Analysis of Genetic Polymorphism and Relationship of Korean Ginseng Cultivars and Breeding Lines using EST-SSR Marker

http://bx.doi.org/10.7783/KJMCS.2012.20.4.277

EST-SSR 마커를 이용한 인삼 품종과 육성계통의 유전적 다형성 및 유연관계 분석

방경환*

·서아연*

·정종욱**·김영창*·조익현*·김장욱*·김동휘*·차선우*·조용구***·김홍식***

*농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부, **농촌진흥청 농업유전자원센터, ***충북대학교 식물자원학과

Analysis of Genetic Polymorphism and Relationship of Korean Ginseng Cultivars and Breeding Lines using EST-SSR Marker

Kyong Hwan Bang ^*

, A Yeon Seo ^*

, Jong Wook Chung ^** , Young Chang Kim ^* , Ick Hyun Jo ^* , Jang Uk Kim ^* , Dong Hwi Kim ^* , Seon Woo Cha ^* , Yong Gu Cho ^*** and Hong Sig Kim ^***

*Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong 369-873, Korea.

**National Agrobiodiversity Center, NAAS, RDA, Suwon 441-707, Korea.

***Department of Plant Resources, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Korea.

ABSTRACT : In this study, Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat (EST-SSR) analyses were used to clarify the genetic polymorphisms among Korean ginseng cultivars and breeding lines and to classify them into distinct genetic groups.

Polymorphic and reproducible bands were produced by 14 primers out of total 30 primers used in this study. Fourteen EST- SSR loci generated a total of 123 bands. Amplified PCR products showed the highly reproducible banding patterns at 110~920 bp. The number of amplified bands for each EST-SSR primers ranged from 2 to 19 with a mean of 8.8 bands. P26 and P35 primers showed 13 and 12 banding patterns, respectively. The number of alleles for each EST-SSR locus ranged from 1.67 to 2.00 with a mean of 1.878 alleles. P34 and P60 primers showed the highest and the lowest genetic polymor- phism, respectively. Cluster analysis based on genetic similarity estimated by EST-SSR markers classified Korean cultivars and breeding lines into 4 groups. Group included Gopoong and Chunpoong and 9 breeding lines (55%), group included 2 breeding lines (10%), group included 3 breeding lines (15%), group included Gumpoong and 3 breeding lines (20%). Conse- quently, the EST-SSR marker developed in this study may prove useful for the evaluation of genetic diversity and differenti- ation of Korean ginseng cultivars and breeding lines.

Key Words : Korean Ginseng, Cultivar, Breeding Line, Genetic Polymorphism, EST-SSR

서 언

인삼 ( Panax ginseng C. A. Mey.) 은 두릅나무과에 속하는 여러해살이 식물로 오래전부터 우리나라와 중국 등지에서 매 우 귀한 한약재로 이용되어 왔다 . ^{전 세계적으로 인삼 속} ( Panax ) 에 속하는 식물의 숫자는 약 12 종으로 적은 편인데 , 25 ℃ 전후의 선선한 기후와 반음지 조건에서만 자라기 때문에 전 세계에서 동아시아 일대와 북미지역 등 2 군데에서만 자생 하는 것으로 알려져 있다 .

한편 인삼 속에 속하는 식물 중 약효와 경제성이 인정되어 재배·생산되는 인삼은 우리나라의 고려인삼 ( Panax ginseng

C. A. Mey.), ^{중국의 전칠삼} ( P. notoginseng (Burkill) F. H.

Chen ex C. H. Chow), 북미의 화기삼 ( P. quinquefolius L.)

의 3 종에 불과하다 (Wen and Zimmer, 1996).

작물의 품종 육성은 유전자원의 수집 , 보존 , 평가 및 육종의 활용에 의해 이루어지는데 , ^{인삼 품종 육성은 주로 농가에서}

발견된 특이 개체의 선발을 통하여 이루어져 왔다 . ^현재까지

국내 인삼 품종은 천풍 등 9 품종이 선발육종법에 의해 육성되 었으나 , 유전자원 및 육성계통을 대상으로 이들의 작물학적 특 성 및 분자유전학적인 특성 평가 등의 육종에 기반이 되는 연 구가 많이 부족한 실정이다 .

1980 년대에 다양한 유전분석을 목적으로 시작된 DNA 마커 개발에 관한 연구는 전통적으로 사용되어왔던 형태적인 특성 및 단백질 마커에 비교하여 많은 장점을 지니고 있다 . ^{그 장}

†Corresponding author: (Phone) +82-43-871-5534 (E-mail) [email protected] Received 2012 August 2 / 1st Revised 2012 August 8 / Accepted 2012 August 10

1

Bang KH and Seo AY contributed equally to this paper.

점으로는 활용할 수 있는 마커의 수가 제한적이지 않고 , ^토양

및 재배조건 등 환경에 영향을 받지 않는다는 점이다 .

이러한 장점을 바탕으로 DNA 마커를 이용한 분자생물학

연구가 활발히 진행되어 왔는데 , 특히 특정 DNA 를 빠른 시 간 내에 증폭할 수 있는 PCR (polymerase chain reaction)

기술이 개발됨에 따라 급속한 발전을 이루게 되었다 (Mullis

et al ., 1986). PCR ^{을 기반으로 하는} DNA ^마커는 9~10 mer

의 임의 프라이머를 이용하는 RAPD (random amplified polymorphic DNA) (Williams et al ., 1990) 와 생물체의 게놈 에서 밝혀진 염기서열을 기초로 DNA 의 변이를 분석하는

SSR (simple sequence repeat) 등이 있으며 (Harmada et al. , 1982; Trautz and Renz, 1984), 이러한 기법들이 유전체 연구 분야에 주로 활용되어져 왔다 .

