과발현 07

(1)

림프구 수용체 유전자의 구성 과 발현

 면역글로불린 유전자 구조의 수수께끼

 Ig 유전자의 다중유전자 구성

 V(D)j 재조합의 기전

 B 림프구 수용체의 발현

 T 림프구 수용체 유전자와 발현

07

(2)

서론 (211)

 림프구의 특이 수용체는 면역계의 고유하고 다양한 유전학적 기전을 사용하여 생산됨

 1987년, S. Tonegawa



“1개의 유전자가 1개의 폴립펩티드 사슬을 암호화한다”는 핵심개념에 도전함



항체의 다양성을 만드는 유전학적 원리를 발견함



Tonegawa 연구팀은 배선세포에서 항체의 경쇄가 3개의 유 전자 조각군에 의해 암호화되어 있음을 증명함 (7.1)

 B 림프구에서 각 조각군에서 온 2개의 DNA 조각이 연결되어 Ig 유전자의 경쇄의 완성된 가변부위를 이룸

 나머지 1개의 조각은 불변부위를 암호화함

 Tonegawa는 후속 연구에서 모든 B 림프구와 T 림프

구의 수용체 유전자들이 유사한 재조합으로 여러 유

전자 조각들이 연결됨을 증명함

(3)

(4)

7-1 면역글로불린 유전자 구조의 수수께끼 ⁽²¹¹⁾

 항체는 다양한 종류(>10¹⁰)의 병원체들에 특이적으로 결 합해야 함

 제한된 수의 유전자로 면역계가 생산할 수 있는 항체의 레퍼토리 가 엄청나게 다양해야 함

 항체 중쇄와 경쇄의 N-말단 첫 110개의 아미노산 서열^(가변

부위)이 다양함

 나머지 불변부위는 아미노산 서열이 거의 일정함 (4종류의 경쇄 서열, 8종류의 중쇄 서열) (7.2)

 진화과정에서 불변부위만이 보존됨

 가변부위와 불변부위가 서로 다른 유전자에 의하여 암호화되어 있음을 시사함

 동일한 가변부위가 2개 이상의 불변부위와 연결된 항체들 이 존재함

 항체의 가변부위와 불변부위의 발현이 따로 조절될 가능성을 시 사함

(5)

(6)

1. 항체 유전자의 2가지 초기 이론적 모델이 제시되다 ⁽²¹²⁾

 배선이론

(germ-line theory)

 배선세포의 유전체에 각 항체에 대한 유전정보가 저장 되어 있음 (DNA의 양이 충분하지 않음)

 항체의 중쇄와 경쇄 유전자가 유전체에 분리되어 암호 화되어 있다가 불변부위와 가변부위의 각 조각들 중 하 나씩이 B 림프구로 전달되어 완전한 항체의 중쇄와 경 쇄 유전자를 형성함 (1965년, Dreyer & Bennett의 제안)

 체세포 과돌연변이 이론

(somatic hypermutation theory)

 제한된 수의 항체 유전자들이 체세포에서 알려지지 않 은 돌연변이 기전으로 성숙한 B 림프구의 다양한 수용 체 레퍼토리가 만들어짐 (돌연변이가 불변부위에서만 일어남?)

(7)

2. 다중의 유전자 조각들이 경쇄를 암호화함이 밝혀지다 ⁽²¹³⁾

 1987년, Tonegawa & Hozumi

 다중의 유전자 조각들이 항체 경쇄를 암호화하고 있음을 증명함

 실험

 배아 간충직 세포에서 추출한 DNA의 가변부위와 불변부위 사이 에 BamH1 제한효소자리가 있음을 확인함

 배아세포의 DNA와 B 림프구의 DNA를 BamH1으로 처리하고 전 기영동한 후 가변부위 탐침으로 확인함 (a)

 배선세포에서 서로 분리되어 있던 2개의 유전자 조각이 B 림프구 로 분화하는 과정에서 DNA가 잘렸다가 다시 연결되어(재조합) 경쇄 유전자가 형성됨

 경쇄 유전자의 염기서열을 분석한 후속 연구 ^(7.3)

