Effect of Sorghum nervosum extract on an anti-inflammatory and cytoprotective

http://dx.doi.org/10.12925/jkocs.2017.34.3.515

고량(

Sorghum nervosum

이주현

․김금란

․문지선

건국대학교 생물공학과^a, 두원공과대학교 경기 산업기술 교육센터^b, 중원대학교 뷰티헬스학과^c✝

(2017년 8월 2일 접수: 2017년 8월 22일 수정: 2017년 9월 3일 채택)

.

Effect of Sorghum nervosum extract on an anti-inflammatory and cytoprotective

Ju-Hyun Lee^a․Kum-Lan Kim^b․Ji-sun Moon^c✝

a

Department of Bioengineering, Konkuk University, 1, Hwayang-dong, Kwangjin-gu, Seoul, 143-701, Korea

b

Department of Doowon Technical University, 159, Paju-eup, Paju-si, Jurassic, Gyeonggi Industrial Technical Education Center, Gyeonggi-do Korea

c

Department of Beauty Health, Jungwon University, 85, Munmu-ro, Goesan-eup, Goesan-gun, Chungbuk, 28024, Korea

(Received August 2, 2017; Revised August 22, 2017; Accepted September 3, 2017)

요 약 : 본 연구에서는 고량(

Sorghum nervosum

p

주제어 : 고량, 활성 산소종, 항염증, 세포 보호, 산화 스트레스

Abstract : This study was intended to test anti-inflammation and cytoprotective effect against UVB after

Sorghum nervosum

Sorghum nervosum



✝

Corresponding author

(E-mail: [email protected])

to the results of experiment, the cell viability of 97% or higher was shown at all concentrations of

Sorghum nervosum

p

Sorghum nervosum

Sorghum nervosum

Keywords : Kaoliang, Reactive oxygen species, Anti-inflammation, Cytoprotection, Oxidative stress

1. 서 론

사람을 포함은 호흡을 하는 생명체는 정상적인 에너지 대사 과정과 같은 내부요인에 의해 또는 흡연, 스트레스, 여러 가지 환경오염 및 외부요인 으로 인하여 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다[1]. ROS는 apoptosis 의 과정에서 중요한 요소로 작용한다[2]. 인체에 는 유리기에 의한 손상으로부터 자신을 보호할 수 있는 방어 체계가 있으며, ROS 종류에는 O2-

(superoxide anion) radical, H2O2 (hydrogen peroxide), OH^- (hydroxyl radical) 등의 종류가 있다[3]. 활성 산소종은 정상적인 세포 대사의 과 정 중에 발생하는 부산물이지만 과도하게 생성되 면 산화과정과 같은 다수의 유전자 전사 인자의 발현, 이온의 항상성을 변화시키고, 세포의 확산 과 분화를 유발하는 능력을 가지며, 세포의 생존 에 중요한 DNA등의 세포 구조를 파괴하게 된다 [4]. 대식세포의 Macrophage는 interferon-γ (IFN-γ) 또는 lipopolysaccharide (LPS)와 같은 자극에 의해 염증반응 전사인자인 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB)를 활성화시키며, 그 결과 inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), nitric oxide (NO), prostaglandins (PGs)를 생성시켜 염증을 일으킨 다[5].

본 연구에 사용한 고량(

Sorghum nervosum

Sorghum

이다. 5대곡물의 하나로 비교적 척박한 조건에서 도 경작이 가능한 경제작물로 꼽히고 있으며 고 량색소는 벼 수수(

Sorghum nervosum

Sorghum bicolor

로속(蘆粟)이라고도 한다[6, 7, 8]. 고량의 적갈색 계통의 색소는 tannin계 물질[9, 10]은 condensed tannin의 전형으로 catechin 중합체와 proanthocyanidin 분자들의 혼합체로 보고되고 있고, 이들 commdensed tannin은 고량의 적갈색 형성을 담당하는 역할을 수행한다. 고량의 주성분 으로 flavone의 하나인 apigenine이나 이의 배당 체인 apiin이 지목된 적이 있으나 과학적인 근거 는 미약한 편이며, flavone의 색깔이 미황색인 점 에서 적갈색에 가까운 고량색소 제품의 색깔과는 일치하지 않기 때문에 고량색소 주색소로의 apigenine만이 아니다[11].

