Effects of Glucose and Chloramphenicol on the Expression of Promoter from Alkali-Tolerant Bacillus sp. chromosomal DNA

Koγ ]. Appl. Micγ.obiol. Biotech Vol. 18, No. 2, 137-141 (1990)

글루코오스와

Chloramphenicol

Bacillus

Y A-14 Promoter

김인규 • 이석훈 • 조형용 • 변유량 유주현 연세대학교 식품공학과

Effects of Glucose and Chloramphenicol on the Expression of Promoter from Alkali-Tolerant Bacillus sp. chromosomal DNA

Kim In-Gyu, Seok-Hoon Lee, Hyung-Yong Cho, Yu-Ryang Pyun* and Ju-Hyun Yu Department 0/ Food Engineering, Yonsei University, Seoul 120-749, Korea

The promoter from alkali-tolerant Bacillus sp_ YA-14 chromosomal DNA is unexpressed in vegetative- ly growing cells under excess glucose_ After glucose in the medium consumed nearly completely, the activity of the inserted promoter was dramatically increased, and its maximum activity was attained in the initial stage of sporulation_ The plasmid cloned in Bacillus sp_ YA-14 was stable for 40 hours_

The optimal initial concentrations of glucose and chloramphenicol were 1 g/l and 10 μ g/ml， respectively for the maximum expression of the promoter_

Bacillus 속 미생웅은 효소들을 세포외로 분비할 수 있 본 연구에서는 promoter 의 활성에 미 치는 글루코오스 고 (1-3) ， 항생울질 빚 생물학적 살충물질 등을 생산할 와 chloramphenicol 의 농도 영호열 살펴보고 활성을 최 수 있으며 바교적 고온에서도 생육이 가능하며， 인체에 대화할 수 있는 그 적정농도플 밝혔다.

미치는 독성이 없어 E. co1i 에 이어 채조합 DNA 의 숙

주로 널리 연구되고 있다 (4-6) . 그러나 재조합 DNA 의 재료 및 방법 Bacillμs 내에서의 불안정성 protease 의 생성 빚

expreSSlon vector 의 한정 등이 그 단정 A로 지적되어 왔다.

Yu 등 (7 ， 8) 은 산업적 유용 단백질의 대량생산을 위한 expreSSlon vector 개 발의 일환으후 Baci‘IIμ5 probe

vector 안 pPL 703 에 토양에서 분리한 알카라내성

Bacillus 속 YA-14 의 chromosomal DNA 로부터 활성 이 높은 promoter 플 doning 하고， 이를 공여균주에 도 입시켜 그 특성을 보고한 바 있다. Promoter 가 doning 딘 채조합 플라스미드 p-12B1 은 현재 사용되고 있는 expreSSlon vector 인 pPL 708 보다 약 3 배 강력 하며

CAT

Key words: Bacil/us sp _ promoter, CA T

*Corresponding author

137

사용균주

사용균주는 Yu 등 (7,8) 이 개 발한 plasmid DNA

p-12B1 을 함유한 알카리내성 Bacillμs 속 YA-14 로서，

plasmid DNA p-12Bl 은 promoter probe vector pPL 703 의 제한효소 절단부위와 BamH1 과 Pst 1 위치 사 이 에 , Bacillμs 속 YA-14 자체 chromosomal DNA 의 강력한 promoter 가 doning 되어 있다.

배양

균의 보존배지로는 ‘NY agar broth 를 사용하였고 균의 배 양을 위 해 서 는 2

x

재조합 균주는 500m1 삼각 플라스크 배양 및 21 발효 조 (Marubishi Co., Model MD-250) 플 이용하여 work- ing volume 11, 교반속도 300 rpm, 30.C 벚 통기 량 1

138

vvm 의 조건에서 배양하였다. 균체량은 균체 현탁액의

optical density 를 550nm 에서 측정 하여 , 미 리 작성 한 검량곡선으로부터 구하였다.

글루코오스 농도 및 CAT 활성 측정

배양액 중에 잔존하는 글루코오스 농도는 Enzyme Kit (Sigma Co., Catalog No.5 1O-A) 를 이용하여 정 량하였 다.

CAT 활성측정은 Hitachi model 200-20 spectro photometer 를 이용하여 Show 등(1 0) 의 방법을 약 깐 수정하여 측정하였다• CAT 의 1 unit 는 3TC 에서 acetylation 되 는 chloramphenicol 의 micromole 수로 나타내었다. CAT 비활성은 CAT unit 플 균체량으호 나눠준 값을 CAT 비활성값으로 하였다.