한편 RFLP (restriction fragment length polymorphism) (Botstein ^{et al} ., 1980) ^{기법은 식물체} DNA ^{의 특정부위를 인}

식하는 제한효소의 처리로 얻어진 DNA 단편을 확인하는 방 법으로 , 벼 (McCouch et al ., 1988), 밀 (Chao et al ., 1989)

등의 많은 작물에서 이 기법을 이용하여 유전자 지도가 작성 된바 있다 . AFLP (amplified fragment length polymorphism)

기법은 RFLP 기법을 변형한 것으로 DNA 를 제한효소로 처리 한 후 특정 프라이머를 이용하여 PCR ^{을 수행하는 방법으로} (Vos ^{et al.,} 1995), ^{실험결과 상대적으로 많은 수의} DNA ^단

편을 확보할 수 있어 유전적인 다형성을 관찰하기에 유리한 방법으로 알려져 있다 .

STS (sequence tagged site) 기법은 특정 클론들을 대상으 로 염기서열을 분석한 후 다양한 프라이머를 제작하여 다형성 을 확인하는 방법이며 (Olsen et al ., 1989), SCAR (sequence characterized amplified region) ^기법은 RAPD ^나 AFLP ^로부터

얻어진 특정 DNA ^{단편을 유전자클로닝 하여 염기서열을 분}

석한 후 primer 를 새롭게 제작하여 PCR 한 후 유전양상을 확 인하는 방법이다 (Paran and Michelmore, 1993). 지금까지 개발된 다양한 DNA 분석 방법 중 SSR 기법은 genome 전 체에 널리 분포하여 유전자원 집단 , 품종 및 개체 간에 다형 성이 높아서 유전적 다양성을 평가하는데 있어 효율적인 방법 으로 널리 활용되어 왔다 (Wu and Tanksley, 1993; Rongwen

et al. , 1995; Ogbonnaya et al ., 2008).

한편 인삼은 다른 주곡작물에 비해 비교적 늦게 DNA 마커 를 활용한 유전분석 연구가 진행되어 왔다 . Wen 과 Zimmer (1996), Ngan 등 (1999) 은 인삼 종들을 대상으로 5.8S rDNA

와 ITS (internal transcribed spacer resion) 부분의 유전자 염 기서열 차이를 분석하였고 , Fushimi 등 (1997) 과 Komatsu 등

(2001) ^은 PCR-RFLP ^{방법을 이용하여 인삼 종들의} 18S rRNA 유전자 서열의 차이를 분석한 바 있다 .

Shaw 와 But (1995), Um 등 (2001), Ha 등 (2002), Kim

과 Choi (2003), Shim 등 (2003), In 등 (2005), Kim 등

(2005) ^및 Lim ^등 (2007) ^은 AFLP, DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA), ISSR (inter simple sequence repeat) 및 RAPD 를 이용하여 다양한 인삼 종들 및 고려인삼을 대상으로 이들의 유전적 다양성과 유연관계를 분 석하였다 .

고려인삼 품종을 대상으로 분자기법을 적용한 연구는 Yang

등 (2001) ^이 5.8S rDNA ^와 ITS (internal transcribed spacer resion) 부분의 염기서열 차이를 보고한바 있고 , Kim 등 (2007)

은 고려인삼 품종과 외국삼을 대상으로 유전분석을 수행하여

고풍과 금풍을 구별한 결과를 도출한 바 있다 . Dan 등

(2009) 은 SSR 마커를 이용하여 국내인삼 품종과 미국삼의 유 전적 다양성을 평가하였다 . Bang 등 (2010) 과 Lee (2010) 는

STS-CAPS (sequence tagged site-cleaved amplified polymorphic sequence) ^{마커를 이용하여 국내 인삼 품종을 판별하였으며} ,

또한 Bang ^등 (2011b) ^은 SSR ^{마커를 이용하여 인삼 품종 및}

국내외 수집종의 유전적 다양성을 분석한 바 있다 .

이처럼 인삼에서의 DNA 마커 개발에 관한 연구는 ITS, RFLP, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, 및 STS 등의 기법들이 적 용되었지만 주로 인삼 속의 다른 종들 간의 구분에 관한 연구 와 인삼 품종 구분이 주로 진행되었고 , 인삼 육성 계통을 대 상으로 한 유전분석의 연구는 전무한 실정이다 . ^{따라서 본 연}

구는 게놈 전체에 널리 분포하며 품종 또는 개체간의 다형성 이 높아서 유전적 다양성을 평가하는데 이상적이며 , 품종 구 별에 효율적인 SSR 방법과 유사한 EST-SSR 분자기법을 이용 하여 인삼 품종 및 육성 계통의 유전적인 다형성 및 유연관계 를 분석하고자 수행하였다 .