 배선세포 경쇄 유전자의 가변부위 5’ 말단에 리더서열이 있음

 경쇄 가변부위와 일정부위 사이에 1,250bp의 연결(J) 유전자 조각 이 있음 (J 조각도 가변부위를 이룸)

 중쇄 가변부위 유전자는 V, J 조각 외에 다양성(D) 유전자 조각이 포함됨

(8)

(a)

(9)

(10)

7-2 Ig 유전자의 다중유전자 구성 ⁽²¹⁴⁾

 Ig 단백질은 2개씩의 동일한 경쇄와 중쇄로 구성 됨

 경쇄는 κ와 λ 중 하나를 가짐

 경쇄 κ, 경쇄 λ, 중쇄 유전자군은 서로 다른 염색체에 암호화되어 있음 (표7.1)

(11)

1. Κ 경쇄 유전자들은 V, J, C 조각을 포함한다 ⁽²¹⁴⁾

 마우스의 κ 유전자 자리의 구성

 91개의 기능성 V_κ 유전자 조각과 하위부분에 4개의 기 능성 J_κ 유전자 조각, 그리고 1개의 위유전자, 그리고 1 개의 C_κ 유전자가 있음 (7.4a)

 V_κ 유전자 조각들은 서로 5~100bp 떨어져 있음

 V_κ 유전자 조각 각각의 앞에는 선도서열이 있음

(7.4a)

(12)

(13)

2. λ 경쇄 유전자들은 각 J 조각과 특정 C 조각을 짝지운다

⁽²¹⁵⁾

 마우스의 λ 유전자 자리의 구성

 3개의 기능성 V_λ 유전자 조각이 있음 (7.4b)

 3개의 C_λ 유전자 조각이 각각 해당 J 유전자 조각과 연 관됨

 V_λ 유전자 조각은 하위의 J C_λ 유전자 조각과 재조합됨 (하위 방향으로만)

 V_λ2J_λ2C_λ2, V_λ2J_λ3C_λ3, V_λ2J_λ1C_λ1

 V_λ3J_λ2C_λ2, V_λ3J_λ3C_λ3, V_λ3J_λ1C_λ1

 V_λ1J_λ3C_λ3, V_λ1J_λ1C_λ1

(7.4b)

(14)

3. 중쇄유전자는 V, D, J, C 조각으로 구성된다 ⁽²¹⁵⁾

 마우스의 중쇄 유전자의 구성



약 101개의 V_H 유전자 조각, 하위 부분에 14개의 기능성 D_H 유전자 조각, 4개의 J_H 유전자 조각들이 가변부위를 암호화 함 (7.4c)



가변부위 하위 부분에 불변부위를 암호화하는 C_H 유전자 조각(C_μ ~ C_α)이 있음

 사람의 중쇄 유전자의 구성



최소 38개의 V_H 유전자 조각, 30개의 기능성 D_H 유전자 조 각, 6개의 J_H 유전자 조각, C_H 유전자 조각(C_μ ~ C_α)이 있음

(7.4c)

(15)

7-3 V(D)J 재조합의 기전 ⁽²¹⁶⁾

 V(D)J 재조합

 항체의 완전한 V 부위의 암호화는 수 kb 떨어진 V, D, J 조각의 결합(중쇄)과 V, J 조각의 결합(경쇄)으로 이루 어짐

 재조합은 재조합신호서열(RSS)을 인지하는 단백질과 DNA 복구에 사용되는 효소들의 작용으로 진행됨 (표7.3)

(16)

(관절 → 연결)

(17)

1. 재조합은 신호서열에 의해 유도된다 ⁽²¹⁶⁾

 재조합신호서열

(recombination signal sequence; RSS)

 V와 J 유전자 조각 사이의 DNA 재조합을 유도하는 신 호서열 (7량체-12/23bp- 9량체 모티프) (7.5a)

 7량체 공통서열 5’-CACAGTG-3’

 12bp/23bp스페이서(1바퀴/2바퀴 스페이서)

 9량체 공통서열 5’-ACAAAAACC-3’

