸사와 고환조직의 손상에 대한 연관성을 확인하고 있는 실정이다.

정액내 ROS는 정계정맥류 환자에서 정자 DNA 손상을 일으키는데 ROS 자체가 직접 DNA에 영향을 끼치거나 세포내 Ca²⁺의 농도를 변화시켜 결국 세포자멸사를 유도한다.⁷Hendin 등²⁰은 불임의 여부에 관계없이 임상적으로 진단된 정계정맥류 환자의 정액내 ROS와 총 항산화능을 조사한 결과 ROS는 상승하고 총 항산화능은 감소함을 확인함으로써 정자 DNA 손상에 ROS가 관여함을 보고하였다.

p53은 정상세포의 성장과 분화 그리고 기능에 필수적인 요소는 아니나 DNA의 손 상이 발생한 경우 G1단계에서 cellcycle을 정지시켜 DNA 합성이 발생하는 S 단 계로의 진입을 막아 DNA 복구를 유도하거나 손상이 심한 경우 세포자멸사를 유도 한다.또한 대부분의 인간에서 발생하는 악성종양의 경우 p53유전자의 돌연변이나 p53에 발암성 단백질이 결합함으로써 p53유전자가 불활성화 되어 있음을 보이고 있어 p53은 비정상세포의 증식을 억제하고 세포의 항상성을 조절하는데 중요한 역 할을 담당하고 있다.DNA 손상이 가벼울 때 p53은 cellcycle을 정지시켜 DNA 복 구를 하며,DNA 손상이 심할 때는 p53이 세포자멸사를 야기시킨다고 보고하였 다.²¹이를 토대로 p53단백질의 발현 정도를 확인함으로써 DNA 손상의 정도를 가 늠해 볼 수 있다.Kilinc등¹⁸은 정상대조군 및 sham operation군과 비교해 정계정 맥류군 에서 p53의 발현이 의미 있게 증가하였다고 하면서 p53의 발현이 비정상 정자형성을 반영한다고 보고하였다.저자의 경우도 sham operation 군과 비교하여 정계정맥류 군에서 p53의 발현이 증가하였으며 특히 3주와 4주에 발현이 두드러졌 다.또한,동측이 대측에 비해 발현의 증가가 더욱 명확하였으며 대조군에서는 p53 의 발현은 관찰되지 않았다.특히 발현이 증가된 곳은 정세관의 정모세포이었으며 발현이 감소된 곳은 버팀세포 및 정자세포이었는데 Fujisawa등⁵도 동일한 결과를

보고하였다.간혹 정자세포로 여겨지는 곳에서 발현이 보이는 경우도 있었는데 아 마도 정자세포부위에서 식세포작용이 활발히 이루어지고 있기 때문이라고 Henriksen²²등은 보고하였다.p53의 발현은 특히 유해인자에 의한 DNA손상 반응에 의하여 현저하게 증가한다고 알려져 있으며 본 연구에서도 실험군에서 p53 발현 증가를 확인함으로써 정계정맥류에 의한 DNA 손상 정도를 파악할 수 있었다.