재료 및 방법

1. 시험재료

본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부의 재배포장에서 육성중인 G04009 등 20 계통과 국 내에서 주로 재배되고 있는 천풍 , 연풍 , 고풍 및 금풍의 4 품종 을 대상으로 하였으며 , ^{인삼의 연근} ( ^年根 ) ^은 4 ^{년생을 기준으로}

하였다 (Table 1). ^{인삼을 재배할 두둑은} 2007 ^년 10 ^{월에 두둑}

폭 90 ㎝ , 고랑폭 90 ㎝ , 두둑높이 30 ㎝ 이상으로 만들고 , 2008 년 3 월에 7 × 10 주 (90 × 180 ㎝ ) 를 식재거리 15 × 20 로 이 식한 후 , 출아 전에 목재 A 형 후주연결식 해가림을 설치하고 ,

청색 3 + 흑색 1 의 4 중직 차광망을 피복한 후 , 5 월 하순 고온장 해 예방을 위해 흑색 2 중직 차광망을 덧씌웠다 . 병해충 방제 ,

잡초제거 및 기타관리는 인삼 GAP 표준재배지침서에 준하였 다 (RDA, 2009).

2. 유전적 다양성 분석을 위한 DNA 추출 및 정량

Genomic DNA 를 확보하기 위하여 4 년생 잎을 채취하여 세

척한 후 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태 가 되도록 마쇄한 다음 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany) 을 이용하여 제시된 실험방법에 따라 DNA 를 추출 하였다 . 추출된 DNA 는 1% agarose gel 에서 Lambda DNA (Promega) 와 함께 전기영동한 후 , EtBr (Ethidium Bromide)

로 염색하여 UV transilluminator 에서 DNA 밴드의 밝기를 상대 비교하여 농도를 측정하였다 . 농도 측정이 완료된 각각

의 DNA ^{샘플들은 멸균된 증류수를 이용하여 최종} DNA ^농

도를 5 ng/ ^{㎕ 로 정량하였다} .

3. STS 마커를 이용한 분석

EST-SSR 유전분석 시 사용되는 인삼 품종과 계통들의 샘플

에 대한 대표성을 확보하기 위하여 , Bang 등 (2010) 과 Lee (2010) ^{에서 제작한} 8 ^종의 STS marker ^{를 이용하여 유전분석을}

수행하였으며 , 8 ^{종의 마커는 다음과 같이 제작되었다} . Methylation-filtered library 와 methylation-unfiltered library

구축한 후 , 두개의 library 로부터 확보된 클론들을 시퀀싱 하여 염기서열을 확보하고 blast search 등을 통하여 시퀀스를 분석 한 후 STS 프라이머를 제작하였다 . 200 여개 이상의 STS 프

라이머를 인삼 품종 판별에 적용한 결과로서 Table 2 ^{와 같이}

8 개의 다형성을 나타내는 프라이머를 선발하였다 .

PCR 에 사용된 혼합용액의 조성은 genomic DNA 약

10 ng/2 ㎕ , primer 20 pmole, 2.5 mM MgCl

, 0.25 mM dNTPs, 0.5 unit Taq polymerase (Neurotics, Deajeon, Korea)

로 총 반응액의 volume 은 25 ㎕ 이었다 . DNA 증폭기기는

Tprofessional thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)

을 사용하였고 , PCR ^반응은 95 ^℃에서 5 ^{분간 초기변성 후} , 95

℃ 30 초 변성 , 60 ℃ 또는 65 ℃ 30 초 결합 및 72 ℃ 1 분 신장 의 조건으로 총 40 cycles 를 수행하였고 , 마지막으로 72 ℃에서

10 분간 신장 반응을 수행하였다 . MFG110 와 UFG74 프라이머 는 PCR 을 수행한 후 37 ℃에서 5 시간 동안 Hinf 의 제한효소 를 처리하였다 . 그 후 0.5 X TBE buffer 를 사용하여 1.5%

agarose gel 에서 전기영동하여 EtBr (Ethidium Bromide) 로 염 색한 후 UV transilluminator ^{로 유전양상을 확인하였다} .

4. EST-SSR 마커를 이용한 분석

Yang 등 (2008) 이 발표한 논문에서 다형성이 높은 30 쌍의

EST-SSR 프라이머를 선발하여 본 실험에 사용하였다 (Table 2). PCR 에 사용된 혼합용액의 조성은 genomic DNA 약

10 ng/2 ㎕ , primer 10 pmole, 2.5 mM MgCl

, 0.25 mM dNTPs, 0.5 unit Taq polymerase (Neurotics, Deajeon, Korea) ^{로 총 반응액의} volume ^은 25 ^㎕이었다 . DNA ^{증폭기기는} Tprofessional thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany) 를 이용하였고 , PCR 반응은 95 ℃에서 5 분간 초기변성 후 , 95 ℃

30 초 변성 , 55 ℃ 또는 60 ℃ 30 초 결합 및 72 ℃ 1 분 신장의

Information of four Korean ginseng cultivars and twenty

breeding lines used in this study.

No. Breeding lines

or cultivars Origin Classification

1 G04009 Korea Jakyung

2 G04012 Korea Jakyung

3 G04020 Korea Jakyung

4 G04021 Korea Jakyung

5 G04026 Korea Jakyung

6 G04030 Korea Jakyung

7 G04046 Korea Jakyung

8 G04047 Korea Jakyung

9 G04049 Korea Jakyung

10 G04065 Korea Jakyung

11 G04069 Korea Jakyung

12 G04076 Korea Jakyung

13 G04084 Korea Jakyung

14 G04085 Korea Jakyung

15 G04086 Korea Hwangsook

16 G04090 Korea Jakyung

17 G04097 Korea Jakyung

18 G04098 Korea Jakyung

19 G04113 Korea Jakyung

20 G04116 USA Jakyung

21 Chunpoong Korea Cultivar

22 Yunpoong Korea Cultivar

23 Gopoong Korea Cultivar

24 Gumpoong Korea Cultivar

Table 2.