 RSS의 7량체는 V, D, J 암호화 서열 쪽에 위치하 고 9량체는 그 반대편에 위치함

(7.5b)

 V와 J 유전자 조각들에는 RSS가 1개씩만 위치함

 D 유전자 조각들에는 상위와 하위 부분에 RSS가 각 1 개씩 2개가 위치함

(18)

(19)

1바퀴/2바퀴 결합법칙 ⁽²¹⁶⁾

 1바퀴/2바퀴 결합법칙

(one-turn/two-turn joining rule)

 항체 유전자가 재조합될 때 12bp 스페이서를 가진 RSS^{(1바퀴 RSS)}는 23bp 스페이서를 가진 RSS^(2바퀴

RSS)와만 결합함 (7.6)

 경쇄의 V 유전자 조각 중의 하나와 J 유전자 조각 중의 하나가 결합함

 중쇄의 D 유전자 조각 중의 하나와 J 유전자 조각 중의 하나가 결합한 후 D-J 결합 조각이 V 유전자 조각 중의 하나와 결합함

(20)

(21)

2. 유전자 조각들은 RAG1/2 재조합효소에 의해 결합된다

⁽²¹⁸⁾

 항체 유전자의 재조합에 필요한 효소

^{(림프구에서만 발}

현되는)

 재조합효소 RAG1과 RAG2 (recombination activating gene

protein), 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소(TdT)

 RAG1은 RSS와 결합해서 DNA를 절단함

 RAG2는 RAG1을 안정화시킴

 TdT는 RAG1/2에 의해 잘려 생긴 DAN의 3’ 말단에 여 러 개의 염기를 무작위로 붙임

 기타 다른 종류의 효소들이 재조합 과정에 필요함

 HMG1/2, Ku78/Ku80 이량체, DNA PKcs, 아르테미스, XRCCS, DNA 연결효소 Ⅳ, cernunnos ¹⁶

(22)

3. 기능성 Ig 가변부위 유전자를 만드는 V(D)J 재조합 ⁽²¹⁸⁾

 V(D)J 재조합 과정은 여러 단계로 일어남

^{(7.7, 8)}

 RAG1/2가 DNA의 RSS에 결합하여 절단함

 아르테미스, TdT, DNA 연결효소가 절단 부위의 말단을 성형하고 절단부위를 연결함

 암호화 연결과 신호 연결이 만들어짐

 암호화 연결

(coding joint)

 재조합 과정을 통해서 만들어진 항체 가변부위 유전자 의 새로운 결합

 신호 연결

(signal joint)

 RSS들에 있는 7량체들 간의 연결

(23)

(24)

경쇄 가변부위 유전자의 재조합 과정 (218)

① RAG1/2가 RSS에 결합하여 V와 J 유전자 조각 사이를

이어줌 (7.8)

② RAG1/2가 V와 J 조각에 붙어있는 7량체 RSS의 5’ 경계 에서 단일가닥을 절단함

③ 암호화말단에 머리핀이 형성되고 신호말단이 형성됨

④ 신호말단이 연결됨

⑤ 암호화말단의 머리핀이 절단됨

⑥ 머리핀 절단 후 P 염기가 첨가될 수 있음 (P 염기 첨가;

palindromic nucleotide addition)

⑦ V와 J 조각이 연결됨

(25)

(26)

(7.8-1)

(27)

(7.8-2)

(28)

(7.8-1)

중쇄 가변부위 유전자의 추가 재조합 과정

 중쇄 가변부위 유전자의 재조합 과정에서 유전자 조각들 이 연결되기 전에 다음의 과정들이 추가로 생길 수 있음

 VD 연결과 DJ 연결에서 염기소실이 생길 수 있음 ^(7.8-1)

 N 염기가 첨가될 수 있음 (N 염기 첨가; non-template nucleotide addition)

(29)

4. V(D)J 재조합이 일어나는 방향 ⁽²²¹⁾

 항체 가변부위 유전자가 재조합 과정에서 생긴 신 호연결은 재조합된 DNA에서 떨어져 에피솜으로 남아 있다가 이어지는 세포분열 과정에서 소실됨

(7.9a)

