46(4) : 321∼ 326 (2015)
321
흑삼추출물(BGE)과 금산흑삼표준화소재(GBG05-FF)의 In Vitro와 In Vivo상에서의 항당뇨효과
서윤수1#·손미례2#·공 룡1·강옥화1·주 전1·김도연2·박종대2·권동렬1*
1원광대학교 약학대학 한약학과 한약연구소, 2(재)금산국제인삼약초연구소
The Antidiabetic Effects of Black Ginseng Extract(BGE)and Geumsan Black Ginseng 05-FF(GBG05-FF) on In Vitro and In Vivo Assay
Yun-Soo Seo1#, Mi-Yae Shon2#, Ryong Kong1, Ok-Hwa Kang1, Tian Zhou1, Do-Yeon Kim2, Jong-Dae Park2, and Dong-Yeul Kwon1*
1Department of Oriental Pharmacy, College of Pharmacy and Wonkwang-Oriental Medicines Research Institute, Wonkwang University, Iksan, Jeonbuk, 570-749, Korea
2International Ginseng and Herb Research Institute, Geumsan 312-804, Korea
Abstract − The prevalence of diabetes mellitus continues to rise alarmingly because of industrialization of society. The aim of this study was to investigate the antidiabetic effects of black ginseng extract (BGE) which was performed panax ginseng. First we examined the inhibitory effects of BGE on α-glucosidase. But there was no practical effects in our observations. We ,also, investigate the effects of BGE on glucose uptake of skeletal muscle using 2-NBDG in C2C12 myotube. BGE significantly improved the glucose uptake considered as a lowered blood glucose level. Effects of GBG05-FF on fasting blood glucose and glycated hemoglobin (HbA1c) were investigated in streptozotocin (STZ)-induced diabetic mouse. After injection of STZ, fast- ing blood glucose and glycated hemoglobin rapidly increased. But STZ-induced diabetic mouse treated with GBG05-FF sig- nificantly reduced the level of fasting blood glucose and HbA1c. This results showed that supplementation of BGE improve the diabetic parameters and BGE have a potentiality as a functional food for Diabetes mellitus.
Key words − Black ginseng, C2C12, Type 1 diabetes mellitus, Fasting blood glucose, Glycated hemoglobin
당뇨는 인슐린 분비의 절대적 부족이나 조직 및 장기의 기능장애로 인한 상대적인 인슐린의 부족으로 인해 발생하 는 고혈당증을 특징으로 한다.1) 최근 우리나라는 활동량의 감소, 식생활의 서구화 등의 생활습관의 변화로 비만을 비 롯한 만성대사질환이 중요한 사회적 문제로 대두되고 있으 며,2) 대표적 대사 질환인 당뇨는 기대수명을 십년정도 감소 시킨다.3) 특히 당뇨는 암과 순환기 질환과 더불어 3대 질환 으로 분류되며, 안구, 신장, 신경, 심장, 혈구 등 광범위한 장기와 조직에 걸쳐 기능장애 및 손상을 유발하는 합병증 을 동반한다.4) 세계보건기구에 따르면 전 세계적으로 3억 5 천만 명 이상이 당뇨를 앓고 있으며 2030년이 되면 5억 5 천만 명이 넘을 것으로 예상하였다.5) 당뇨의 유형에는 제1
형 당뇨와 제2형 당뇨가 있으며 제1형 당뇨는 인슐린 의존 성 진성 당뇨병으로서 보통 30세 이전의 비교적 젊은 나이 에 발병하며 급성으로 진행되고 자가면역질환이나 바이러 스 감염에 의한 췌장의 파괴에 의해 나타나며 비만과의 연 관성은 비교적 적다. 주로 아동기 또는 청소년기에 발병하 기 때문에 소아당뇨병이라고도 한다. 제 2형 당뇨는 성인에 게서 주로 관찰되며 만성적으로 진행되고 유전적 요인과 비 만, 노화와 같은 환경적 요인에 의해 진행된다.
α-Glucosidase 억제제는 임상적으로 오랜 기간 사용되어 온 당뇨 치료제이다. 식후의 혈당의 상승은 탄수화물의 소 화 흡수 과정을 통해 일어나게 된다. 혈당조절능력이 저하 된 사람에게 과량의 포도당이 흡수되면 이를 제대로 조절 하지 못해 고혈당상태를 유지하게 된다. 따라서 소장의 α- Glucosidase의 활성을 억제하는 것은 혈당의 상승을 늦춰 혈 당조절은 돕는 하나의 방안이 될 수 있다.6)
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These two authors shared co-first authorship.