EST-SSR primers amplifying polymorphic bands among 4 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines and their marker information.

Primer

Code Size (bp) Number of bands Polymorphic Monomorphic Total

P2 210~400 10 0 10

P4 270~520 7 2 9

P17 250~420 9 0 9

P21 110~600 9 2 11

P22 180~480 9 4 13

P25 380~860 5 1 6

P26 130~250 14 0 14

P34 180~190 3 0 3

P35 110~370 19 0 19

P55 260~270 2 0 2

P56 340~510 3 3 6

P57 120~190 4 0 4

P58 370~900 10 1 11

P60 470~920 4 2 6

TOTAL 108 15 123

조건으로 총 35 cycles ^{를 수행하였고} , ^{마지막으로} 72 ^℃에서 10 분간 신장 반응을 수행하였다 . 증폭된 DNA 산물은 0.5 X TBE buffer 를 사용하여 5% polyacrylamide gel 에서 전기영동 하여 EtBr (Ethidium Bromide) 로 염색한 후 UV transilluminator

로 유전양상을 확인하였다 .

5. 통계처리를 통한 유연관계 분석

증폭된 PCR 산물의 분석은 밴드가 있는 것을 “1”, 없는 것 을 “0” 으로 하여 data matrix 를 작성하였으며 , 유전적 다양성 ,

유전적 거리를 산출하기 위하여 POPGENE software

(version1.31) 를 이용하여 분석하였다 (Yeh et al . , 1997). 또한

UPGMA (Unweighed Pair Group Method using Arithmetic

averages) 방법으로 댄드로그램을 작성하여 유연관계를 비교 분

석하였다 .

결과 및 고찰

1. STS 마커를 이용한 유전분석

Bang 등 (2010) 과 Lee (2010) 는 인삼의 genomic DNA 라 이브러리 구축을 통하여 인삼 품종 구분에 유용한 8 개의 STS

프라이머를 선발하였다 . ^이중 4 ^{개의 프라이머} (MFGp130A, MFGp183A, MFGp81A, UFGp156A) ^{는 삽입 또는 결실} (Insertion or Deletion) 의 변이에 의한 다형성을 나타내고 , 2 개 의 프라이머 (MFGp110A, UFGp74) 는 단일염기서열다형성

(Single Nucleotide Polymorphism) 이며 , 2 개의 프라이머

(UFGp163, MFGp108) ^는 DNA ^{단편의 증폭 유무를 나타내는}

우성 마커라고 보고한 바 있다 . 결론적으로 인삼 품종 간 다 형성을 나타내는 총 8 종의 프라이머를 이용하여 고려인삼 품 종들을 구분할 수 있다고 하였다 .

본 실험에서는 8 종의 STS 프라이머를 이용하여 1 계통 당

10 ^{개체씩을 대상으로 유전분석을 수행하여 계통의 균일성을}

검정하였으며 , ^{유전적으로 균일한 샘플들을 선정하여} EST-SSR

분석에 활용하였다 . Fig. 1 은 계통의 균일성이 확보된 샘플을 대상으로 8 종의 STS 프라이머를 이용하여 유전분석을 수행한 결과로써 , 20 계통 간에 유전적인 차이가 있음을 1 차적으로 확 인할 수 있었다 .

2. EST-SSR 마커를 이용한 분석

Yang ^등 (2008) ^{이 발표한 논문으로부터 제작한} 30 ^개의 EST-SSR ^{프라이머를 사용하여} PCR ^{을 수행한 결과} , ^다형성을

나타내는 14 개의 프라이머를 선발하였다 . Table 2 에서와 같이 증폭된 DNA 단편의 수는 123 개이었고 , DNA 단편의 범위는

110~920 bp 이었다 . 각 프라이머에 의해 증폭된 DNA 단편의 수는 최소 2 개에서 최대 19 개로 다양하였으며 , 프라이머 한 개당 평균 8.8 개의 DNA 단편이 증폭되었다 . 한편 , 24 개의 계 통과 품종에서 다형성을 보이는 DNA ^{단편 수는} 108 ^개 (87.8

%) ^이었으며 , ^{그렇지 않은} DNA ^{단편의 수는} 15 ^개 (12.2 %)

이었다 .

EST-SSR 프라이머를 이용하여 계통 및 품종 간에 특이적으

로 나타난 DNA banding 패턴을 비교 분석한 결과 , P22,

Fig. 1. Amplification products of the STS marker system on Korean ginseng breeding line. (A) MFGp183A, (B) MFGp130A, (C) MFGp110A, (D) UFGp74, (E) UFGp163, (F) MFGp108, (G) MFGp81A, (H) UFGp156A. lane1, G04009; lane2, G04012; lane3, G04020; lane4, G04021; lane5, G04026; lane6, G04030; lane7, G04046; lane8, G04047; lane9, G04049; lane10, G04065;

lane11, G04069; lane12, G04076; lane13, G04084; lane14, G04085; lane15, G04086; lane16, G04090; lane17, G04097;

lane18, G04098; lane19, G04113; lane20, G04116; M, 2-Log DNA ladder (NEB).

P25 프라이머를 이용하였을 때는 미국에서 수집하여 육성한 계통 G04116 에서만 다른 19 계통 및 4 품종과 차이가 나는 특 이적인 유전양상을 보였다 (Fig. 2). 이와 같이 선발된 프라이

머들은 미국삼을 고려인삼과 구별하는 목적에 활용할 수 있으 리라 판단된다 .