 항체의 유전자 조각들의 일부가 반대로 놓여있는 경우(역위)가 있음

^(7.9b)

 역위되어 있는 유전자 조각이 재조합될 때 뒤집혀서 다 른 조각과 연결됨

 재조합 과정에서 에피솜이 생기지 않고 신호연결을 가 진 DNA가 재조합된 VJ 쌍의 상위에 뒤집힌 채 남아있 음

(30)

(에피솜)

(31)

5. 숫 B 림프구의 항체 다양성을 만드는 5가지 기전 ⁽²²¹⁾

 Ig 유전자의 재조합 과정에서 5가지 기전에 의해 엄청나게 다양한 항체 레퍼토리가 만들어짐

① 항체 유전자가 다중의 유전자 조각(V,D,J)으로 구성됨

② P 염기 첨가

③ Exonuclease에 의해 D-J의 연결부위와 V-DJ의 연결 부위에서 염기가 소실됨 (exonuclease trimming)

④ 중쇄의 N 염기 첨가

⑤ 중쇄와 경쇄의 무작위적인 조합 (표7.4)

(32)

7-4 B 림프구 수용체의 발현 ⁽²²³⁾

 B 림프구 표면에서 수용체의 발현은 복잡하고 잘 조절되는 과정들의 최종 결과임

 다양한 재조합 현상들이 중쇄와 경쇄 유전자 자리에서 모두 생산적 재배열이 되도록 끝내야 됨

 중쇄와 경쇄의 대립유전자가 1개씩만 발현되어야 함

 수용체가 자가항원에 결합하는 지 테스트되어야 함

(33)

1. Ig 유전자의 대립유전자 배제 ⁽²²³⁾

 B 림프구는 중쇄와 경쇄의 한쪽 대립유전자만을 발현함 (대립유전자 배제) ^(b)

 한 림프구가 하나의 항원 특이성만을 가진 수용체를 가지게 함

 Ig 유전자가 위치한 DNA가 절단된 후 V, (D), J 유전자 조 각들이 재결합하여 암호화연결이 생성될 때 암호화서열 의 해독틀이 바뀔 수 있음

 유전자 조각들이 부정확한 위치에서 연결됨

 exonuclease trimming에 의한 염기가 소실됨

 P 염기 첨가와 N 염기 첨가에 의해 염기가 첨가됨

 생산적 재배열과 비생산적 재배열

 V, (D), J 유전자 조각들이 재결합하여 생성된 암호화 서열에 정지 코돈이 포함되지 않는 경우 (생산적 재배열)

 암호화 서열에 정지코돈이 포함되어 완전한 항체사슬로 번역되지 않는 경우가 있음 (비생산적 재배열)

(34)

(b)

(35)

대립유전자 배제의 과정 (223)

 중쇄 유전자가 위치한 상동염색체 쌍의 한쪽에서 유전자 재배 열이 시작됨

 중쇄 사슬이 생산되고 대리 경쇄^(VpreB와 λ5 단백질로 구성됨)와 함께 세포 표면에 발현됨(pre-BCR) ^(7.10)

 pre-BCR이 다른 쪽 상동염색체에서 중쇄 유전자의 재배열을 억제하 고 κ 유전자가 위치한 상동염색체 쌍의 한쪽에서 유전자의 재배열을 유도함 (7.11)

 먼저 시작된 한쪽 대립유전자의 재배열이 비생산적으로 되면 다른 쪽 대립유전자의 재배열이 일어남

 두 번째 대립유전자의 재배열도 비생산적으로 일어나면 B 림프구는 죽음

 중쇄 유전자의 재배열이 생산적으로 일어나고 경쇄 유전자의 재배열도 생산적으로 일어나면 B 림프구 표면에 BCR이 발현 됨

 중쇄 유전자의 재배열이 생산적으로 일어난 후 경쇄(κ, λ 모두) 유전 자가 비생산적으로 일어나도 B 림프구는 죽음

(36)

(37)

(38)