Apigenine은 항균, 항암, 항바이러스 및 항염 증 활성을 지니고 있어 세포의 독성은 거의 나타 나지 않으며[12, 13], 감마선에 손상된 인간 림프 구의 회복을 규명함으로써 항균, 항염증, 항암 작 용을 증명하였고, 높은 항산화 효능으로 인하여 DNA변이를 보호할 수 있다는 보고가 있다[14].

UV에 의하여 노화된 피부세포에 apigenine과 luteolin을 적용하여 UVA조사로 인해 증가된 MMPs 효소 활성 및 유전자 발현에 대한 영향을 조사한 결과 UVA 조사로 인해 증가된 collagenases(MMP1, MMP13)효소활성 및 발현 이 apigenine과 luteolin에 의해 감소되는 것이 보 고되었다[15]. 섬유아세포뿐만 아니라 각질형성세

포의 기능을 향상 시키고 파괴를 억제하고[16], 질병과 노화의 원인이 되는 생체 내 산화작용을 억제한다는 사실이 알려지면서[17] apigenine과 같은 플라보노이드계 물질에 대한 연구가 활발하 게 진행되어 이를 이용한 항산화제의 개발과 활 용이 관심이 커지고 있다.

본 연구에서는 70% 에탄올 고량(

Sorghum nervosum

2. 실 험

2.1. 실험 재료 2.1.1. 시약 및 기기

COX-2 primary antibody (Santa Cruz, USA),anti-mouse Ig G-Ab, anti-collagen type

Ⅰ-Ab mouse Ig G, primary antibody (

β

2.1.2. 재료 및 추출

본 실험에 사용된 고량은 충청북도에서 입고된 것을 경동시장에서 구입하여 실험재료로 사용하 였다(Fig. 1.). 시료의 추출은 고량 100 g에 증류 수 300 mL, 70 % 에탄올 700 mL을 첨가하여 최종 volume이 10배가 되게 하여 실온에서 72시 간 방치하여 추출하였다. 추출액만 분리하기 위하 여 20분간 8000 rpm에서 원심분리를 시행 한 후 여과지(whatman No.2)를 이용하여 상층액을 여과하였고, 감압농축기(EYELA, Japan)로 추출 용매인 에탄올을 제거하였다. 감압 농축 후 48시 간 동안 동결건조를 실시하여 분말형태의 고량 추출물을 얻었으며 본 실험의 시료로 사용하였다.

Fig. 1. Procedure of

Sorghum

2.1.3. 세포주 및 세포 배양

본 실험에 사용한 세포주인 RAW264.7 macrophage, HaCaT keratinocyte 세포는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 배양 시 High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Hyclone, USA)에 사용하였고, 배지에 10% fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich, USA)과 1% penicillin (100 IU/mL, GE Healthcare Life Sciences, USA), 1% penicillin/streptomycin (100 IU/ 50 mg/mL)이 첨가하여 37°C로 유지되는 5% CO2 습윤 배양기에서 배양하였다.

2.2. 실험 방법 2.2.1. 세포 생존율 측정

고량 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 neutral red (NR) assay를 이용 하여 분석 및 측정하였다[18]. RAW264.7 macrophage 세포와 HaCaT keratinocyte 세포를 96 well plate에 well 당 3 × 10⁴ cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 incubator에서 배 양하였다. 24시간 후 시약을 농도별로 희석 처리 한 후 37℃, 5% CO2가 공급되는 incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 NR solution (Sigma-Aldrich, USA)이 1% 포함된 무 혈청배지로 교환하여 3 시간 동안 배양한 다음 세포 고정액으로 10 % formaldehyde 용액이 첨 가된 phosphate buffered saline (PBS)을 각 well 에 100 ㎍/mL로 20분 처리하여 고정하였다. NR

desorb solution (1% glacial acetic acid, 49 % ethanol, 50 % distilled water)을 각 well에 100

㎍/mL을 가하여 세포 내의 NR을 추출하고 microplate reader (Synergy HT; BioTek Instruments, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 동일한 조건으로 3회 반복적으 로 실험하여 평균값을 측정하였다. 세포 생존율은 다음의 식에 따라 산출하였다.