Plasmid 의 안정성 및 포자형성도 측정

시간별로 채취한 시료를 적당히 희석한 후 chloram-

phenicol 이 첨가되지 않은 평판배지에 도말하여， 24 시 간 후 생성 된 colony 를 100 개 이 상 chloramphenicol 이 첨가된 평판배지에 옮기고 24 시간 동안 배양하여 생 성된 colony 수를 세어 그 비율을 계산하였다.

배양시간에 따른 균주의 포자 형성도는 위상차 현미경 (Olympus Co., 15X 40) 을 이용하여 적당히 희석한 시료 를 육안으로 관찰하였다.

결과 및 고찰

생육시기에 따른 CAT 의 활성

BaèillμS sp. promoter 의 공 여 균 주 인 알 칼 리 내 성 BaèillμS sp. Y A-14 내에서의 발현특성을 살펴보기 위하 여 0.1% 글루코오스외 10μ g/ml 의 chloramphenicol

이 첨가된 2xSSG 에 배양하면서 일정한 시간간격무로

CAT 활성을 측정하였다. Fig.1 을 살펴보면 Yu 등 (8) 이 보고한 것과 같이 글루코)잎스가 거의 고갈된 대수증 식기 말기인 배양 4 시간부터 CAT 의 활성이 급격히 증 가되기 시작하여 배양 8 시간 후에 비활성은 120U/g

cell 로 최대값을 보l 이고 그 이후에 급격히 감소하였다.

CAT 비활성이 최대값을 나타내는 시기는 배양액 중 글 루코오스가 완전히 고갈된 시정부터 3 시간 후이며 이 때 부터 포자형성이 관찰되었다.

한편 총 CAT 활성은 이보다 약간 늦은 배양 10-12 시 간 후 최대에 도달된 후 감소하였다. 플라스미드 p-12B1 에 포함되어 있는 promoter 는 공여균주내에서

• Z.J

효 l 훌0.5

G 간

KOiι J Appl. Microbiol. Bi^‘átech .

bJJ_

;그닝

‘

100Ò항 20를

:~2: 1 ;:3 월율.ò 60 값 12 칩

종얘 ro

'"이 l 갱 ZO 육획+.04 융

ü <íl ←녁 3

---.l 걱 _ζ) ^‘

4 8 12 16 20

Culture time (h)

Fig. 1. Typical batch growth of Bacillus sp. YA-14 har- boring p-12 Bl in 2xSSG med.ium containing 0.1% glucose

vegetatrve 생육단계에서는 미약하게 말현되나 글루코오

스가 고잘된 3 시간 후 포자형성 초기에 활발히 발현되는 것으로 보아 포자형성과 관련있는 promoter 라 추측된 다.

Bαèillαs 는 대수증식기 이후 정지기에 도달하면 영양 성분이 고갈되기 때문에 포자를 형성한다. 포자형성 과 정에 이용되는 sigma factor 는 적어도 5 종류가 존재하 는 것으로 알려져 있으며 포자형성시 cascade 식으로 조절하는 것으로 밝혀졌다. 실제 BaèiLLus 는 생육시 기에 따라 RNA polymerase 의 전사 특이성 이 변하여 유전자 발현이 전사단계에서 조절되며， 전사수준에서 조절되는 여 러 가지 sigma factor 들은 고도의 특이 성을 가지고 promoter 를 구별인식하는 것드로 알려져 있다 (11) . 플 라스미드 p-12B1 promoter 는 포자형성 초기에 활발히 발현되고 그 이후 급격히 활성이 감소하는 것으로 미루 어 보아 spo 0 와 spo II 단계에서 특이적으후 인식하는

RNA polymerase 에 의하여 전사가 일어나는 것이 아닌 가 생각된다.

Mongkolsuk 등 (12) 은 정지기에서만 발현이 촉진되는 promoter 를 plasmid pPL 703 을 이용하여 선발하였는 데 2μ g/ml chloramphenicol 이 함유된 SSG 배지에서 대수 증식기보다 정지기에서 8-10 배 정도 유도되는 것을 확인하였고 대수 증식기가 끝난 후 2-3 시간 후부터

promoter 의 활성 이 증가한다고 보고하였다.

재조합 플라스미드의 안정성

숙주세포내에 삽입된 플라스미드의 안정성은 재조합 균주를 이용한 말효의 scale-up 과 상엽 적 대 량생산에 중 요한 요인인 것￡후 지적되고 있다(1 3-15) . 본 연구에 사용한 재조합 plasmid p-12Bl 의 공여균주내에서의 안 정성을 Fig.2 에 나타내었다.