2. 경쇄에서 일어나는 자기반응성 수용체의 수용체 편집 ⁽²²⁴⁾

 수용체 편집

 미성숙 B 림프구에서 항원수용체가 완성된 후에 자기반응성으로 판명되면 DNA 재배열이 다시 작동하여 수용체를 다른 것으로 교 체함 (7.12)

(39)

3. Ig 유전자의 전사는 엄격하게 조절된다 ⁽²²⁵⁾

 Ig 유전자들은 B 림프구에서 유래한 세포에서만 발현 됨



Ig 유전자의 발현은 전사인자에 의해 조절됨

 Ig 유전자가 재배열되기 전에 (촉진자와 증폭자가 멀 리 떨어져 있어서) RNA 중합효소Ⅱ는 TATA 박스에 매우 약하게 결합함



전사율이 매우 낮음

 Ig 유전자가 재배열된 후에 촉진자와 증폭자가 가깝 게 위치하게 되어 (전사인자의 촉진자와 증폭자와의 상호작용이 효율적임) RNA 중합효소Ⅱ는 TATA 박스 에 매우 강하게 결합함

(7.13)



전사율이 10⁴ 배 증가함

(40)

(41)

4. 성숙 B 림프구의 IgM과 IgD 동시 발현 ⁽²²⁶⁾

 미감작 B 림프구의 중쇄의 1차 전사체에는 C_μ와 C_δ 불변부위 가 모두 포함되어 있음 (7.14)

 C_μ와 C_δ 불변부위의 엑손 M1와 M2는 C_H4 영역의 막통과 부분과 세 포질 부분을 각각 암호화함

 C_μ와 C_δ 불변부위의 엑손 S는 C_H4 영역의 수용성 부분을 암호화함

 엑손 S와 M2의 하위에 폴리-A 자리가 있음

 골수의 미성숙 B 림프구에서 폴리-A 자리 2에 폴리-A가 첨가됨

 RNA 이어맞추기로 S 서열이 제거되고, 남은 M1, M2가 C_μ C_H4에 연 결되어 막결합형 수용체 IgM가 발현됨

 B 림프구가 성숙해지면 막결합형 수용체 IgD도 발현함

 폴리-A 자리 4에 폴리-A가 첨가되고 C_μ가 제거되어 IgD가 발현됨

 성숙 B 림프구는 항원 자극에 의해 분비형 IgM을 만들어냄

 폴리-A 자리 1에 폴리-A가 첨가되고 하위 부분이 제거되어 IgM이 분 비됨 (7.15)

 폴리-A 자리 3에 폴리-A가 첨가되고 하위 부분과 C_μ가 제거되어 IgD 가 분비됨

(42)

12

(43)

(44)

(45)

7-5 T 림프구 수용체 유전자와 발현 ⁽²²⁹⁾

 항원수용체로 B 림프구에는 BCR이 발현되고 T 림프구에는 TCR이 발현됨

 BCR과 TCR은 각각 항원특이성을 가짐

 BCR(Ig)은 경쇄와 중쇄 각각 2개씩으로 구성되어

있고 TCR은 2개(α와 β 또는 γ와 δ)의 사슬로 구

성되어 있음

(46)

1. TCR 구조의 이해는 TCR 유전자의 발견에 중요했다 ⁽²²⁹⁾

 TCR 단백질의 구조

 이형이량체(αβ 또는 γδ)인 TCR의 각 사슬은 1개의 가 변부위와 1개의 불변부위로 구성됨

 각 사슬은 Ig의 접혀있는 영역처럼 배열된 부위를 가짐

(7.16)

 TCR의 구조는 TCR을 암호화하는 유전자들의 잠

재적인 배열에 대한 단서를 제공함

(47)

(48)

2. β 사슬 유전자가 두 연구실에서 동시에 발견되었다 ⁽²²⁹⁾

 1984년,



Davis & Hedrick 그룹은 마우스 T 림프구 잡종세포에서 TCR 유전자를 분리함



Mak 그룹은 사람세포에서 TCR 유전자를 분리함

 Davis & Hedrick 그룹은 다음의 가정을 기초로 하여 TCR 유전자를 분리함



TCR 유전자는 T 림프구에서는 발현되지만 B 림프구에서는 발현되지 않음



유전자는 막결합 수용체를 암호화하며 전사된 mRNA는 막 결합 폴리솜에 붙어있음



Ig 유전자와 같이, TCR 유전자도 1개의 가변부위와 1개의 불변부위를 암호화함



Ig 유전자와 같이, TCR 유전자도 재배열 함

(49)