세포 생존율(%)=

시료첨가군의 O.D. at 540 nm

☓ 100 시료무첨가군의 O.D. at 540 nm

2.2.2. Nitric oxide (NO) 생성 억제능 측정 고량 추출물의 NO 생성 억제능은 세포 배양 액내 NO양을 nitrite (NO2-)와 nitrate (NO3-)형 태로 측정하는 Green

et al.,

이용하여 측정 하였다. RAW 264.7 macrophage 세포를well당 5 × 10⁴cell/well의 농도로 분주하 고, 24시간 동안 배양 후 배지를 제거한 다음 LPS (lipopolysaccharide) 1 ㎍/mL 농도가 처리 된 배지에 시료를 농도별로 가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포 배양 상층액 100 μL와 griess reagent 100 μL을 새로운 96 well plate 에 가하여 차광된 상태에서 10 min 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO 생성 저해능(%) =

시료첨가군의 O.D. at 540 nm

× 100 시료무첨가군의 O.D. at 540 nm

2.2.3. 세포 내 활성산소종(ROS) 정량 분석 세포 내 활성산소종 농도의 변화를 측정하기 위해 60 mm culture dish에 HaCaT를 2 × 10⁵ cell/well의 농도로 분주하여 24시간 배양 후 농 도별로 시료를 처리하고 40 mJ/cm² UVB를 조 사하여 2시간 동안 추가 배양하였다. 세포 내 활

성산소종을 측정하기 위한 염료인

dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA)를 10 mM 첨가하여 30분 동안 처리 한 후 배양한 세 포에 PBS를 첨가하고 Flow Cytometer (BD Biosciences, USA)를 사용하여 ROS의 변화량을 측정하였다. 고량 추출물의 활성산소종 제거 효능 을 검증하기 위해 ROS scavenger역할을 수행하

는 ascorbic acid 역시 동일한 방식으로 시료처리 를 하여 측정하였다.

2.2.4. UVB에 대한 세포 보호 효과

WST assay의 원리를 이용하여 세포 생존율에 대한 측정을 실시하였다. EX-Cytox cell viability assay kit(Itsbio, Korea)를 사용하였으며 96 well plate에 HaCaT(3×10³cell/well)을 접 종하여 24시간 배양하였다. HaCaT에 고량 추출 물을 각각 0, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL농도로 처 리한 후 각각 4, 24, 48 시간 배양하였다. 그 후 40 mJ/cm² UVB를 조사한 뒤 배양된 well에 EX-Cytox cell viability assay kit reagent 10 mL를 첨가한 뒤 60분 내양하여 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.2.5. Western blotting

고량 추출물을 LPS에 유도된 RAW 264.7 macrophage 세포 내 COX-2 단백질 발현 변화 를 확인하기 위해 Western blotting을 시행하였 다. 고량 추출물을 농도별로 처리하고 UVB 100 mJ/cm²를 조사한 후 24시간 동안 배양하였다.

RAW 264.7를 PBS로 세척 후 RIPA buffer (50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1%

NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, protease inhibitor cocktail (Roche, Switzerland) 를 첨가하여 30분간 ice에서 방치하고 세포를 용 해하였다. 용해된 RAW 264.7 세포는 12,000 rpm, 4℃ 조건으로 30분간 원심 분리기를 이용 하여 원심 분리하고 상등액을 회수하였다. 상등액 은 SDS sample buffer (14.4 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM Tris (pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue)를 첨가 한 후 5분간 100°C에서 끓여 단 백질을 변성시킨 뒤 SDS-PAGE를 사용하여 분 자량별로 단백질을 분리하였다. 100 V의 조건에 서 단백질을 1시간 동안 nitrocellulose membrane (Whatman, UK)으로 transfer 한 다 음 단백질이 옮겨진 membrane은 5% skim milk 용액에서 1시간 동안 교반하고 blocking 처리하 였다. Membrane은 primary antibody (β-actin primary antibody (Sigma-Aldrich, USA), COX-2 primary antibody (Santa Cruz, USA)용 액에서 18시간 동안 4℃ 조건으로 교반하였으며, 그 후 membrane은 TBS-T (150 mM NaCl, 10

mM Tris-Cl (pH 7.5, 0.2% Tween 20)로 교 반하고 세척하였다. 세척이 된 membrane을 화학 적 형광을 낼 수 있는 horseradish peroxidase(HRP)가 결합되어 있는 secondary antibody 용액에 2시간 동안 상온에서 처리하고 TBS-T로 5분씩 3회 세척하였으며, super signal west pico solution (Pierce, USA)를 secondary antibody가 처리된 membrane에 처리하여 암실 에서 실험용 필름(Konica, Japan)으로 덮어 필름 에 감광을 유도하였다. 유도 후 자동현상기 (QX-130II, Konica)를 이용하여 현상하였으며 현상된 필름상의 단백질양은 Image J (National Institute of Mental Health, USA)를 이용하여 band 농도차이를 비교하였다.