*교신저자(E-mail):[email protected]
(Tel): +82-63-850-6802
인삼은 가공방법에 따라 수삼, 백삼, 태극삼, 홍삼 등으로 구분하며, 유사한 가공과정을 거치는 홍삼과 흑삼은 일반적 으로 색상에 따라 구분한다. 흑삼은 인삼을 그 색이 검어질 때까지 증포를 반복한 것으로서 2012년 시행된 인삼산업법 에서는 찌고 말리는 증포의 과정을 3회 이상 반복한 삼으 로 규정하고 있다. 인삼의 가공처리는 최초 유통기한이 짧 은 인삼의 보존성을 개선하기 위해 도입되었으며, 현재는 다양한 분석기술로 증포에 따른 약리성분의 함량의 변화가 보고되어있다. 인삼의 주요 생리활성물질로는 ginsenoside가 알려져 있으며, 일반적으로 dammararne골격에 3, 6 또는 20 번 위치에 당이 2~5개 붙어있는 배당체 구조를 가지고 있 다.7) 인삼의 사포닌은 열처리 과정을 거치면서 배당체의 가 수분해 등의 과정을 거쳐 새로운 생리활성성분이 생성되거 나 특정 사포닌의 함량이 증가하는 등의 변화가 나타남이 보고되었다.8)가공처리에 따른 인삼의 효과에 대한 연구도 활발히 진행되고 있으며, 특히 흑삼에 대해서는 항산화, 항 암, 항비만 효과, 신경손상 보호효과 등이 보고 되어있다.9-12) 본 연구에서는 기능성식품의 소재로 개발하기 위해 streptozotocin으로 유도한 제1형 당뇨 mouse 모델을 사용하 여 흑삼의 혈당 조절기능성을 확인하고 복용기간에 따른 경 과를 확인하고자 한다.
재료 및 방법
흑삼추출물 제조 − 본 실험에 사용된 흑삼은 5년근 수삼 을 충남 금산수삼시장에서 구입하여 무게, 치밀도, 수분함 량, 총당, 조단백질 분석을 거쳐 일정한 영양성분에 충족되 는 샘플을 선별하여 세척 한 후 실험에 사용하였다. 흑삼의 제조는 수삼을 증숙기를 사용하여 95oC에서 6시간 증숙 후 60oC에서 건조하는 과정을 반복하여 최종적으로 수분함량 이 13% 이내, 지표물질(Rg5, Rk1, Rh4) 함량(4~40 mg/g)로 제조 및 건조하여 흑삼을 제조하였다. 각 증포 별 흑삼시료 를 10배량의 70% EtOH에 넣어 80oC에서 8시간씩 2차까지 추출하였다. 위의 추출한 추출액은 5 μm 정성여과(No.1, Advantec, Tampa, FL, USA)를 사용하여 여과하여 감압농 축 후 동결 건조하여 in vitro 실험에 사용하였으며, in vivo 실험은 5증포 흑삼(GBG05-FF)을 이용하여 진행하였다.
시약 및 기기 − 세포배양에서 필요한 Dulbecco’s modified Eagle's medium(DMEM)과 Low-glucose DMEM 배지는 Welgene(Daegu, Korea) 제품을, Fetal bovine serum(FBS)과 Horse serum은 Hyclone(New zealand) 제품을 구입해 사용 하였다. α-glucosidase, 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside (p-Nitrophenyl a-D-glucopyranoside), PIPES buffer(0.1 M, pH 6.8), streptozotocin, Penicillin- Streptomycin은 Sigma(St.
Louis, Mo, USA)에서, 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4- yl)amino]-2-deoxy-glucose(2-NBDG)는 Invitrogen(CA, USA)
에서 구입해 사용하였다.
α-glucosidase 억제 활성 측정 − α-glucosidase 억제 활 성은 이전에 보고된필자 등의 방법을 약간 보완하여 사용 하였다.13) 간단히 기술하자면, 120 μL의 0.1 M phosphate buffer(pH 6.9)와 20 μL의 α-glucosidase(0.5 unit/mL)을 섞은 혼합액에 흑삼 추출물(1 mg/mL)을 10 μL 같이 섞어준다. 혼 합액을 96 well plate에 넣어 37oC에서 15분간 반응시킨다.