또한 P2 프라이머에서는 약 240 bp 에서 G04086 와 연풍에

Fig. 2. Genetic polymorphisms by P22(A) and P25(B) primers among Korean ginseng cultivars and breeding lines. lane1, G04009;

lane2, G04012; lane3, G04020; lane4, G04021; lane5, G04026; lane6, G04030; lane7, G04046; lane8, G04047; lane9, G04049; lane10, G04065; lane11, G04069; lane12, G04076; lane13, G04084; lane14, G04085; lane15, G04086; lane16, G04090; lane17, G04097; lane18, G04098; lane19, G04113; lane20, G04116; lane21, Chunpoong; lane22, Yunpoong; lane 23, Gopoong; lane24, Gumpoong; M, 100 bp molecular weight marker (Promega).

Fig. 3. Genetic polymorphisms by P2 (A), P17 (B), P55 (C) and P57 (D) primers among Korean ginseng cultivars and breeding lines. lane1, G04009; lane2, G04012; lane3, G04020; lane4, G04021; lane5, G04026; lane6, G04030; lane7, G04046;

lane8, G04047; lane9, G04049; lane10, G04065; lane11, G04069; lane12, G04076; lane13, G04084; lane14, G04085;

lane15, G04086; lane16, G04090; lane17, G04097; lane18, G04098; lane19, G04113; lane20,G04116; lane21, Chunpoong;

lane22, Yunpoong; lane 23, Gopoong; lane24, Gumpoong; M, 100bp molecular weight marker (Promega).

서만 특이적인 DNA 단편이 관찰되었고 , G04116 계통에서도 특이적인 유전양상이 나타났다 . 한편 , P57 프라이머에서는 유 전양상이 3 ^{패턴으로 나타났는데} , G04076, G04084, G04086, G04090 ^{및 연풍은 약} 150 bp ^{에서 특이적인} DNA ^{단편이 증}

폭되었고 , G04116 ^{은 약} 130 bp ^에서 , ^나머지 16 ^{개의 계통과}

품종에서는 약 140 bp 에서 특이적인 유전양상이 관찰되었다

(Fig. 3).

P26 과 P35 프라이머를 이용한 PCR 결과에서는 다양한 유 전양상을 확인할 수 있었는데 , 24 개의 계통과 품종이 각각 13

개 , 12 개의 유전양상을 보이는 것을 확인할 수 있었는데 , 이 프라이머들은 향후 인삼 육성계통을 구분하는데 유용한 DNA

마커로 활용될 수 있으리라 판단된다 (Fig. 4).

선발된 프라이머 별 대립인자는 최소 1.67 ^{에서 최대} 2.00 ^의

범위였고 , ^평균 1.878 ^이었다 . ^{프라이머 별 유전적 다양성을 추}

정한 결과 , Nei 의 유전적 다양성은 전체 평균이 0.136 으로 나 타났으며 , P26, P34, P35 및 P57 에서 유전적 다양성 값이 높 았고 , P4 와 P60 에서 낮은 값을 나타내었다 . 한편 Shannon’s Index 값도 Nei 의 유전적 다양성 값과 비교하여 수치간의 차 이는 있었으나 동일한 경향을 나타내었다 . Shannon’s Index

값은 전체 평균이 0.241 ^{로 나타났으며} , P34 ^가 0.446 ^{으로 가장}

높았고 , P60 이 0.116 으로 가장 낮은 값을 나타내었다 (Table 3). 본 연구에서 유전통계 분석에 이용된 14 개의 EST-SSR 프 라이머 중에서 3 개의 프라이머 (P26, P34 및 P35) 는 인삼 품 종과 계통에서 비교적 높은 수의 대립단편과 높은 유전적 다 양성 값을 나타내는 프라이머였으며 , 반면에 P4 와 P60 은 비교 적 낮은 수의 대립단편과 낮은 유전적 다양성 값을 나타냈다 . Table 4 ^{는 계통간의 유전적 거리를} Nei ^{의 공식에 따라 구한}

것으로 24 ^{개의 품종 및 계통의 유전적 거리는} 0.0~0.71 ^범위

로 분포하였다 . G04009 와 G04047 이 유전적 거리가 가장 가 까웠고 , G04020 과 G04116 이 유전적 거리가 가장 멀었다 . 한 편 , 미국에서 수집 육성된 G04116 은 모든 품종 및 계통과 유

전적 거리가 멀었는데 , G04116 을 제외하고 국내 계통 및 품

종의 유전적 거리는 0.00~0.18 의 범위로 근연의 특성을 나타 내었다 . Fig. 5 ^{는 유사도 계수} 0.96 ^{을 기준으로 품종 및 계통} 24 ^{개의 군집분석을 한 결과로서} , ^{그룹을 형성하지 않은} G04116, 연풍 , G04046 및 G04069 를 제외하고 20 개의 품종 및 계통은 4 그룹으로 분류되었다 . 그룹에는 천풍 , 고풍 및 9 계 통 (55%), 그룹에는 2 계통 (10%), 그룹에는 3 계통 (15%), 그

Fig. 4. Genetic polymorphisms by P26 (A) and P35 (B) primers among Korean ginseng cultivars and breeding lines. lane1, G04009; lane2, G04012; lane3, G04020; lane4, G04021; lane5, G04026; lane6, G04030; lane7, G04046; lane8, G04047;

lane9, G04049; lane10, G04065; lane11, G04069; lane12, G04076; lane13, G04084; lane14, G04085; lane15, G04086;

lane16, G04090; lane17, G04097; lane18, G04098; lane19, G04113; lane20, G04116; lane21, Chunpoong; lane22, Yunpoong; lane 23, Gopoong; lane24, Gumpoong; M, 100bp molecular weight marker (Promega).

