249 책임저자：이상현
456-756, 경기도 안성시 대덕면 내리 중앙대학교 식물시스템과학과
Tel: 031-670-4688, Fax: 031-676-4686 E-mail: slee@cau.ac.kr
조은주
609-735, 부산시 금정구 장전동 산 30번지 부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구소 Tel: 051-513-1876, Fax: 051-583-3648
E-mail: ejcho@pusan.ac.kr
접수일：2011년 7월 4일, 1차 수정일：2011년 7월 6일, 2차 수정일：2011년 7월 12일, 게재승인일：2011년 7월 14일
Correspondence to：Sanghyun Lee
Department of Integrative Plant Science, Chung-Ang University, Nae-ri, Daedeok-myeon, Anseong 456-756, Korea
Tel: ＋82-31-670-4688, Fax: ＋82-31-676-4686 E-mail: slee@cau.ac.kr
Co-Corresponding Author：Eun Ju Cho
Department of Food Science and Nutrition & Research Institute of Ecology for the Elderly, Pusan National University, San 30, Jangjeon- dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: ＋82-51-513-1876, Fax: ＋82-51-583-3648 E-mail: ejcho@pusan.ac.kr
보통메밀과 쓴메밀의 산화적 스트레스 개선 및 위암 억제 효과
1부산대학교 식품영양학과 및 노인생활환경연구소,
2중앙대학교 식물시스템과학과, 3국립식량과학원 고령지농업연구센터
이해송1ㆍ이정민2ㆍ윤영호3ㆍ조은주1ㆍ이상현2
The Protective Effects of Common and Tartary Buckwheats against Oxidative Stress and Gastric Cancer
Hae Song Lee1, Jeong Min Lee2, Young-Ho Yoon3, Eun Ju Cho1 and Sanghyun Lee2
1Department of Food Science and Nutrition & Research Institute of Ecology for the Elderly, Pusan National University, Busan 609-735, 2Department of Integrative Plant Science, Chung-Ang University, Anseong 456-756,
3Highland Agriculture Research Center, National Institute of Crop Science, Pyeongchang 232-955, Korea
The protective effects of tartary buckwheat and common Korean buckwheat cultivars, yangjul-maemil and daesan-maemil, against oxidative stress and gastric cancer were evaluated. The treatment of the methanol extract from tartary buckwheat, yangjul-maemil and daesan-maemil showed over 80% sca- venging effect against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl at 250 μg/ml. In addition, all buckwheats showed over 80% ㆍOH scavenging activity even at low concentration of 50 μg/ml. In order to investigate the anti-inflammatory activity of tartary buckwheat, yangjul-maemil and daesan-maemil, we employed nitric oxide (NO) induced cellular inflammatory system using RAW 264.7 macrophage cells. The results showed that tartary buckwheat, yangjul-maemil and daesan-maemil inhibited NO production generated by both exotoxin of sodium nitroprusside and endotoxin of lipopolysaccharide & interferon-gamma. Morever, tartary buckwheat and daesan-maemil showed the strong antimicrobial activity (clear zone ＞14 mm) against Helicobacter pylori. Yangjul-maemil and daesan-maemil also inhibited the growth of AGS human gastric adenocarcinoma cells by up to 70% at concentration of 1,000 μg/ml. The present results indicate that buckwheats showed protective effects against oxidative stress and gastric cancer. (Cancer Prev Res 16, 249-254, 2011)
Key Words: Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum), Yangjul-maemil, Daesan-maemil, Oxidative stress, Helicobacter pylori, AGS human gastric adenocarcinoma cell
서 론
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 체내 대사과 정에서 필연적으로 생성되고 세포 구성 성분의 산화적 손상을 축적시키는 원인으로, 염증반응, 고혈압 및 고지 질혈증에서 세포 신호전달 과정을 매개하고 직접적으로 조직 손상을 유발하며 혈관 기능을 저하시킨다.1∼4) 생체 내 산화적 스트레스는 ROS의 과도한 생리적 이용 가능 성으로 정의되며, 이는 인체의 ROS 및 활성질소종(reac- tive nitrogen species, RNS)의 생성계와 제거계의 불균형의 결과로 기능적 변화와 병리적 상태를 초래한다.5,6) RNS 에는 nitric oxide (NO), nitrogen dioxide (NOOㆍ), peroxyni- trite (ONOO－) 등이 있으며, 특히 NO는 superoxide anion (O2−
)와의 반응으로 ONOO−를 생성하며, 이는 훨씬 강 력한 반응성으로 광범위한 생체 분자의 산화적 손상 및 mitochondria 손상을 야기시킨다.7∼9) 이로 인한 산화적 스 트레스는 염증을 통해 세포의 사멸을 유도하고 다양한 종류의 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.10,11) 위암은 특히 중국과 한국을 비롯한 동아시아 국가의 가장 높은 발병암으로 이로 인한 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 현재 위암 치료방법은 큰 효과를 가지지 못하여 수술 후에도 재발할 가능성이 높으며, 생존율이 낮아 좋은 예후를 기대하기 어렵다.12,13) Helicobacter pylori (H. pylori)에 대한 항균활성과 위암 억제효과를 가진 부작 용이 적은 식품 및 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되 고 있고, 또한 각종 질병 및 노화 등에 활성산소 및 과산 화물이 직접적인 원인으로 작용한다는 사실이 밝혀지면 서 보다 안전하고 강한 활성을 지닌 천연 항산화제의 개 발에 대한 관심도 증가하고 있다.