염색질의 기본적 반복 단위인 뉴클레오솜 (nucleosome)은 각각 2개의 H2A,H2B, H3,H4로 이루어진 중심 histone단백복합체를 둘러싼 147개의 DNA 염기들로 구 성된다.¹²이 중 H2A의 주요 구성 성분인 H2AX의 역할에 관한 여러 연구가 발표 되고 있고,이것은 다른 histone처럼 세린 (Ser1)의 인산화,리신 (Lys5)의 아세 틸화 등의 여러 변형된 형태를 갖는다.²³ 세포가 이온화된 방사선에 노출될 때 H2AX가 급속히 인산화됨이 밝혀졌으며,¹³특히 DNA 손상의 한 형태인 이중나선 손상 (doublestrandbreaks;DSBs)주위 염색질에서 과도하게 인산화됨이 보고되 었다.¹⁴Rogakou 등²⁴은 세포가 DNA 손상을 받아서 이중나선손상 (DSBs)이 발생 하게 되면 H2AX의 serine139에서 인산화가 발생하게 되고 DNA 손상신호전달단 백질과 DNA 손상복구단백질이 유전자 손상장소에 보충된다고 보고하였으며,아울 러 γ-H2AX가 염색질의 구조를 변화시켜 유전자 손상복구단백질을 이중나선손상 (DSBs)부위로 유도하는 역할을 수행한다고 여기고 있다.따라서 이러한 H2AX의 인산화 여부를 통해 DNA 손상,그 중 특히 빈번하게 발생하는 이중나선손상 (DSBs)의 발생 유무 및 손상 정도를 판단할 수 있다.²⁵DNA 이중나선손상 (DSBs) 은 DNA 손상의 가장 심각한 형태 중 하나이고,이에 의해 세포주기 억제,DNA 수복 활성화,세포고사 등의 반응이 야기될 수 있다.저자의 경우 실험적으로 정계 정맥류를 만든 쥐에서 γ-H2AX 발현이 앞에서 언급한 p53과 비슷한 양상으로 증 가한 것으로 보아 DNA 손상의 한 형태인 이중나선손상 (DSBs)이 발생하였음을 가늠할 수 있었으며,이를 통해 세포고사 등에 의한 정자세포 손상이 야기되지 않 았나 생각할 수 있었다.이 외에도 γ-H2AX는 DNA 복제,세포사멸의 초기단계, 비정상적으로 기능을 수행하는 염색체말단 등에서 관찰이 가능한 것으로 알려져 있다.아직까지 정계정맥류로 인한 비정상 정자생성 및 불임에 대한 정확한 기전 및 원인이 밝혀지지 않았으며 이를 확인하기 위한 여러 방법이 제시되고 있으나

아직 합의된 방법은 없는 실정이다.최근 세포자멸사와 ROS에 의한 정자 DNA 손 상이 비정상 정자형성 및 불임에 관여함을 보고하는 많은 연구가 있으나 좀 더 추 가적인 연구가 필요하며,다른 손상 단백질 및 복구 단백질을 밝히는 연구와 더불 어 정계정맥류 교정 후 세포자멸사와 p53발현 및 H2AX의 인산화 현상이 감소하는 지 여부 또한 확인해야 할 것으로 여겨진다.

2.수신증 흰쥐 모델 콩팥에서 p53및 γ-H2AX의 발현

대다수의 요로질환은 수신증을 동반하며 수신증은 다양한 원인에 의해 발생할 수 있으나 기계적,기능적 요로폐색이 거의 대부분의 원인을 차지한다.기계적 폐색의 호발부위는 신우요관이행부,요관방광이행부,방광경부,외요도구 등이고,그 원인 으로는 요로 자체의 내인성 질환에 의한 일차적 폐색과 주위 다른 장기나 구조물 등의 외인성 질환에 의한 이차적 폐색이 있다.전자의 경우는 요석,종양,결핵이나 농양 등으로 인한 염증성 협착,선천성 협착 등이 대표적 원인이며,후자의 경우는 이행혈관,후복막강종양,섬유증식증,하대정맥후요관 등에 의해 요로가 압박된 것 이다.해부학적 폐색이 없이도 신우요관이행부의 구조적 결함,거대요관 등의 요관 연동운동장애,방광요관역류,배뇨근괄약근부조 등으로 인해 요류의 장애가 있을 수 있는데 이를 기능적 폐색이라 한다.요관 주위의 염증,종양,섬유증식증 등으로 요관이 주위 조직에 유착되거나,요관의 심한 염증 등으로 요관의 연동운동이 저하 되면 기능적 폐색을 일으킬 수 있고,기능적 폐색도 진행되면 이차적으로 기계적 폐색을 일으킬 수 있다.이러한 폐색성 요로병변은 신세뇨관의 위축,간질의 염증 성 변화 및 섬유화로 인해 신장에 많은 손상을 가져온다.^4-6초기에는 폐색이 있더 라도 신장의 위축이나 괴사가 일어나지 않고 지속적으로 요가 생성되며,그로 인해 신우내 압력이 점차 높아지게 된다.이 압력에 의해 저류되어 있는 요는 신우세뇨 관역류,신우림프관역류,신우간질역류,신우정맥역류 등의 기전으로 흡수되며 이런 현상이 반복됨으로써 초기에는 평형을 이루어 신기능이 보존되다가 시간이 경과하 면 평형 상태가 깨지면서 신우와 신배는 확장되어 수신증을 초래하게 된다.수신증 의 초기 병변은 신배에서 나타나는데 정상적으로 보이는 포도주잔 모양의 배상 (cupping)이 소실되며 신유두부가 평평하게 되어 원개의 끝이 무뎌지거나