Table 3.

Genetic diversity within Korean ginseng cultivars and breeding lines.

Locus N

H

I

P2 2.00 0.101 0.207

P4 1.80 0.073 0.153

P17 2.00 0.146 0.260

P21 1.82 0.091 0.179

P22 1.69 0.056 0.120

P25 1.83 0.067 0.144

P26 2.00 0.230 0.373

P34 2.00 0.289 0.446

P35 2.00 0.209 0.346

P55 2.00 0.153 0.287

P56 2.00 0.168 0.270

P57 1.67 0.237 0.378

P58 1.91 0.095 0.188

P60 1.67 0.053 0.116

Mean 1.878 0.1366 0.2413

St. Dev 0.329 0.1275 0.1773

†

N

= Observed number of alleles

‡

H = Nei's (1973) gene diversity

§

I = Shannon's Information index [Lewontin (1972)]

룹에는 금풍과 3 계통 (20%) 이 포함되었다 .

결론적으로 14 개의 EST-SSR 프라이머를 이용하여 인삼 계 통과 품종의 유연관계를 분석한 결과 , 유사도가 같은 G04009

와 G04047 의 2 계통을 제외한 22 개의 품종 및 계통을 구분할 수 있었으며 이중에서도 G04116, G04046, G04069 의 3 계통 및 연풍 품종은 확실하게 구분되는 결과를 보였다 (Fig. 5).

Table 4.

Matrix values of genetic similarity and genetic distance of Korean ginseng cultivars and breeding lines by EST-SSR analysis.

No.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

1 0.89

0.89 0.91 0.90 0.99 0.88 1.00 0.98 0.94 0.91 0.94 0.87 0.90 0.90 0.94 0.94 0.94 0.99 0.36 0.94 0.89 0.95 0.87 2 0.11

0.95 0.94 0.87 0.88 0.88 0.89 0.90 0.92 0.86 0.86 0.84 0.85 0.90 0.86 0.91 0.91 0.88 0.31 0.94 0.85 0.92 0.95 3 0.11 0.05 0.96 0.85 0.88 0.86 0.89 0.89 0.89 0.86 0.86 0.80 0.85 0.87 0.85 0.89 0.91 0.88 0.29 0.92 0.87 0.92 0.92 4 0.09 0.06 0.04 0.88 0.90 0.87 0.91 0.91 0.91 0.89 0.89 0.83 0.88 0.88 0.87 0.90 0.94 0.90 0.32 0.93 0.86 0.93 0.89 5 0.10 0.13 0.15 0.12 0.91 0.88 0.90 0.92 0.90 0.89 0.89 0.92 0.94 0.87 0.88 0.93 0.91 0.89 0.36 0.92 0.84 0.90 0.85 6 0.01 0.12 0.12 0.10 0.09 0.89 0.99 0.98 0.94 0.90 0.94 0.88 0.89 0.89 0.94 0.94 0.94 0.98 0.35 0.93 0.88 0.94 0.86 7 0.12 0.12 0.14 0.13 0.12 0.11 0.88 0.86 0.94 0.85 0.85 0.88 0.86 0.88 0.82 0.87 0.92 0.87 0.33 0.89 0.85 0.91 0.85 8 0.00 0.12 0.11 0.09 0.10 0.01 0.12 0.98 0.94 0.91 0.94 0.87 0.90 0.90 0.94 0.94 0.94 0.99 0.36 0.94 0.89 0.95 0.87 9 0.02 0.10 0.11 0.09 0.08 0.02 0.14 0.02 0.92 0.89 0.93 0.85 0.90 0.89 0.96 0.96 0.93 0.98 0.34 0.95 0.87 0.94 0.89 10 0.06 0.08 0.11 0.09 0.10 0.06 0.06 0.06 0.08 0.89 0.91 0.90 0.89 0.94 0.88 0.91 0.96 0.93 0.36 0.95 0.90 0.97 0.90 11 0.09 0.14 0.14 0.11 0.11 0.10 0.15 0.09 0.11 0.11 0.94 0.89 0.93 0.91 0.89 0.87 0.90 0.90 0.37 0.89 0.85 0.91 0.88 12 0.06 0.14 0.14 0.11 0.11 0.06 0.15 0.06 0.07 0.09 0.06 0.93 0.93 0.96 0.95 0.89 0.92 0.94 0.40 0.91 0.89 0.93 0.85 13 0.13 0.16 0.20 0.17 0.08 0.12 0.12 0.13 0.15 0.10 0.11 0.07 0.94 0.94 0.88 0.86 0.88 0.86 0.41 0.85 0.84 0.87 0.82 14 0.10 0.15 0.15 0.12 0.06 0.11 0.14 0.10 0.10 0.11 0.07 0.07 0.06 0.90 0.89 0.89 0.89 0.89 0.39 0.90 0.84 0.90 0.84 15 0.10 0.10 0.13 0.12 0.13 0.11 0.12 0.10 0.11 0.06 0.09 0.04 0.06 0.10 0.91 0.88 0.91 0.89 0.39 0.90 0.89 0.92 0.89 16 0.06 0.14 0.15 0.13 0.12 0.06 0.18 0.06 0.04 0.12 0.11 0.05 0.12 0.11 0.09 0.92 0.89 0.94 0.35 0.91 0.86 0.89 0.85 17 0.06 0.09 0.11 0.10 0.07 0.06 0.13 0.06 0.04 0.07 0.13 0.11 0.14 0.11 0.12 0.08 0.94 0.94 0.33 0.96 0.88 0.94 0.89 18 0.06 0.09 0.09 0.06 0.09 0.06 0.08 0.06 0.07 0.04 0.10 0.08 0.12 0.11 0.09 0.11 0.06 0.94 0.35 0.96 0.91 0.98 0.88 19 0.01 0.12 0.12 0.10 0.11 0.02 0.13 0.01 0.02 0.07 0.10 0.06 0.14 0.11 0.11 0.06 0.06 0.06 0.35 0.93 0.88 0.94 0.86 20 0.64 0.69 0.71 0.68 0.64 0.65 0.67 0.64 0.66 0.64 0.63 0.60 0.59 0.61 0.61 0.65 0.67 0.65 0.65 0.34 0.41 0.36 0.31 21 0.06 0.06 0.08 0.07 0.08 0.07 0.11 0.06 0.05 0.05 0.11 0.09 0.15 0.10 0.10 0.09 0.04 0.04 0.07 0.66 0.92 0.98 0.92 22 0.11 0.15 0.13 0.14 0.16 0.12 0.15 0.11 0.13 0.10 0.15 0.11 0.16 0.16 0.11 0.14 0.12 0.09 0.12 0.59 0.08 0.94 0.87 23 0.05 0.08 0.08 0.07 0.10 0.06 0.09 0.05 0.06 0.03 0.09 0.07 0.13 0.10 0.08 0.11 0.06 0.02 0.06 0.64 0.02 0.06 0.90 24 0.13 0.05 0.08 0.11 0.15 0.14 0.15 0.13 0.11 0.10 0.12 0.15 0.18 0.16 0.11 0.15 0.11 0.12 0.14 0.69 0.08 0.13 0.10