메밀은 고혈압 및 동맥경화, 당뇨병 등 다양한 질병에 대한 예방과 치료효과를 가진 것으로 알려져 있으며,14∼18) 보통메밀(Fagopyrum esculentum)과 쓴메밀(Fagopyrum tataricum) 두 종이 주류를 이루고 있다. 그러나 보통메밀과 쓴메밀 의 활성을 비교한 연구는 행해져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 쓴메밀과 보통메밀인 양절메밀과 대산메밀 을 비교하여 산화적 스트레스 개선 및 위암 억제효과에 대하여 알아보고자 하였다.
재료 및 방법 1. 실험재료
실험재료로 사용한 쓴메밀, 양절메밀과 대산메밀은 국립식량과학원 고령지농업연구센터로부터 제공받아
사용하였다.
2. MeOH 추출물의 조제
실험재료인 쓴메밀, 양절메밀과 대산메밀을 MeOH로 추출하여 MeOH 추출물을 조제하였다. MeOH 추출물은 각 시료 100 g을 원형 플라스크에 넣고 MeOH 1 l를 채워 서 환류냉각장치가 부착된 추출장치를 이용하여 3회에 걸쳐 추출하였다. 추출 후 쓴메밀 추출물(4.96 g), 양절메 밀 추출물(2.46 g), 대산메밀 추출물(2.72 g)을 각각 얻었 다.
3. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정
Methanol에 녹인 각 농도별 시료(50, 100, 250, 500 μg/
ml) 100 μl와 60 μM DPPH용액 100 μl를 96-well plate에 혼합하여 30분간 실온에 방치시킨 후, 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교 하여 free radical 소거효과를 백분율(%)로 나타내었다.19)
4. Hydroxyl radical (ㆍOH) 소거 측정
Fenton 반응에 따라 10 mM FeSO4.H2O-EDTA에 10 mM 의 2-dexyribose solution과 100 μg/ml 농도의 따른 sample solution을 혼합한 다음, 10 mM의 H2O2를 첨가하여 37oC 에서 4시간 동안 배양하였다. 이 혼합액에 2.8% trichloro- acetic acid와 1.0% thiobarbituric acid solution을 각각 첨가하 여 20분간 boiling한 후 cooling하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.20)
5. 세포 배양
AGS 인체 위암 세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell)와 RAW 264.7 세포(Mouse leukaemic monocyte macro- phage cell)는 한국 세포주 은행(서울의대)에서 분양받아 사용하였다. AGS 인체 위암 세포는 100 units/ml의 pen- icillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 이용하였고, RAW 264.7 세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10% FBS를 첨가한 Dulbecc's modified eagle medium (DMEM) 배지를 이용하여 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 세포를 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후 AGS와 RAW 264.7은 각각 0.05% trypsin-0.02% EDTA와 scraper를 이용 하여 부착된 세포를 분리 후, 원심분리하여 집적된 세포 를 배지에 넣고 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
Table 1. DPPH scavenging activity of the MeOH extracts from Fagopyrum spp.