Davis & Hedrick 그룹의 실험 ⁽²³⁰⁾

 T 림프구 잡종세포의 막결합 폴리좀의 mRNA를 추출함

(7.17)

 mRNA를 역전사하여 cDNA를 합성함

 T 림프구의 cDNA와 B 림프구 mRNA를 섞어

mRNA와 혼성된 cDNA를 제거함 (T 림프구 특이 적인 cDNA만 남음)

 T 림프구 특이적인 10개의 cDNA 클론들을 전기

영동하고 탐침

(TM86 cDNA)

으로 확인하여 TCR 유전

자를 분리함

(50)

(51)

3. α 사슬 유전자를 찾다가 γ 사슬 유전자를 대신 찾다 ⁽²³¹⁾

 Tonegawa 연구실이 TCR α 사슬의 전형적인 특 징을 보이는 유전자를 클로닝함

 Tonegawa 연구실이 클로닝한 TCR α 사슬과 다 른 특징을 보이는 사슬을 다른 연구실에서 발견함 (γ 사슬)

 Davis 연구실이 네 번째 사슬을 발견함 (δ 사슬)

 T 림프구에서 α 사슬이 재배열되면 δ 유전자가 소실됨 을 확인함 (7.18)

(52)

(53)

 4개의 TCR 유전자는 서로 다른 염색체 상에 위치함 ^(표7.6)

 TCR 유전자는 Ig 유전자와 유사하게 구성됨 (7.18)

 α 사슬 유전자는 가변부위를 암호화하는 다중의 V_α, J_α 유전자 조각 과 불변부위를 암호화하는 C_α로 구성됨

 β 사슬 유전자는 가변부위를 암호화하는 다중의 V_β, D_β, J_β 유전자 조 각과 불변부위를 암호화하는 C_β로 구성됨

 γ 사슬 유전자는 가변부위를 암호화하는 다중의 V_γ, J_γ 유전자 조각과 불변부위를 암호화하는 C_γ로 구성됨

 δ 사슬 유전자는 가변부위를 암호화하는 다중의 V_δ, D_δ, J_δ 유전자 조 각과 불변부위를 암호화하는 C_δ로 구성됨

4. TCR 유전자는 Ig 유전자와 유사하게 재배열된다 ⁽²³¹⁾

(54)

TCR 유전자의 재배열 ⁽²³²⁾

 TCR 유전자는 다중의 유전자 조각(V, D, J, C)으로 구 성됨

(표7.7)

 다중의 유전자 조각들이 재배열하여 기능성 TCR 유 전자를 형성함



α, γ 사슬은 V, J 조각의 재배열로 가변부위 유전자가 형성 됨



β, δ 사슬은 V, D, J 조각의 재배열로 가변부위 유전자가 형 성됨

 TCR 유전자의 재배열 과정은 Ig 유전자의 일반적인 재배열 과정을 따름



모든 사슬 유전자에서 N 염기 첨가가 일어남(Ig는 중쇄에서 만)



불변부위 유전자가 다양하지 않음

(55)

(56)

5. TCR의 발현은 대립유전자 배제로 조절된다 ⁽²³⁴⁾

 TCR 유전자의 발현에서 대립유전자 배제는 BCR 유전자의 발현에서만큼 일어남

 TCR은 기능성을 결정하기 위해 가슴샘에서 2번 의 테스트를 거침

 MHC 항원을 인지할 수 있는 기능성 TCR를 가진 T 림 프구만이 생존함 (양성선택; positive selection)

 고친화력으로 MHC 항원과 함께 자가 단백질을 인지하 는 TCR를 가진 T 림프구는 제거됨 (음성선택; negative selection)

(57)

6. TCR 유전자 발현은 엄격하게 조절된다 ⁽²³⁵⁾