†

Nei's genetic identity (above diagonal).

Genetic distance (below diagonal).

The number is listed in Table 1.

Fig. 5. Dendrogram of genetic similarity among Korean ginseng cultivars and breeding linesconstructed 14 amplification primers. on the data obtained with

고려인삼 ( ^{P. ginseng} C. A. Mey) ^{은 유전적으로 유사도가}

매우 높아 다양성이 작은 약용작물로 알려져 왔으며 (Lim et al ., 1993; Yang et al ., 2001; Choi et al ., 2003; Kim and Choi, 2003; Bang et al ., 2011a) 본 실험의 연구결과도 이와 유사한 결과를 보였다 . 또한 아직까지는 기원이 다른 인삼 종 간 구분 및 품종 판별에 관한 연구가 일부 진행되었을 뿐 , ^인

삼 유전자원으로부터 육성된 계통에 대한 유전분석 결과는 전 무한 실정이다 . 따라서 국내외에서 다양한 유전자원을 확보하 고 , 이들 유전자원으로부터 유용한 형질을 지닌 유망 계통을 선발하여 내고온성 , 내염성 등의 환경적응성과 인삼 뿌리썩음 병 등 병해충에 강한 품종을 만들어 나가는 일은 매우 중요한 사안이 될 것이다 . 이를 위해서는 다양한 유전자원들에 대한 지속적인 유전분석과 더불어 찾고자 하는 유용 형질과 연관된 분자마커 선발 등의 과학적인 육종기반 기술을 개발하여 육종 의 효율을 증진시켜 나가는 것이 필요하리라 사료된다 .

LITERATURE CITED

Bang KH, Chung JW, Kim YC, Lee JW, Jo IH, Seo AY, Kim OT, Hyun DY, Kim DH and Cha SW. (2011a). Development of SSR markers for identification of Korean ginseng ( Panax ginseng C. A. Mey.) cultivars. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 19:185-190.

Bang KH, Jo IH, Chung JW, Kim YC, Lee JW, Seo AY, Park JH, Kim OT, Hyun DY, Kim DH and Cha SW. (2011b).

Analysis of genetic polymorphism of Korean ginseng cultivars and foreign accessions using SSR markers. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 19:347-353.

Bang KH, Lee JW, Kim YC, Kim DH, Lee EH and Jeung JU.

(2010). Construction of genomic DNA library of Korean ginseng ( Panax ginseng C. A. Meyer) and development of sequence-tagged sites. Biological and Pharmaceutical Bulletin.

33:1579-1588.

Botstein D, White RL, Skolnick M and Davis RW. (1980).

Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. American Journal of Human Genetics. 32:314-331.

Chao S, Sharp PJ, Worland AJ, Warham EJ, Koebner RMD and Gale MD. (1989). RFLP-based genetic maps of wheat homoeologous group-7 chromosomes. Theoretical and Applied Genetics. 78:495-504.

Choi JE, Seo SD, Yuk JA, Cha SK, Kim HH, Seong BJ and Kim SL. (2003). Analysis of diversity of Panax ginseng collected in Korea by RAPD technique. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 11:377-384.

Dan NV, Ramchiary N, Choi SR, Uhm TS, Yang TJ, Ahn IO and Lim YP. (2009). Development and characterization of new microsatellite markers in Panax ginseng C. A. Meyer from BAC end sequences. Conserved Genetics. 11:1223-1225.

Fushimi H, Komatsu K, Isobe M and Namba T. (1997).