ι‘

139

Table 1. Effect of glucose concentration on the growth and CAT activity in Bacillus sp. YA-14 harboring plasmid p-12Bl

Initial glucose concentration (g/l)

1.0 2.0 Parameters

8.0

95 Vol. 18. No. 2

100

3.1 50 2.0 66 1.8 120 0.5

1.5

0.07 14

9

12 9 8 6

12 10 6 8

Final cell concentration (g/l:)

Ma잉mum CATsa (U/g cell)

Maximum CATω (U/ml) Initial induction rate of CATsa (U/g/l cell.h) Glucose depletion time (h) Prespore detection time (h)

Maximum CATsa

detection time (h) Specific glucose uptake rate (g/g cell.h)

%

‘(웅) 띠{{φP 벼응음성gp

，Egm성{g 정

@@ggg&

0.07 27

7 0.132 48

6 0.106 48

4

20 30

Culture time (h)

Fig. 2. The stability of recombinant plasmid p-12 Bl in Bacillus sp. YA-14

50 40 10

90 O

0.74

CATsα^: CAT specific activity; CATta: CAT total activity;

Fermentation time: 23 h

promoter 활성을 최대화할 수 있는 적정 글루코오스

농도플 규명하기 위하여 배지 중 글루코오스 농도를 005-0.8% 범위에서 변화시키면서 발효한특성값을 Fig.3 과 TabJe 1 에 나타내였다 . CAT 바활성은 01% 글루 코오스가 함유된 배지에서 최대값 120 U/g cell을 나타 내었고 0.8% 의 글푸코오스가 첨가된 배지에서는 0.1%

의 글루코오스의 경우보다 최대 CAT 비활성이 1/2 이 상 감소되었다.

또한 글루코오스 농도가 높을수록 CAT 비활성 이 최 대에 도말하는 시간이 늦어지고 최대 CAT 비활성값도 낮아졌다. 그러나 초기 배지 중 글루코오스 농도에 관계 없이 배지 중의 글푸코오스 농도가 거의 고갚된 시간부 터 CAT 비활성이 증가되기 시작하여 글루코오스가 완 전히 소오된 후 2-3 시간 후에 CAT 비활성이 최대값에 도달하였고 이 시정부터 포자가 검출되기 시작하였다.

최종 균체의 농도는 글루코오스의 농도가 증가할수록 조 금씩 증가하여 005% 글루코오스가 첨가된 경우는 1.5g/ 1 인데 비해， 0.8% 글루코오스의 경우는 3.1g/ 1 로 약 2 배 정도의 차이가 있었다.

이와 같이 고농도의 글루코오스일수록 CAT 비활성이 감소되는 것은 p-12Bl promoter 유전자내에 catabolite repreSSlOn 에 관여 하는 유전자가 존재하여 Bacillμs 속 100

0.64 0.22 0.24

8 12 16 Culture time (h)

Fig. 3. CAT specüic activity as a function of glucose con- centratÍon in Bacillus sp. YA-14 harboring plasmid p-12 Bl

v. :

glucose; 口.: 0.8% glucose; open: CAT specific acti- 띠ty; closed: % of prespore; {) : glucose depletion point

20 4

(1) '-' 편 120

g

흉 ⁸⁰

§

ιJ

펑 ⁴⁰

m 용

E녁 력

ζj 0

접종 후 40시간이 경과한 후까지 삽입된 플라스미드는 95% 아상의 높은 안정성을 유지하였다. Yu 등 (16) 은 agarose gel electrophoresis 를 통하여 이 플라스미드가 Bαcillμ5 sp. YA-14 내에서 DNA 단편의 결손 등이 일어 나지 않고 구조적으로 안정한 것A로 보고하였다. 따라 서 본 재조합 플라스미드는 구조적 안정성과 se- gregational stability 가 매우 우수한 것무로 판단된다.

CAT 활성에 미치는 글루묘오스 농도의 영향 재조합 플라스미드 p-12Bl 을 함유한 Bacillμ5 sp YA-14 는 글루코오스농도가 높아짐에 따라 CAT 의 비 활성이 상대적으로 억제된다는 사실을 Yu 등 (16) 이 보 고한 바 있다. 이와 같은 사실로부터 CAT 비활성에 미 치는 글루코오스 농도의 영 iícl노을 좀더 상세히 살펴보고

을 나타내었다. 그러나 초기 chloramphenicol 의 농도가 10μ g/ml 인 경우에는 최대 CAT 비활성값은 15μg/

ml 의 값보다 약간 적었으나 서서히 감소하는 매우 안 정된 경향을 나타내었다. 이는 chloramphenicol 이 ln.

ducer 로서만이 아니라 단백질 합성의 강력한 저해제로 서의 역할도 하는 competing . property (18) 를 갖고 있 기 때문에 15μg/ml 이상의 농도에서는 CAT 비활성 값이 급격히 감소하는 것으로 생각된다. 따라서 초기 chloramphenicol 의 농도는 10 μ g/ml 로 배 익양하는 것 이 가장 좋은 것으로 판단되었다.