(blunting)곤봉 모양 (clubbing)으로 변하게 된다.신실질이 손상을 받는 기전은 역 압의 증가로 인해 초래되는 압박위축과 신혈류의 변동으로 인한 국소적 허혈로 야 기된다.¹⁴즉 팽창된 신우 내의 증가된 압력이 신세뇨관으로 전달되어 세뇨관이 확 장되고,엽간동맥과 궁상동맥이 압박되어 국소적 허혈이 초래된다.폐색의 초기에 는 신혈관의 일시적인 확장이 일어나나,일정 시간이 지나면 세뇨관의 압력 증가나 염증 반응 뿐 아니라 thromboxaneA2,angiotensin II,prostaglandin,vasopressin, atrialnatriureticpeptide,kallikrein-kinin system,acetylcholine,nitricoxide등의 혈관 작용 물질들이 국소적으로 작용하여 혈관 수축이 일어나 혈류의 저항이 증가 하게 되고 결과적으로 세포들은 신혈류의 감소로 인해 위축에 빠지게 된다.^26,27 요관 폐색을 일으켜 수신증을 야기시킨 쥐의 신세뇨관 및 신간질 세포에서 Fas, Fasligand,tumornecrosisfactorreceptor-1 (TNFR-1),TNF-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)등의 세포고사 관련 물질들이 증가함을 보고하였다.²⁸또 한 요관 폐색에 의한 수신증 발생시 세포고사 표지자인 caspase의 발현 증가를 확 인하는 등 폐색 후 수신증으로 인한 신손상에 세포고사가 관련되어 있음이 증명되 어 왔다.²⁹그러나 현재까지 알려진 수신증에서의 조직 손상에 관한 일련의 과정은 일부분에 지나지 않으며 명확한 주요 기전 및 병태생리를 밝히기 위한 많은 연구 가 시도되고 있다.

특히 아직까지 수신증에 의해 야기된 DNA 손상과 그 관련 인자의 발현에 관한 연구는 문헌상으로 드문 실정이다.DNA는 환경에 존재하는 화학물질,방사선,노 화,활성산소 등의 여러 요인에 의해 손상을 받으며,이러한 DNA 손상으로는 DNA 염기의 화학적 변화,DNA 복제 중 잘못된 쌍을 이룬 염기의 mismatch, singlestrandbreaks(SSBs)와 doublestrandbreaks(DSBs)같은 DNA backbone 의 절단,염기 사이의 공유결합 등의 몇 가지 종류가 있다.³⁰각각의 DNA 손상에 따라 그것을 인지하여 수복하는 특정 DNA 복구 시스템이 존재하며,이런 수복 시 스템으로는 DNA 손상 부위를 인식하여 절개하고 새로 합성하는 excision repair (baseexcision repair,nucleotideexcision repair),잘못 짝지어진 DNA 염기 배열 을 수복시키는 mismatch repair (MMR),끊어진 DNA 이중나선구조를 상동성 (homologous) 또는 비상동성 (non-homologous)으로 수복시키는 recombination

repair(=doublestrandbreak repair)등이 있다.^31,32본 연구는 DNA 손상 및 복구 관련 인자를 통해 수신증에 대한 DNA 손상,그 중 특히 심한 형태인 이중나선손 상 (DSBs)의 역할 등을 규명하고자 하였다.