Application of PCR-RFLP and MASA analyses on 18S ribosomal RNA gene sequence for the identification of three

Ginseng drugs. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 20:765- Ha WY, Shaw PC, Liu J, Yau FC and Wang J. (2002). 769.

Authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisatellite region DNA (DAMD). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50:1871-1875.

Hamada SR, Petrino MG and Kakunaga T. (1982). A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79:6465-6469.

In DS, Kim YC, Bang KH, Chung JW, Kim OT, Hyun DY, Cha SW, Kim TS and Seong NS. (2005). Genetic relationships of Panax species by RAPD and ISSR analyses.

Korean Journal of Medicinal Crop Science. 13:249-253.

Kim BB, Jeong JH, Jung SJ, Yun DW, Yoon ES and Choi YE.

(2005). Authentication of Korean Panax ginseng from Chinese Panax ginseng and Panax quinquefolius by AFLP analysis.

Journal of Plant Biotechnology. 7:81-86.

Kim CK and Choi HK. (2003). Genetic diversity and relationship in Korean ginseng ( Panax ginseng ) based on RAPD analysis.

Korean Journal of Genetics. 25:181-188.

Kim OT, Bang KH, In DS, Lee JW, Kim YC, Shin YS, Hyun DY, Lee SS, Cha SW and Seong NS. (2007). Molecular authentication of ginseng cultivars by comparison of internal transcribed spacer and 5.8S rDNA sequences. Plant Biotechnology Reports. 1:163-167.

Komatsu K, Zhu S, Fushimi H, Qui TK, Cai S and Kadota S.

(2001). Phylogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequence of Panax vietnamensis and five related species. Planta Medica. 67:461-465.

Lee JW. (2010). Development of DNA markers for identification of Korean ginseng cultivars ( Panax ginseng C. A. Meyer).

Doctoral Thesis. Dongguk University. Seoul, Korea. p. 20-81.

Lim W, Mudge KW and Weston LA. (2007). Utilization of RAPD markers to assess genetic diversity of wild populations of North American ginseng ( Panax quinquefolius ). Planta Medica. 73:71-76.

Lim YP, Shin CS, Lee SJ, Yoon YN and Jo JS. (1993). Survey of proper primers and genetic analysis of Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) variants using the RAPD technique. Journal of Ginseng Research. 17:153-158.

McCouch SR, Kochert G, Yu ZH, Wang ZH, Khush GS, Coffman WR and Tanksley SD. (1988). Molecular mapping of rice chromosomes. Theoretical and Applied Genetics.

76:815-819.

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G and Erlich H.

(1986). Specific enzymatic amplification of Dna in vitro : The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51:263-273.

Ngan F, Shaw P, But P and Wang J. (1999). Molecular authentication of Panax species. Phytochemistry. 50:787-791.

Ogbonnaya FC, Imtiaz M, Ye G, Hearnden PR, Hemandez E,

Eastwood RF, van Ginkel M, Shorter SC and Winchester

JM. (2008). Genetic and QTL analyses of seed dormancy and

preharvest sprouting resistance in the wheat germplasm

CN10955. Theoretical and Applied Genetics. 116:891-902.

Olsen M, Hood L, Cantor C and Botstein D. (1989). A common language for physical mapping of the human genome. Science.

245:1434-1435.

Paran I and Michelmore W. (1993). Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics. 85:985-993.

Rongwen J, Akkaya MS, Bhagwat AA, Lavi U and Cregan PB.

(1995). The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification. Theoretical and Applied Genetics.

90:43-48.

Rural Development Administration. (2009). Standard Cultivation Guidebook for Good Agricultural Practice. p. 47-117.

Shaw PC and But PP. (1995). Authentication of Panax species and their adulterants by random-primed polymerase chain reaction. Planta Medica. 61:466-469.

Shim YH, Choi JH, Park CD, Lim CJ, Cho JH and Kim HJ.

(2003). Molecular differentiation of Panax species by RAPD analysis. Archives of Pharmacal Research. 26:601-605.

Trautz D and Renz M. (1984). Simple sequence are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research. 12:4127-4138.

Um JY, Chung HS, Kim MS, Na HJ, Kwon HJ, Kim JJ, Lee KM, Lee SJ, Lim JP, Do KR, Hwang WJ, Lyu YS, An NH and Kim HM. (2001). Molecular authentication of Panax ginseng species by RAPD analysis and PCR-RFLP. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 24:872-875.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M and Zabeau M.

(1995). AFLP: a new techniques for DNA fingerprinting.

Nucleic Acids Research. 23:4407-4414.

Wen J and Zimmer EA. (1996). Phylogeny and biogeography of Panax L. (the ginseng genus, Araliaceae ): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution. 6:167-177.

Williams JGK, Kubebelik AR, Licak AJ, Ratalski JA and Tingey SV. (1990). DNA Polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research.

18:6531-6535.

Wu KS and Tanksley SD. (1993). Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Molecular and General Genetics. 241:225-235.

Yang CJ, Wang J, Mu LQ, Li SC, Liu GJ and Hu CQ. (2008).

Development of an EST-SSR marker in Panax ginseng . Chinese Journal of Agricultural Biotechnology. 5:175-181 Yang DC, Yang KJ and Yoon ES. (2001). Comparison of ITS

(internal transcribed spacer) and 5.8S rDNA sequences among varieties and cultivars in Panax ginseng . Journal of Photoscience.

8:55-60.

Yeh FC, Yang RC, Boyle TBJ, Ye ZH and Mao JX. (1997).

POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Center.

University of Alberta, Canada.