Concentration (μg/ml)
Scavenging activity (%) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil 50
100 250 500
70.24±0.27b 71.13±0.42b 80.16±0.27a 72.65±2.19b
72.92±0.66c 74.80±0.96c 80.43±0.54b 83.38±0.54a
74.53±2.36b 75.85±0.32b 80.16±0.50a 83.38±0.54a Values are mean±SD.
a∼cMeans with the different letters are significantly different (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
6. RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성 억제 측정
Nitric oxide 측정은 RAW 264.7 세포를 24 well plate에 1×105 cells/well로 seeding하여 2시간 배양한 후 농도별로 시료를 처리한 후 24시간 후에 1 μg/ml의 lipopolysaccha- ride (LPS)와 10 ng/ml의 IFN-γ를 처리하여 24시간 동안 37oC에서 산화시켰다. Exotoxin에 의한 NO는 500 μM의 sodium nitroprusside (SNP)를 처리하여 24시간 동안 37oC 에서 산화시켰다. 이후 상층액 100 μl와 griess reagent 100 μl를 실온에서 15분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡 광도를 측정하였다.21)
7. H. pylori 배양
실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 H.
pylori strain 26695로서 헬리코박터 파이로리분리 균주은 행에서 분양받아 사용하였다. 균의 배양에는 10% horse serum (Welgene, Korea)을 첨가한 brucella broth (Difco, USA)를 이용하였으며, 배지의 조성은 bacto tryptone 10 g, bacto peptamin 10 g, bacto dextrose 1 g, bacto yeast extract 2 g, sodium chloride 5 g, sodium bisulfite 0.1 g으로 구성되 어 있다. 미호기성 조건을 유지시켜 주기 위해서 CO2 in- cubator는 10% CO2, 습도 95% 이상, 온도는 37oC를 유지 하였다.
8. 항균 활성 분석
디스크 확산법으로 항균활성을 측정하였다.22) Brucella agar 배지에 H. pylori 균액 100 μg을 분주하여 멸균 유리 봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper (φ8 mm, Advantec, Japan)를 올리고 2.5 μg/30 μl, 5 μg/30 μl, 10 μg/30 μl 농도의 추출물 30 μl를 disc paper에 흡수시켰다. 37oC 의 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 다음, 디스크 주위의 억제환(Clear zone) 생성 유무를 확인하였다.
9. AGS 인체 위암세포 생존저해효과 측정
세포 생존저해율은 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphe- nyl-2H tetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 측정하 였다.23) 96 well plate에 1×104 cells/well로 seeding 하여 24시 간 배양하여 세포를 부착시킨 후 100 μg/ml의 농도별로 시료를 처리하여 48시간 배양하였다. 5 mg/ml의 MTT solution을 각 well에 주입하여 37oC에서 재배양한 후 생성 된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Inhibition rate (%)=(1−시료처리구의 흡광도/
대조구의 흡광도)×100
10. 통계분석
각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 평균±표준편차 로 나타내었고, 각 실험 결과로부터 ANOVA (analysis of variance)를 구한 후 Duncan's multiple test를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서는 보통메밀 2종과 쓴메밀의 MeOH 추출 물을 이용하여 산화적 스트레스 개선 및 위암 세포 성장 억제효과를 검토하였다.
Table 1은 3종 메밀의 MeOH 추출물을 이용하여 DPPH radical 소거능을 측정한 결과이다. DPPH radical 소거능 측정법은 항산화물의 첨가가 그 복합물의 농도와 항산 화능에 따라서 흡광도가 비례적으로 감소하는 결과를 나타내며, 수행하기 쉽고 반복할 수 있기 때문에 합성물 과 자연적인 물질, 그리고 그들의 혼합물의 항산화능을 측정하는데 유용한 도구로써 사용되어 왔다.24,25) 메밀의 항산화 활성을 알아보기 위해 3종 메밀에 대하 여 각 농도별(50, 100, 250, 500 μg/ml) DPPH radical 소거 효과를 살펴본 결과, 3종의 시료에서 50 μg/ml 농도에서 도 70% 이상의 높은 소거능이 나타났고 250 μg/ml에서 는 80% 이상의 높은 DPPH radical 소거 효과를 보여 메밀 의 DPPH radical 소거 효과가 아주 우수함을 알 수 있었 다. 양절메밀과 대산메밀 MeOH 추출물은 처리농도에 따라 농도 의존적으로 DPPH의 소거능이 증가됨을 알 수 있었으며, 메밀 종류 간에는 큰 차이는 보이지 않았 다.