p53의 발현은 유해인자에 의한 DNA 손상 반응에 의해 현저하게 증가한다고 알려 져 있다.DNA의 손상이 발생하게 되면 핵의 인산화단백질인 p53은 손상이 가벼울 경우 세포주기의 G1 단계를 정지시켜 DNA 합성이 발생하는 S 단계로의 진행을 막아 DNA 복구를 유도하거나,손상이 심하면 세포고사를 유도하여 DNA 손상을 받은 세포의 비정상적인 증식을 억제하고 세포의 항상성을 조절하는 중요한 작용 을 한다.^11,33Scheinman등³⁴은 경동맥에 손상을 받은 쥐에 p53을 활성화시킴으로써 조직의 세포고사가 증가함을 보고하였다.즉 p53의 단백 발현 정도를 통해 DNA 손상 및 세포고사의 정도를 유추할 수 있으며,본 연구에서도 수신증을 유도한 군 의 p53발현이 시간에 따라 증가함을 확인함으로써 수신증에 의한 DNA 손상이 발 생되고 그로 인해 세포고사가 증가되어 신실질의 손상이 발생될 수 있음을 추측할 수 있었다.DNA 손상과 관련된 세포고사의 과정에 p53에 의한 신호전달이 중요하 다는 것은 밝혀졌지만,많은 연구에도 불구하고 p53과 연관된 자세한 세포내 반응 및 세포 운명과 관계된 과정은 아직까지 많은 부분들이 명확하게 규명되지 않았으 며,특히 DNA가 손상을 받은 후 p53이 DNA 복구를 유도할 것인지,세포고사를 야기할 것인지를 결정짓는 인자 및 신호전달체계는 밝혀지지 않았다.Darnton등³⁵ 은 비정상적인 p53의 발현이 발암성 질환의 초기 진단에 임상적 의의를 지닐 수 있다고 하였고,마찬가지로 대부분의 악성 종양은 p53유전자의 돌연변이나 발암성 단백질의 결합으로 인한 불활성화를 나타내고 있다.DNA 이중가닥절단 (double strand breaks;DSBs)에 대한 복구 과정은 보통 두 가지 경로를 통하는데 하나는 비상동말단결합 (non-homologousend joining;NHES)과 다른 하나는 상동재결합 (homologousrecombination;HR)이다.³⁶H2AX는 H2A의 주요 구성성분으로 포유 동물에서 세포주,조직의 종류에 따라 2-25%를 차지하는데,^13,37histone의 H2AX는 다른 histone과 마찬가지로 여러 변형된 형태를 갖게 되는데,대표적으로 세린 (Ser 1)의 인산화,리신 (Lys5)의 아세틸화 등이 여기에 해당된다.²³세포가 DNA손상을 받게 되면,급격히 H2AX의 세린에 인산화가 발생하게 되고,DNA 손상신호 전달

단백질과 DNA 복구단백질이 유전자 손상장소에 보충된다.¹³DNA손상반응에 관여 하는 요소들인 ATM, BRCA1, 53BP1, MDC1, RAD51, MRE11/RAD50/NBS1 (MRN)복합체 등은 방사선유발손상초점 (ionizing radiation induced foci;IRIF)을 형성하여 γ-H2AX초점과 공존 (co-localize)하게 되는데,이 핵내영역 (IRIF)들은 DSBs주변에 수백 내지 수천 개의 물질들이 모여 있는 구조라고 추측되고 있다.

또 γ-H2AX에 대한 면역조직화학염색 결과,핵 초점들 (nuclearfoci)라 불려지는 DSBs를 둘러싸고 있는 인산화된 H2AX 크로마틴 부분이 나타남을 알 수 있었다.¹⁴ 인산화된 H2AX의 급격한 생성과 증폭으로 인해 γ-H2AX foci와 DSBs는 거의 1:1 로 상응하게 되어²⁵,γ-H2AX를 염색하는 것은 DSBs를 검출하는 가장 유용한 방 법으로 사료되고 있다.아울러 H2AX가 유전자 손상 복구 단백질을 유도하는 역할 도 수행한다고 여겨진다.^38,39본 연구에서도 γ-H2AX 발현이 실험군에서 증가하였 으며,이러한 결과는 앞에서 언급한 p53발현 정도와 비슷한 결과를 보임으로써 수 신증에 의한 신실질 손상을 재차 확인할 수 있었다.

수신증으로 인한 신실질 손상의 여러 주요 기전들에 관한 많은 연구들이 발표되고 있으나 아직까지 합의된 정확한 기전 및 원인이 정립되지 않은 실정이다.향후 과 제로는 수신증 교정 후 p53,γ-H2AX의 발현 감소 여부를 파악함과 동시에 다른 유전자 산물에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이고,더 나아가 지금까지 알려진 다른 기전들을 검토하여 종합적이며 체계적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각 한다.

Ⅴ.결 론

본 연구는 비뇨기 질환 중 정계정맥류와 수신증을 유발한 백서에서 DNA 손상관련인 자인 p53,γ-H2AX의 발현이 시간에 따라 증가되었다.이를 통해 DNA 이중나선구 조의 손상이 생식세포의 손상 및 신실질 손상을 유발하는 주요기전일 가능성을 확 인하였다.향 후 불임 및 수신증에 의한 조직 손상 예방 등에 실질적으로 도움이 될 수 있는 기초자료로 이용하기 위해서는 향후 더욱 다양한 관련 인자 및 상관관 계에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 여겨진다.