반응 이후 5 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 용액을 20 μL 추가한 후 15분 추가로 반응시킨다. 0.2 M sodium carbonate을 80 μL 추가하여 반응을 정지시킨 후 microplate reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한다.
세포 배양과 Myotube 분화 − C2C12 세포는 10% FBS와 antibiotics(100 U/mL)를 포함한 DMEM배지를 사용하여 5%
CO2, 37oC 환경에서 배양되었다. myoblast 상태의 C2C12세 포를 배양하여 confluent 상태가 되면, 배지를 2% horse serum으로 교체하여 myotube로 분화하였다. 분화시작 후 배 지는 매일 교체해 주었으며, 4-5일간 분화한 뒤 실험에 사 용하였다.
C2C12 Myotube에서 당 흡수 측정 − 분화된 C2C12 myotube에서의 당 흡수 능력을 측정하기 위해 2-[N-(7- nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-glucose(2- NBDG, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 필자 등의 방법을 약간 보완하여 사용하였다.14) 간단히 기술하자 면 분화가 완료된 C2C12 myotube를 PBS로 세척한 후 serum-free low-glucose DMEM을 넣어 1시간 배양한 후 2- NBDG(100 μM)과 증포 정도가 다른 흑삼 추출물을 800 μg/
mL과 400 μg/mL의 농도로 투여하여 1시간 배양하였으며 대조군으로 인슐린(100 nM)을 사용하였다. 형광강도는 microplate reader를 사용하여 excitation wavelength 465 nm, emission wavelength 540 nm에서 측정한 후 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
동물의 당뇨유도와 실험설계 − 1주일간 순화된 흰쥐를 7 마리씩 16군으로 분리하여 12군에 대해 당뇨를 유발하였다.
당뇨를 유발하기 위해 실험쥐를 16시간 절식시킨 후 0.1 M citrate buffer(pH 4.5)에 녹인 streptozotocin을 1회 60 mg/kg 의 용량으로 2일에 걸쳐 2회 투여하였으며 동일한 용량의 citrate buffer를 투여한 쥐를 정상군으로 사용하였다. 당뇨가 유발된 12군에 대해서는 각각 4군씩 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처 리군(GBG05-FF300)으로 나누어 실험하였다. 흑삼 추출물 은 사전실험 결과에 따라 5번 증포 한 것을 사용하였으며, 흑삼 처리군에 900 mg/kg/day, 300 mg/kg/day 용량으로 1일 1회 투여한 후 매주 정상군, 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/
day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군 (GBG05-FF300)을 한 군씩을 희생하여 당뇨 쥐에 대한 흑 삼추출물의 효과를 확인하였다.
공복 혈당 측정 − 혈당의 측정은 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈당측 정검사지(Accu-check)를 이용해 측정하였다.
당화혈색소(HbA1c) 측정 − HbA1c의 농도 검사는 12시 간 이상의 공복을 유지한 상태에서 진행하였다. Mouse를 마취한 후 개복하여 복대동맥에서 전혈을 채취하여 실험에 사용하였다. 혈액내 당화혈색소의 양을 측정하기 위해 Mouse HbA1c(Glycosylated Hemoglobin/Hemoglobin A1c) ELISA Kit(MyBioSource, Inc.)를 매뉴얼에 따라 사용하였다. 간단 히 기술하자면, 각 well에 시료를 100 μL 넣고 37oC에서 90 분간 반응 시킨 후, 반응액을 제거하고 Biotinylated Detection Antibody를 100 μL첨가 하여 1시간 반응시킨다. well을 세 척한 후 HRP Conjugated working solution을 넣어 반응 시 킨 후 다시 세척한다. Substrate solution을 첨가하여 반응 시 킨 후 microplate reader를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
통계분석 − 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SD)를 구하여 그 유의성은 SPSS(ver.22)을 사용하여 분산분석(ANOVA)으 로 실험군 간의 차이를 Scheffe’s test에 의하여 유의성 차이 를 p<0.05 수준에서 검증하였다.
결과 및 고찰
흑삼 추출물의 α-glucosidase에 대한 억제 효과 − 동물 실험전의 사전실험으로서 흑삼 70% EtOH 추출물의 증포 횟수별 α-glucosidase 활성 억제 효과를 확인하였다(Table I).