Table 2는 메밀의 MeOH 추출물의 ㆍOH radical 소거능 을 나타낸 결과이다. ㆍOH은 ROS 중에서 가장 반응성이
Table 3. NO formation of RAW 264.7 cells treated with LPS plus IFN-γ
Concentration (μg/ml)
NO formation (μM) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil Normal
Control 100 250 500 1,000
5.30±0.02e 72.66±0.04a 72.02±0.02a 69.00±0.01b 50.32±0.25c 18.04±0.12d
5.30±0.02d 72.66±0.04a 69.84±0.01a 48.62±0.57b 38.48±0.05c 3.30±0.00d
5.30±2.60f 72.66±0.04a 52.88±0.15d 64.22±0.12b 56.02±0.01c 18.56±0.02e Values are mean±SD.
a∼fMeans with the different letters are significantly different (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Table 4. NO formation of RAW 264.7 cells treated with SNP
Concentration (μg/ml)
NO formation (μM) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil Normal
Control 100 250 500 1,000
22.26±0.36b 48.46±0.01a 52.52±0.30a 52.98±0.01a 53.50±0.02a 48.22±0.02a
22.26±0.36b 48.46±0.01a 49.38±0.05a 52.16±0.01a 28.36±0.05b 38.22±0.01ab
22.26±0.36b 48.46±0.01a 49.76±0.00a 48.06±0.01a 51.68±0.05a 42.06±0.06a Values are mean±SD.
a,bMeans with the different letters are significantly different (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Table 5. Antimicrobial activity of various kinds of Fagopyrum spp. against H. pylori
Concentration (μg/30μl)
Clear zone (mm) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil 2.5
5 10
12 14 12
11 13 13
11 11 17 Table 2. Hydroxyl radical scavenging activity of the MeOH
extracts from Fagopyrum spp.
Concentration (μg/ml)
Scavenging activity (%) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil 50
100 250 500
84.17±0.24a 84.76±0.16a 81.87±0.09ab 80.63±1.82b
85.51±0.12b 86.91±0.24a 87.57±0.31a 85.89±0.34b
85.46±0.44b 94.92±0.88a 88.00±3.45ab 87.90±2.71ab Values are mean±SD.
a,bMeans with the different letters are significantly different (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
크고 인접한 생체 분자에 심각한 손상을 야기하는 독성 이 강한 radical로 알려져 있다. ㆍOH radical은 지질 산화 와 많은 생리적 손상을 일으키는 주요한 ROS이다.26) 3종 메밀의 ㆍOH 소거능은 낮은 농도에서도 높은 편이었으 며, 50 μg/ml의 농도에서 모두 80% 이상의 소거능을 보 였으나, 농도 의존적인 ㆍOH 소거능은 나타나지 않았 다.
NO는 과잉으로 생성될 경우 단순 세포확산을 통해 iron-sulfur center나 thiol group을 포함한 mitochodria enzyme 을 불활성화시키거나, 분자적 산소와 함께 nitrosating agent를 형성하는 자동산화 과정을 거쳐 DNA deami- nation을 통한 돌연변이를 일으키고 O2−
와 반응하여 더 강력한 산화제인 ONOO−를 생성시킨다.27) 따라서 과잉 으로 생성된 NO을 제거함으로써 NO에 의한 독성으로 부터의 보호 효과를 기대할 수 있다. RAW 264.7 대식세 포에서의 endotoxin에 의한 NO 생성 억제 측정에서는 IFN-γ는 NO의 생성을 유도하는 cytokin으로 LPS와 동시
에 처리시, LPS 단독처리에 비해 NO의 생성이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 RNS의 일종인 NO에 대한 메밀의 생성 억제 효과를 보 기위해 RAW 264.7 대식세포에 LPS와 IFN-γ를 처리하여 endotoxin에 의한 NO를 생성시켜 시료의 효과를 검토하 였다. Normal군에서는 NO 생성 정도가 5.30 μM이었으 나 LPS와 IFN-γ를 처리한 control군에서는 NO의 70 μM 이상으로 생성되는 것을 통해 endotoxin에 의한 NO 생성 을 확인할 수 있었다. 반면, 메밀 시료를 농도별로 처리 했을 때, 시료 농도 증가에 따라 NO 생성량이 농도 유의 적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 500 μg/ ml 의 처리농도에서 쓴메밀, 양절메밀, 대산메밀 추출물은 각각 50.32 μM, 38.48 μM, 56.02 μM의 NO 생성을 나 타내어 control에 비해 NO의 생성이 감소됨을 알 수 있었 다. 따라서 메밀에서 endotoxin에 의한 NO 생성 억제를 통해 메밀이 항염증 효과가 있는 것으로 사료된다(Table 3).