2.2.6. 통계처리

본 연구의 모든 실험은 동일한 조건하에 독립 적으로 3회 이상 실시하여 실험결과를 도출하였 다. 모든 실험의 결과는 평균 ± 표준편차(Mean

± SD)로 표기 했으며, 통계처리는 SPSS Window Version 17.0(SPSS Inc., Illinois, USA) 을 이용하여 분석하였고, 유의성 검증은 Student’s t-test를 실시하였으며

p

3. 결과 및 고찰

3.1. 고량 추출물의 항염증 효과 측정 결과 3.1.1. RAW 264.7 세포에 대한 세포 생존율

측정

Nutral Red assay (NR)는 lysosome의 독성에 대한 세포 소기관이 미치는 영향을 규명할 수 있 는 방법[20]으로써 독성물질을 검정하는 방법으 로 이용되고 있다. 고량 추출물이 RAW 264.7 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보고자 Nutral Red (NR)용액을 이용하여 측정한 결과 Fig. 2에 나타내었다. 70 % 에탄올을 이용한 고량 추출물 5, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 처리하고, 48시간 배양하여 NR assay를 실시하였다. 실험 결과, 고량 추출물 5, 10, 20 ㎍/mL 농도까지 97 %이상의 세포 생존율을 나타났으며 50, 100

㎍/mL에서 세포 생존율이 각각 15.41, 23.9 % 감소하였으나, 세포 생존율에 크게 영향을 주지

않는다고 판단하여 100 ㎍/mL 이하의 농도 범위 에서 실시하였다. 이와 같은 결과를 통하여 고량 추출물이 RAW 264.7 세포에서 대한 유의한 세 포독성이 없는 것을 확인하였으며, 다음 시험을 진행하였다.

Fig. 2. Effect of

Sorghum nervosum

3.1.2. RAW 264.7 세포에 대한 NO 생성 억제능 측정

활성 질소종(reactive nitrogen species, ROS)의 하나로서 최근 염증 반응의 중요한 작용인자로 알려진 NO 생성 저해에 미치는 고량 추출물의 효과를 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 염 증 매개 물질인 LPS를 처리하여 NO 생성을 유 도시킨 후 70 % 에탄올 이용한 고량 추출물을 5, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL 농도별로 대식세포에 처리하여 NO 생성 억제능을 측정한 결과는 Fig.

3에 나타내었다. LPS 처리군에 비해 고량 추출물 은 100 ㎍/mL에서 50.18 % 유의하게 (*

p

Fig. 3. Inhibitory effect of

Sorghum nervosum

Result is represented as mean ± SD.

*

p

3.1.3. RAW 264.7 세포에 대한 COX-2 발현 억제능 측정

Cyclooxygenase (COX)는 arachidonic acid를 prostaglandin으로 변환시키는 효소로써, 특히 COX-2는 암세포에 의해 발생한 염증, growth factors, cytokines의 다양한 자극에 의해 유발된 다[22, 23, 24]. 1991년 COX의 isoform이 cloning됨에 따라[25, 26, 27], 기존의 COX가

Ⅰ형 효소인 COX-1과 Ⅱ형인 COX-2로 나뉘 어졌고 이에 대한 작용 및 prostaglandin과의 관 련성이 밝혀졌다. 대표적인 생리작용을 살펴보면, COX-1(constitutive form)은 조직의 구성요소로 서 혈소판 응집과 같은 생리 기능 유지와 위점막 보호기능 물질 생성하는 반면에 COX-2 (inducible form)는 염증 조직내에서 염증자극만 으로 유도 발현되며 염증과 암 등의 질환 억제에 중요한 역할을 한다[28, 29, 30]. 본 실험에서는 염증 매개 물질인 LPS를 대식세포인 RAW 264.7 세포에 처리한 후 70 % 에탄올로 추출한 고량 추출물을 25, 50 ㎍/mL로 처리하고 western blotting을 이용하여 RAW 264.7 세포 내 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 확인하였다 (Fig. 4).