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Fig 1.Immunohistochemicalstainingforp53invaricocele-inducedrat.Expression ofp53atthirdandfourthweeks(B,C,D)wereincreasedcomparedtothecontrol group(E,F).A:lefttestisofthevaricocele-inducedratafter2weeks,B:lefttestis ofthevaricocele-inducedratafter3weeks,C:lefttestisofthevaricocele-induced ratafter4weeks,D:righttestisofthevaricocele-inducedratafter4weeks,E:

lefttestisofthesham-operatedratafter4weeks(controlgroup),F:righttestisof thesham-operatedratafter4weeks(controlgroup).

Fig 2.Immunohistochemicalstaining forγ-H2AX invaricoceleinducedrat. Expressionof phosphorylationofH2AX at3,4weeks(B,C,D)wereincreased comparedtocontrolgroup(E,F).A:lefttestisofthevaricocele-inducedratafter2 weeks,B:lefttestisofthevaricocele-inducedratafter3weeks,C:lefttestisof thevaricocele-inducedratafter4weeks,D:righttestisofthevaricocele-induced ratafter4weeks,E:lefttestisofthesham-operatedratafter4weeks(control group),F:righttestisofthesham-operatedratafter4weeks(controlgroup).

Fig 3.Westernblottingofp53andγ-H2AX expressedinthevaricocele-induced rattestes.Proteinextractedfrom rattestiswith(2nd,3rdand4thweeks)or

without(4thweeks)partialligationofleftrenalveinisanalyzedforthep53, γ-H2AX,andactinlevelsbywesternblotting.Theexpressionofp53andγ-H2AX atweek3and4aresignificantlyhighercomparedtocontrolgroupandthe

varicocele-inducedrats2weekspostoperatively.

Fig 4. Immunohistochemical staining for p53 in hydronephrosis-induced rats. Expressionsofp53after1,2and3weeks(B,C andD)areincreasedcomparedto thecontrolgroup (A),and arein themodeofincreaseastimepasses.Expression oftubuleishigherthan thatofglomerulus,andtubuleisin themodeofdilatation astimepasses.(A)Rightkidney ofthesham-operatedratsafter3weeks(control group),(B) Right kidney of the hydronephrosis-induced rats after 1 week,(C) Rightkidney ofthehydronephrosis-inducedratsafter2weeks(D)Rightkidney of thehydronephrosis-inducedratsafter3weeks.

Fig 5 Immunohistochemicalstaining forγ-H2AX in hydronephrosis-induced rats. Expressions of γ-H2AX after 1,2 and 3 weeks (B,C and D) are increased comparedtothecontrolgroup(A),andareinthemodeofincreaseastimepasses. Expression oftubule is higher than thatofglomerulus.(A)Rightkidney ofthe sham-operated rats after 3 weeks (control group), (B) Right kidney of the hydronephrosis-induced rats after 1 week, (C) Right kidney of the hydronephrosis-induced rats after 2 weeks, (D) Right kidney of the hydronephrosis-inducedratsafter3weeks.

Fig 6Western blotting ofthep53and γ-H2AX expressed in renalparenchymeof hydronephrosis-inducedrats.Theexpressionsofp53and γ-H2AX arein themode of increase as time passes,and expressions of controls are in a low levelor negative.

저작물 이용 허락서

학 과 의학과 학 번 20067356 과 정 박사 성 명 한글: 문형윤 한문 : 文 炯 允 영문 : Moon Hyung Yoon 주 소 광주 광역시 남구 진월동 한국아델리움 102동 104호

연락처 E-MAIL : mu-hn@hanmail.net

논문제목

한글 : 실험적으로 정계정맥류 및 수신증을 만든 쥐에 있어서 p53및 ɤ-H2AX의 발현

영어 :Theexpressionofp53andɤ-H2AX inexperimental inducedvaricoceleandhydronephrosisinrat

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동의여부 :동의( O ) 반대( ) 2009년 8월

저작자: 문 형 윤 (서명 또는 인)

조선대학교 총장 귀하