흑삼추출물의 경우 IC50의 값이 1200-1800 μg/mL로 나타났 다. α-glucosidase 억제제로 상용되고 있는 약물인 Acarbose Table I. inhibitory potentials of black ginseng on α- glucosidase according as steam and dry-processing times
Steam and
dry-processing times IC50 value (µg/mL)
1 T 1677±97
2 T 1820±79
3 T 1673±61
4 T 1786±44
5 T 1514±97
6 T 1746±44
7 T 1429±124
8 T 1408±141
9 T 1297±145
Fig. 1. Effects of BGE on 2-NBDG uptake in C2C12 myotubes. For the glucose-uptake assay at different times of steam and dry- processing. C2C12 myotubes were incubated in DMEM containing BGE at different times of steam and dry-processing, or 100 nM insulin with 100 mM 2-NBDG for 1 h. Absorbed 2-NBDG was visualized with a fluorescence microscope after measured with a microplate reader. panel A,B were results of BGE at 800µg/mL panel; c,d were results of BGE at 400 µg/mL panel. *P<0.05 com- pared to the normal group. Significant differences between the treated groups were determined using analysis of variance followed by Scheffe’s test for multiple comparisons. Ins, insulin 100 nM treat group; T, steam and dry-processing times.
와 Voglibose는 IC50의 값이 각각 14.9 μg/mL와 0.07 μg/mL 으로 나타났다. 따라서 본 실험에 사용한 흑삼시료의 경우 α-glucosidase에 대한 유효한 억제활성을 가지지 않은 것으 로 생각된다.
흑삼 추출물의 C2C12 Myotube에서 당 흡수 조절 효과 − 분화된 골격근세포에서의 흑삼의 Glucose Uptake를 측정한 결과, 증수가 증가할수록 세포내로 유입되는 Glucose의 양 이 점차 증가하였으며, 일정 증수에 도달한 이후에는 일정 하게 유지되거나 오히려 감소하는 경향성을 나타내었다(Fig.
1). 800 μg/ml의 농도로 실험한 경우, 3증 이후 유의적 상승 을 확인할 수 있었으며 3증 이상에서의 서로간의 유의성을 확인할 수 없었다. 400 μg/ml의 농도로 실험한 경우, 4증 이 후에서 유의적 상승이 관찰되었으며 이후 증수간의 유의성 은 나타나지 않았지만 5증 이후 평균값이 약간 감소하는 양 상을 보였다.
골격근은 인체의 말초조직의 하나로서 혈당을 흡수하여 소모하는 대표적인 조직이다. 때문에 골격근에서의 당 흡수 개선은 당뇨에 있어 효과적인 혈당개선의 수단으로 여겨진 다.15) 본 연구 결과에서 보는바와 같이 흑삼 추출물은 골격 근 세포인 C2C12 myotube에서 당 흡수량을 증가시키는 것 이 확인되었다. 이로 보아 흑삼은 혈당 개선 효과가 있을 것 으로 예상되어 고농도 군과 저농도 군 모두에서 우수한 활 성을 보인 5증 추출물을 사용하여 이후의 동물실험을 진행
하였다.
STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 흑삼 추출물의 체중조절 효 과 − 실험동물에게 STZ 투여 후 실험기간동안의 체중변화 를 Fig. 2에 나타내었다. 초기체중은 24-25 g으로 군간의 차 이가 거의 없었으나, 최종 체중은 STZ를 투여한 12군에서 정상군과 비교하여 체중 증가량이 낮은 경향을 보였다. STZ 에 의해 췌장의 β-cell이 파괴되면 인슐린 분비 장애로 인해 당 대사의 불균형이 발생하며, 이로 인해 당뇨쥐의 경우 체 중이 감소하는 경향성이 보이는 것으로 보고되어있다.16) 본 실험에서는 아직 성장기가 끝나지 않은 5주령의 ICR마우스 를 사용하여 실험한 결과 실험동물의 체증증가량이 억제되 는 경향성을 보였다. 일부 약물 투여군에서 당뇨군에 비해 체중증가량이 증가하는 양상을 보였으나 전반적인 경향성 으로 보았을 때 흑삼추출물은 체중의 증가에 영향을 미치 지 않는 것으로 생각된다.
STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 흑삼 추출물의 공복혈당 조 절 효과 − 흑삼추출물의 STZ로 유도한 당뇨쥐에 대한 혈당 조절 효과를 확인하기 위해 실험동물의 공복혈당을 측정하 였다. 실험군들의 혈당변화가 Fig. 3에 나타나있다. STZ 투 여 전 실험군들의 공복혈당은 110-120 mg/dL로 차이가 없 었으나 STZ 투여 이후 350-450 mg/dL 농도로 증가하여 당 뇨가 유발되었다. STZ 투여 후 2주차에 잠시 감소양상을 보 였으나 다시 회복되어 점차 증가하는 경향성을 보였다. 약
Fig. 2. Effect of GBG05-FF on body weight of STZ-induced diabetic mice, for 4 weeks. *P<0.05 compared to the STZ group. Significant differences between treated groups were determined using Scheffe’s test. Values are means±standard errors (n=7 per gorup). Normal, normal group; STZ, diabetic group; GBG05-FF300, diabetic group treated with GBG05-FF 300 mg/kg/day; GBG05-FF900, diabetic group treated with GBG05-FF 900 mg/kg/day.
Fig. 3. Effect of GBG05-FF on fasting blood glucose levels in STZ-induced diabetic mice, for 4 weeks. *P<0.05 compared to the STZ group. Significant differences between treated groups were determined using Scheffe’s test. Values are means±stan- dard errors (n=7 per gorup). Normal, normal group; STZ, dia- betic group; GBG05-FF300, diabetic group treated with GBG05-FF 300 mg/kg/day; GBG05-FF900, diabetic group treated with GBG05-FF 900 mg/kg/day
물투여군의 경우 1주 이후부터 점차 감소하는 경향을 보였 으며 3주차부터는 유의적인 차이가 나타났다. 2주차 때의 혈 당의 감소는 당뇨쥐에서도 함께 관찰되는 것으로 보아 약물 에 의한 혈당의 감소는 3주차부터 나타나는 것으로 보여진다.
STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 흑삼추출물 투여 시 당화혈 색소(HbA1c) 함량의 변화 − 본 연구에서는 흑삼추출물의 항당뇨 효과의 지표의 하나로서 당화혈색소에 대한 흑삼의 효과를 확인하였다(Fig. 4). STZ로 유도한 당뇨쥐의 경우 정 상군에 비해 당화혈색소의 농도가 유의적으로 증가하였으 며, 점차 증가하는 양상을 보였다. 흑삼 투여군의 경우 당 뇨군과 유사하게 상승하였으나 3주차부터 점차 감소하였으 며 4주차에는 당뇨군과 비교하여 농도 의존적으로 유의적 감소를 보였다.
당화혈색소는 혈중의 포도당이 혈색소와 결합된 형태로 장기간의 혈당상태를 반영하여 혈당이 높은 정도와 적혈구 가 포도당에 노출된 기간에 비례하여 증가한다. 2009년 미 국당뇨병학회(American Diabetes Association), 유럽당뇨병 학회(European Association for the Study of Diabetes) 및 국제당뇨병기구(International Diabetes Federation)하의 국제 전문가위원회(International Expert Committee)에서는 공복 혈당 검사나 당부하 검사에 비해 당뇨병 진단에 효율적인 수단으로서 당화혈색소 검사를 행할 것을 제시하였다.17)따 라서 흑삼 추출물은 HbA1c의 농도를 줄이는 것으로 보아 당뇨에 유의적인 효과가 있음을 알 수 있다.
결 론
본 연구는 흑삼추출물의 항당뇨 활성을 확인하기 위해 α- glucosidase 억제제로서의 활성과 골격근 세포주를 이용한 당 흡수조절 효과, streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에서의 항당뇨 효과를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. α-glucosidase에 대한 IC50을 측정한 결과 1200 μg/mL 이상의 고농도에서 확인이 가능하였으며, 이로보아 α- glucosidase 억제제로는 적합하지 않은 것으로 생각된다.
2. C2C12 myotube에 흑삼추출물 투여 시 약물 비 처리군 에 비하여 당 흡수량이 유의적으로 상승하였다.
3. Streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에 흑삼추출물을 투여 한 결과 당뇨 평가의 중요한 지표인 공복혈당을 유의적으 로 억제하였으며, 또 다른 지표인 HbA1c의 함량을 유의적 으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과로 보아 흑삼추출물(GBG05-FF)은 당뇨를 완화하기 위한 건강기능식품으로서의 개발가능성이 있음을 알 수 있다.
사 사
본 연구는 금산군 금산인삼명품화사업 연구지원(No. 2015- 403-02)에 의해서 수행되었습니다.
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(2015. 11. 30 접수; 2015. 12. 10 심사; 2015. 12. 11 게재확정)