정확한 발현량을 확인하고자 COX-2 HIGH와 LOW로 발현 노출 시간의 차이를 두고 동일한 방법으로 측정하였다. 두 처리군 모두 LPS에 의 해 유의하게 증가되었고, COX-2 발현량은 HIGH와 LOW 모두 고량 추출물 25, 50 ㎍/mL 농도에서 유의하게(

p

의해 생성된 COX-2는 염증과정에서 인지질을 대사시켜 생성된 arachidonic acid에서 PGE2를 생성시키는 효소이고, COX-2에 의해 생성된 PGE2는 혈관확장, 통증 및 발열 작용을 하는 것 으로 알려져 있으며, 과도한 COX-2의 발현은 암 조직에 있어서 혈관신생(angiogenesis) 및 전 이능(metastatic potential)을 높이고 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. COX-2의 염증반 응은 세포의 암화(carcicogenesis)에도 관련이 되 어 있음이 보고되고 있다[30]. 이러한 결과를 통 하여 고량 추출물이 RAW 264.7 대식세포에서 COX-2를 효과적으로 억제하는 기능으로 보아 피부 염증 반응을 효과적으로 억제하는데 관여할 수 있을 것으로 사료된다.

(A)

(B)

Fig. 4. (A)A variation of COX-2 protein expression due to SN is shown.

(B)COX-2 protein expression due to SN is graphed. Inhibitory effect of

Sorghum nervosum

p

p

).

SN:

Sorghum nervosum.

3.2. 고량 추출물의 UVB 세포 보호 효과 측정 결과

3.2.1. HaCaT 세포에 대한 세포 생존율 측정 HaCaT keratinocytes 세포에서 고량 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 70 % 에탄올을 이용한 고량 추출물 5, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 처리하고, 48시간 배양 하여 NR assay를 실시하였다. 실험결과, 고량 추 출물 5, 10, 20, 50 ㎍/mL 농도까지 99 %이상 의 세포 생존율을 나타났으며 100 ㎍/mL에서 세 포 생존율이 20.41% 감소하였으나, 세포 생존율 에 크게 영향을 주지 않는다고 판단하여 100 ㎍ /mL 이하의 농도 범위에서 실시하였다. 이와 같 은 결과를 통하여 고량 추출물이 HaCaT 세포에 서 대한 유의한 세포독성이 없는 것을 확인하였 으며, 다음 시험을 진행하였다.

Fig. 5. Effect of

Sorghum nervosum

3.2.2. 자외선을 조사한 HaCaT 세포에 대한 세포 생존율 측정

고량 추출물이 UVB에 의한 세포 사멸 억제에 대해 HaCaT keratinocytes 세포를 보호하는 효 과가 있는지 알아보기 위해 세포 생존율 변화를 확인 하였다. HaCaT 세포에 고량 추출물을 각각 0, 10, 20, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 전처리 하 고 각각 4, 24, 48시간 후 UVB 40 mJ/cm²로 조사하여 세포 생존율 변화를 확인하였다. 그 결 과 HaCaT 세포는 고량 추출물을 처리하지 않고 4시간 후 UVB만 조사하였을 때 세포 생존율이 38.5 7 %로 감소하였으나, 고량 추출물을 10 ㎍ /mL 전처리 시 49.80 %, 20 ㎍/mL 전처리 시

59.57 %, 50 ㎍/mL 전처리 시 68.36 %, 100

㎍/mL 전처리 시 62.50 %로 HaCaT keratinocytes 세포의 세포 생존율이 회복되는 것 을 확인하였다(Fig. 6).

Fig. 6. Cell viability on after 4 houres UVB in the HaCaT pretreated with

Sorghum nervosum.

p

.

Fig. 7. Cell viability on after 24 houres UVB in the HaCaT pretreated with

Sorghum nervosum.

p

p

.

HaCaT 세포에 고량 추출물을 처리하지 않고 24시간 후 UVB만 조사 하였을 때 세포 생존율 이 38.57 %로 감소하였으나 고량 추출물을 10

㎍/mL 전처리 시 54.6 9 %, 20 ㎍/mL 전처리 시 69.34 %, 50 ㎍/mL 전처리 시 63.48 %, 100 ㎍/mL 전처리 시 55.18 %로 HaCaT 세포 에 대한 세포 생존율이 회복 되는 것을 확인하였 다((Fig. 7). 고량 추출물을 처리하지 않고 48시 간 후 UVB만 조사하였을 때 세포 생존율이

35.64 %로 감소하였으나, 고량 추출물을 10 ㎍ /mL 전처리 시 61.04 %, 20 ㎍/mL 전처리 시 58.11 %, 50 ㎍/mL 전처리 시 59.57 %, 100

㎍/mL 전처리 시 40.53 %로 HaCaT 세포에 대 한 세포 생존율이 회복되는 것을 확인하였다(Fig.