한편， chloramphenicol 의 첨가시깐이 p-12Bl pro moter 에 마치는 영향을 살펴보기 위하여 초기에 chlor.

amphenicol 을 넣어주지 않은 상태에서， 각각 5,8,11 . 시간째 10μ g/ml 의 chlorampheicol 을 첨가하면서 그 에 따른 CAT 의 활성을 Fig.5 에 나타내었다.

배양이 끝날 때까지 chloramphenicol 을 첨가해주지 않은 경우에는 CAT 비활성이 lOU/g cell 을 념지 못하 였다. 이것은 promoter 삽입부위와 cat 유전자 샤이에 존재하는 150bp 의 염기서열 (12) 에 기인하는 것￡로 그 배열내에는 inverted repeat sequence 가 존재하고 그 위쪽에 cis-acting regulatory region (13) 빛 ribosome binding site 가 존재한다. 이 러한 염기배열로 전사시 inverted repeat sequence 가 안정된 stem-loop 구조를 형성， 전사과정의 termination signal 로 약하게 작용하 여 (14, 15) cal-86 mRNA 의 벤역을 억제하기 때문에 CAT 의 발현이 적어지게 되는 것이다. 그러나 포자가 형성되기 시작하는 시점 빚 그 전후 시기인 5， 8， 11 시간 째에 chloramphenicol 을 첨가해줌에 따라 CAT 활성이 /않하기 시착하였는데 이는 chloramphenicol 에 의하여 Fig.5. Induction of CAT in Bac따us sp. YA-14 harbor- ing p-12 Bl byaddition of chloramphenicol at different time

‘ :

trol (without chloramphenicol) ~ : addition time of chloram.

phenicol; 6 , 0 , 口 CAT Total activity induced with chloramphenicol at 5, 8 and 11 h, respectively.

Kor. J Appl. Microbiol. Biofech‘

ζ; g p

ô>>

...,

.;;

'.12 혈 .08 정

g

F•

〈킥 u

4

nM

5

1i

nU

·‘

잉。김여LS섭@。딩。”〕 φm()잉잉【{) --。~g효샤W{φ〉P {{잉 캄디

CAT 비활성에 미치는 chloramphenicol 농도의 영향 글루코오스 농도를 0.1% 로 하고， 초기 chloram.

phenicol 의 농도를 각각 5， 10， 15， 20μ g/ml 로 하였을 때 CAT 비활성값을 비교해 본 결과를 Fig.4 에 나타내 었다. 5μ g/ml 의 경우에는 CAT 비활성값이 완만하게 증가하는 경 E뽑 나타내었고， 20M/ml 의 경우에는 CAT 비 활성값이 60 U/g cell 이하의 상당히 낮은 값을 나타내었다.

또한 15μ g/ml 의 경우에는 10 시간째에 100U/g cell 의 높은 값을 나타내었A나 곧 감소하는 불안정한 경향 YA-14 가 glucose effect 를 받기 때문에 배지 중의 글 루코오스 농도가 catabolite repression 을 받지않을 청도 까지 감소된 후 비로소 CAT 활성이 증가되는 것드로 생 각된다.

B. 5μbtilis 에서는 a-amylase, protease 등이 ca tabolite repression 에 의해서 조절된다고 보고된 바가 있으며， Schaeffer 응은 포자형성의 개시나 세포외 분비 효소의 급증 등의 포자형성에 관련된 많은 현상 등이 catabolite type repression 에 의해서 조절된다고 보고하 였다(17-18).

이-^J-에서 살펴 본 바와 같이 포자의 형성은 promoter 의 활성과 매우 밀접한 관계가 있으며 포자형성이 촉진됨에 따라 CAT 의 활성이 급격히 감소하는 사실로 볼 때 promoter 의 활성을 최적화하기 위해서는 미량의 글루코 오스 존재하에서 세포의 생리적 활성을 포자형성의 초기 상태로 유지하는 것이 매우 중요하다고 생각된다.