SNP는 NO 생성 화합물로 알려져 있으며 본 연구에서 exotoxin 물질인 SNP를 RAW 264.7 대식세포에 처리하여 NO를 유발시킨 후 메밀의 산화적 스트레스 개선을 통한 항염증 효과를 살펴보았다(Table 4). SNP를 처리한 con-
Table 6. Inhibitory effect of various kinds of Fagopyrum spp.
on the growth of AGS cells
Concentration (μg/ml)
Inhibition rate (%) Tartary
buckwheat
Yangjul- Maemil
Daesan- Maemil 100
250 500 1,000
19.73±2.69b 7.35±4.07a 7.99±6.23a 14.49±9.67ab
4.08±6.00a 11.64±4.37b 27.85±6.95c 78.65±2.82d
13.64±5.95a 11.66±5.17a 23.15±4.59b 80.43±4.80c Values are mean±SD.
a∼dMeans with the different letters are significantly different (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
trol의 경우 normal에 비해 2배 이상의 NO 생성이 나타났 으나, 메밀추출물을 처리한 경우 NO의 생성량은 크게 차이는 보이지 않았다. 반면 양절메밀의 경우 500 μg/ml 과 1,000 μg/ml의 처리농도에서 NO의 생성이 control에 비해 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
Table 5는 메밀 추출물을 24시간 처리하여 H. pylori에 대한 항균활성 억제존을 측정하여 분석하였다. 쓴메밀 에서는 5 μg/30μl에서 14 mm 억제존을 나타내어 H. py- lori에 대한 강한 항균활성을 나타내었다. 또한, 대산메밀 의 경우 10 μg/30μl 농도에서 17 mm 억제존을 보여 H.
pylori에 대한 아주 강한 항균효과를 나타냄을 알 수 있었 다.
메밀 추출물의 AGS 인체 위암세포 생존저해효과는 MTT assay를 이용하여 살펴보았다(Table 6). 쓴메밀에서 는 100 μg/ml 농도에서도 19.73%의 위암세포 생존저해 효과를 나타내었으나, 처리농도의 증가에 따른 위암세 포의 생존 저해효과의 상승은 보이지 않았다. 반면, 양절 메밀과 대산메밀에서는 250 μg/ml 농도에서는 15% 미 만의 낮은 위암세포 생존 저해효과를 보였으나, 1,000 μg/ml 농도에서는 70% 이상의 세포생존 저해율을 보여 AGS 위암세포의 생육을 크게 저해시키는 것을 알 수 있 었다.
메밀의 활성성분으로는 rutin, hyperin, quercitrin, querce- tin 등의 flavonol과 vitexin, isovitexin, orientin, isoorientin 등 의 flavone 및 그 밖의 많은 플라보노이드가 유효한 효과 를 나타내는 성분으로 보고되고 있다.28∼32) 특히 메밀의 주된 활성성분인 rutin은 항산화 효과, 항암효과 및 항당 뇨효과 등이 뛰어나 고혈압, 동맥경화 및 심혈관계 질환 과 당뇨병 등의 예방과 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. 쓴메밀에는 보통메밀에 비해 rutin의 함량이 월등 히 높으나,33) 본 연구에서의 연구 결과에서는 항산화 및
위암예방효과에 보통메밀과의 차이를 보이지 않았다.
이는 메밀의 활성에는 rutin외에 다른 활성성분들 또한 중요한 역할을 하는 것으로 사료되며, 본 연구에서는 MeOH 추출물만을 이용하여 활성을 비교 검토한 결과이 므로, 이들 메밀의 분획물과 분획물로부터의 활성성분 을 이용한 연구결과가 뒷받침되어야 할 것이다.
결 론
보통메밀과 쓴메밀의 MeOH 추출물을 이용하여 산화 적 스트레스 개선 효과를 in vitro에서의 radical 소거능 및 RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성 억제 효과를 통해 살펴보았고, 위암 억제 효과를 H. pylori 항균활성 및 위암 세포 생존 저해 효과를 통해 검토하였다. 모든 메밀에서 DPPH, ㆍOH 소거능이 우수한 것을 알 수 있었으며 메 밀종류 간에는 큰 차이는 보이지 않았다. 또한 H. pylori에 대한 항균활성은 쓴메밀과 대산메밀에서 우수하였고, 위암세포 생존저해효과는 쓴메밀에 비해 대산메밀과 양 절메밀이 우수함을 확인할 수 있었다. LPS와 IFN-γ 및 SNP에 의한 NO 생성 저해 효과는 양절메밀이 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 연구결과로부터 메밀의 추출물은 우수한 산화적 스트레스 개선효과 및 위암 억제 효과를 보임을 알 수 있었으며, 메밀 종류 간 에 큰 차이는 보이지 않았다.
감사의 글
본 논문은 농촌진흥청 공동연구사업(과제번호 PJ007799) 연구비 지원에 의해 수행된 결과의 일부이며 이에 감사 드립니다.
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