8).

Fig. 8. Cell viability on after 48 houres UVB in the HaCaT pretreated with

Sorghum nervosum.

p

p

.

3.2.3. 세포 내 활성 산소종(ROS) 정량 분석 측정

세포대사 과정 중에서 발생하는 세포내 ROS 총량 감소에 고량 추출물이 미치는 효과를 확인 하게 위해 형광 probe DCF-DA를 이용한 flow cytometry를 실시하였으며, HaCaT 세포에 고량 추출물을 24시간 동안 전 처리한 후, UVB 40 mJ/cm²로 조사하여 분석한 결과는 다음과 같다 (Fig. 9).

고량 추출물과 UVB 조사 2가지 모두 처리하 지 않은 경우를 100%로 봤을 때, UVB를 24시간 처리한 경우 ROS 총량이 196.34%로 증가하였 다. 그러나 고량 추출물을 10, 20, 50, 100 ㎍ /mL 처리 시 각각 153.95%, 108.21%, 72.51%, 53.55%로 ROS 총 양이 감소하는 것을 확인하였 다. 양성 대조군 L-ascorbic acid 10 mM 처리 시 ROS총 양이 75.86%를 나타냈다. 이는 고량 추출물의 50 ㎍/mL 처리한 경우와 유사한 수치 를 나타내어 고량 추출물이 ROS 총 양 감소에 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 9. Intracellular ROS scavenging activity on UVB in the HaCaT cell pretreated with

Sorghum nervosum.

p

p

.

4. 결 론

본 연구는 70 % 에탄올 고량(

Sorghum nervosum

RAW264.7 macrophage 세포와 HaCaT keratinocyte 세포를 이용하여, 세포 생존율 분석, 항염증, COX-2 단백질 발현 변화, ROS 정량 분석, UVB에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다.

RAW264.7 세포와 HaCaT세포에서 세포 생존율 에 크게 영향을 주지 않았으며, 세포 독성이 없 는 것을 확인하였다. 항염증 효과 측정 결과, NO 생성 억제능에서 고량 추출물이 LPS에 의해 유도된 NO 생성이 농도 의존적으로 감소하는 것 을 확인하였으며, western blotting을 이용하여 RAW 264.7 세포 내 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과, COX-2 발현량은 고량 추 출물 25, 50 ㎍/mL 농도에서 유의하게(

p

여, 이상의 결과로 고량 추출물을 기능성 화장품 원료로서 적용될 가능성을 제시하였다.

References

1. Chandra J, Samali A, Orrenius S.

“Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress”,

Free Radic Biol Med.

vol. 29, pp. 323-333, (2000).

2. Buttke TM, Sandstrom PA. “Oxidative stress as a mediator of apoptosis”,

Immunol Today.

3. Fang J, Nakamura H, Iyer AK. “Tumor- targeted induction of oxystress for cancer therapy”.

J. Drug Target.

475-486, (2007).

4. Barbouti A, Doulias PT, Nousis L, Tenopoulou M, Galaris D. “DNA damage and apoptosis in hydrogen peroxide- exposed Jurkat cells: bolus addition versus continuous generation of H2O2”,

Free Radical Biology & Medicine,

691-702, (2002).

5. Nathan CF. “Secretory products of macrophages”,

The Journal of Clinical Investigation,

6. Burns ER. “Methods for estimation of tannin in grain sorghum”, Agronomy Journal. vol. 63, pp. 511-514, (1971).

7. Nip WK, Burns EE. “Pigment charaterization in grain sorghum I Red varieties. Cereal Chemistry, vol. 46, pp.

490-495, (1969).

8 Awika JM, Rooney LW, Wu X, Prior RL, Cisneros-Zevallos L. “Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum(

sorghum bicolor

Journal of Agricultural and Food Chemistry.