Fig. 4. Effect of initial chloramphenicol concentration on CAT specific activity in Bacillus sp. YA-14 harboring plasmid p-12 B1 chloramphenicol concentration

6: 5μ g/ml; _: 10μg/ml; 0: 15μ g/ml; 口: 20μg/ml.

16 8 12

Culture 0

4 80 120

40 140

({{@P

맨P) 캅김딩잉여 잉띄ggm LF객Q

Vol. 18. No. 2

stem-loop 구조가 풀리게 됨에 따라 천사가 진챙되기

시작되는 것으후 해석할 수 있다. 즉， 원하는 지점에 서 product 를 얻을 수 있는 분자 스위치의 역할을 chloramphenicol

01

Chloramphenicol 의 첨가시기에 따른 CAT 활성을

비교하여 보면 초기부터 첨가한 경우가 가장 높았고， 다 음 글루코오스가 고갈된 5 시간 후， 포자가 생성되기 시 작하는 8 시간 후， 포자가 상당히 형성된 후인 11 시간의 순표로 CAT 활성 이 저조하였다. 즉， chloramphenicol 의 첨가시기는 CAT 활성에 큰 영향을 미치며 초기부터 subinhibitory level 로 첨 가하는 것이 가장 양호하였다.

요 약

알칼리 내 성 Bacillμs sp 의 chromosomal DNA 로부 터 분리 하여 공여균주에 삽입된 promoter 의 발현 특성 에 미치는 글루코오스와 chloramphenicol 농도의 영향 을 CAT 활성을 측정하여 연구하였다.

Promoter 는 초기 글루코오스 농도에 상관없이 대수 증식기가 끝난 이후， 글루코오스가 저농도호 감소되어 catabolic repression 이 해제된 시정부터 활성이 급격히 증가하여 포자형성 초기단계에 최대 활성을 나타내고 포 자가 형성됨에 따라 감소하였다. 재조합된 plasr.:ád 는 접종 후 40 시간이 경과한 후까지도 95% 이상의 높은 안정성을 유지하였다.

초기 글루코오스의 농도 벚 chloramphenicol 의 첨 가 량과 첨가시기는 CAT 활성에 큰 영향을 미쳐 초기 글루 코오스의 농도는 19/1, chloramphenicol 은 초기부터 농 도 10μ g/ml 로 첨가하여 배양했을 때 가장 높은 활성을 얻었다.

141

감사의 말

본 연구는 '87 목적기초연구비에 의하여 이루어졌으며，

지원하여 주신 한국과학재단에 감사드린다.

참고문헌

1. Palva, 1., Lehtovaara, P., L. Kaariainen, M. Sibakov, K. Cantell, C.H. Schein, etc: Gene, 22, 229 (1983).

2. Priest, F.G.: Bacteriol. Rev., 41, 711 (1977).

3. Schaeffer, P.: Bacteriol. Rev., 33,48 (1969).

4. Gryczan, T.J. and O. Dubnau: Proc. Natl. Acad. &i. USA, 75

,

5. Ehrlich, S.O.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1433 (1978).

6. Ehrlich, S.O.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1680 (1977) 7. Yu, J.H., Y.J. Chung, K.S. Chung and O.H. Oh: Kor.

1. Appl. Microbiol. Bioeng.

,

,

8. Yu, J.H., B.T. Koo, Y.S. Park, Y.J. Chung, O.H. Bai and O.H. Oh: Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng., 16,343 (1988).

9. Go1dfard, O.S., S.L. Wang, T. Kudo and R.H. Ooi:

Mol. Gen. Genet., 19, 319 (1983).

10. Show, W.V.: Methods En깅Imol.， 43, 737 (1975)‘

11. Monko1suk, S. and P. S. Lovett: Proc. Natl. Acad. Sci.

USA

,

,

12. Mongkollsuk, S., Y. Clúang, R.B. Reynolds and P.S Lovett:

J. Bacteriol., 155, 1399 (1983).

13. Takara, 1.: J. Bacteriol., 139, 774 (1979).

14. Fujii, M. and K. Sakaguclú: Gene, 12, 95 (1980).

15. U삐en ， M., J.I. Flock and L. Plú1ipson: Plasmid, 5, 161 (1981).

16. Yu, J.H., B.T. Koo and Y.J. Chung: Kor. J. Appl.

Microbiol. Bioeng., 17, 188 (1989).

17. Sekiguchi, J. and H. Okada: J. Ferment. Technol., 50,801 (1972).

18. Priest, F.G.: Bacteriol. Rev., 41, 711 (1977).

(Received March 21

,