9. Gupta RK, Haslam E. “Plant proanthocyanidins”,

Journal of Chemical Society

10. Gu L, Keim M, Hammersone JF, Beecher G, Cunningham D, Vannozzi S, Prior L.

“Fractionation of polymeric procyanidins from lowbush blueberry and quantification of procyanidins in slscted foods with an optimized normal phase HPLC-MS fluorescent detection method”,

Journal of Agricultural and Food Chemistry

11. Kim JS. “Dyeing Power of Coating Permanent to Utilize a Kaoliang Pigment”,

Kor. J. Aesthet. Cosmetol.,

127-132, (2014).

12. Kandaswami C, Middleton JE. “Free radical scavenging and antioxidant activity of plant flavonoids”,

Adv. Exp. Med. Biol.,

13. Rice-Evans CA, Miller NJ. “Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food”,

Biochem. Soc.

Trans

14. Robak J, Shridi F, Wolbis M, and Krolikowska M. “Screening of the influence of flavonoids on lipoxygenase and cyclooxygenase activity, as well as on nonenzymic lipid oxidation”,

Pol. J.

Pharmacol. Pharm.,

15. Oh KN, “Protective effects of apigenin and luteolin on ultraviolet A-induced Matrix Metalloproteinase expression in human keratinocyts”,

Department of Pharmacy, Graduate School of Chosun University,

16. Sreemanti D, Jayeeta D, Avijit P, Asmita S, Anisur RK. “Apigenin, a bioactive flavonoid from

Lycopodium clacatum

J. Acupunct.

Meridian Stud.,

17. Robak J, Shridi F, Wolbis M, and Krolikowska M. “Screening of the influence of flavonoids on lipoxygenase

and cyclooxygenase activity, as well as on nonenzymic lipid oxidation”,

Pol. J.

Pharmacol. Pharm.,

18. Borenfreund E, Puerner JA, “Toxicity determined in vitro by morphologica lalterationsandneutra lred absorption”,

Toxicol.Lett.,

19. Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skippr PL, Wishnok JS, “Tannenbaum SR.

Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]

nitrate in biological fluids”,

Anal Biochem.,

20. Borenfreund E, Puerner JA. “Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption”,

Toxicol Lett.,

21. Miliani de Marval PL, Zhang Y. “The RP-Mdm2-p53 pathway and tumorigenesis”,

Oncotarget.,

234-238, (2011).

22. Seibert K, Zhang Y, Leahy K, Hauser S, Masferrer J, Perkins W. “Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain”,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

23. Levy GN. “Prostaglandin H synthases, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, and colon cancer”,

FASEB. J,

234-247, (1997).

24. Takahashi M, Mutoh M, Shoji Y, Sato H, Kamanaka Y, Naka M, Mar uyama T, Sugimura T, Wakabayashi K. “Suppressive effect of an inducible nitric oxide inhibitor, ONO-1714, on AOM-induced rat clon carcinogenesis”,

Nitric Oxide,

14, pp. 130-136, (2006).

25. Xie W, Chpman JG, Robertson DL, Erikson RL, Simmons DL. “Expression of a Mitogen-responsive Gene Encoding Prostaglandin Synthetase in Regulated by mRNA Splicing”,

Proc. Natl. Acad. Sci.

USA,

26. Kujubu DA, Fletcher BS, Varnum BC, Lim Rw, Herschman HR. “TIS10, a Phorbol Ester Tumor Promoter-inducible mRNA from Swiss 3T3 cells, Encodes a Novel Prostaglandin Synthase/Cyclooxygenase Homologue”,

J. Biol. Chem,

12866-12938, (1991).

27. O'Banion MK, Sadowski HB, Winn V, Young DA. “A Serum and Glucocorticoid Regulated 4 Kilobase mRNA Ecodes a Cyclooxygenase Related Protein”,

J. Biol.

Chem,

28. Kenny BP, Chan CC, Culp SA, Cromlish WA. “Cloning and Expression of Rat Prostaglandin Endoperoxide Synthase Cyclooxygenase-2 cDNA”,

Biophys. Res.

Commun,

29. Vane JR, Mitchell JA, Appleton I, Tomlinson A, Bishop Bailey D, Crotall J, Willoughby DA. “Inducible Isoforms of Cyclooxygenase and Nitric Oxide Synthase in Inflammation”,

Proc Natl Acad Sci USA,

30. Massferrer JL, Zweifel BS, Manning PT, Hauser SD, Leahy KM, Smith WG, Isakson PC, Seibert K. “Selective Inhibition of Inducible Cyclooxygenase-2 in vivo is Antiinflammatory and Nonulcerogenic”,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

3228-3232, (1994).