http://www.medicinalcrop.org http://dx.doi.org/10.7783/KJMCS.2013.21.6.444
분자지표를 이용한 고려인삼의 유전적 특성 비교
신미란*1·조익현*1·정종욱**·김영창*·이승호*·김장욱*·현동윤*·김동휘*·김기홍*
문지영***·노봉수****·강성택*****·이동진*****·방경환*†
*농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부, **농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터,
***국립농산물품질관리원 시험연구소, ****서울여자대학교 식품공학과, *****단국대학교 식량생명공학과
Comparative Genetic Characteristics of Korean Ginseng using DNA Markers
Mi Ran Shin*1, Ick Hyun Jo*1, Jong Wook Chung**, Young Chang Kim*, Seung Ho Lee*, Jang Uk Kim*, Dong Yun Hyun*, Dong Hwi Kim*, Kee Hong Kim*, Ji Young Moon***, Bong Soo Noh****,
Sung Taek Kang*****, Dong Jin Lee***** and Kyong Hwan Bang*†
*Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong 369-873, Korea.
**National Agrobiodiversity Center, NAAS, RDA, Suwon 441-707, Korea.
***Experiment Research Institute of National Agricultural Products Quality Management Service, MIFAFF, Seoul 150-043, Korea.
****Department of Food Science and Technology, Seoul Women’s University, Seoul 139-774, Korea.
*****Department of Crop Science and Biotechnology, Dankook University, Cheonan 330-714, Korea.
ABSTRACT : The development of random amplified polymorphic DNA (RAPD) and expressed sequence tag-derived simple sequence repeats (EST-SSRs) provided a useful tool for investigating Korean ginseng genetic diversity. In this study, 18 polymorphic markers (7 RAPD and 11 EST-SSR) selected to assess the genetic diversity in 31 ginseng accessions (11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines). In RAPD analysis, a total of 53 unique polymorphic bands were obtained from ginseng accessions and number of amplicons ranged from 4 to 11 with a mean of 7.5 bands. Pair-wise genetic similarity coefficient (Nei) among all pairs of ginseng accessions varied from 0.01 to 0.32, with a mean of 0.11. On the basis of the resulting data, the 31 ginseng accessions were grouped into six clusters. As a result of EST-SSR analysis, 11 EST-SSR mark- ers detected polymorphisms among the 31 ginseng accessions and revealed 49 alleles with a mean of 4.45 alleles per primer.
The polymorphism information content (PIC) value ranged from 0.06 to 0.31, with an average of 0.198. The 31 ginseng accessions were classified into five groups by cluster analysis based on Nei’s genetic distances. Consequently, the results of ginseng-specific RAPD and EST-SSR markers may prove useful for the evaluation of genetic diversity and discrimination of Korean ginseng cultivars and breeding lines.
Key Words : Korean Ginseng, Cultivar, Breeding Line, Genetic Characteristics, DNA Marker, RAPD, EST-SSR
서 언
현대사회는 고령화와 국민의 소득증가로 인하여 Wellbeing 과 healing에 대한 관심이 증가하고 있으며, 이에 따라 인삼 등 다양한 건강기능식품에 대한 수요도 함께 증가하고 있다.
국내 건강기능식품 시장의 규모는 14,091억 원으로 이 중 인 삼류를 이용한 제품군이 약 46%를 차지하고 있으며 (Ministry of Food and Drug Safety, 2013), 인삼은 국내 농산물 중 수 출액 1위를 차지하고 있는 우리나라를 대표하는 약용작물이다.
인삼 산업의 발전과 대내외 경쟁력 향상을 위해서는 생산적
†Corresponding author: (Phone) +82-43-871-5534 (E-mail) [email protected]
Received 2013 October 14/ 1st Revised 2013October 28 / 2nd Revised 2013 October 30 / 3rd Revised November 4 / Accepted 2013 Revised November 11
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1Shin MR and Jo IH contributed equally to this paper.
측면에서 고품질의 원료삼을 동종산업 경쟁국보다 한발 앞서 만들어내는 것이 중요한 사안이다. 최근에는 기후 온난화와 소 비자의 트렌드를 반영한 품종 육성이 화두로 등장하고 있어, 다수성, 내병성, 재해저항성 및 기능성 등을 육종 목표로 하는 품종 개발에 관한 연구가 진행되고 있다.
인삼을 포함한 모든 작물에서 우수한 품종을 만들기 위해서 는 육종의 소재가 되는 유전자원을 가능한 많이 확보하여, 형 태적인 특성과 분자생물학을 활용한 유전자원의 다양성 분석 등을 통해 목표로 하는 우수한 형질을 선발하는 것이 매우 중 요한 일이다.
한편, 인삼 육종은 1920년대 국내 인삼 재배 포장에서 열매 색, 줄기색에 따라 황숙종, 청경종, 등황숙종이 육종가에 의해 선발됨에 따라 시작되었다. 1970년대에는 고려인삼의 재배면 적이 증가하고, 수량이나 품질에 대한 관심이 높아지면서 품 종 육성의 필요성과 중요성이 한층 부각되기 시작하였다. 2000 년대부터는 체계적인 인삼 유전자원 수집, 특성평가와 기후변 화 및 재해에 대응하기 위한 품종 육성의 중요성이 강조되기 시작하여 이와 관련된 연구들이 진행되고 있다.
인삼의 육종은 주로 순계분리법이 이용되어 왔는데, 농가에 서 재배되고 있는 우량 개체를 선발하여 이들을 계통 육성과 생산력 검정 시험을 거쳐 지상부 생육이 양호하고 뿌리 발달 이 우수한 계통을 다시 선발하여 지역적응시험에 공시하고 있다. 이러한 방식으로 육성된 계통은 수량성, 내병성, 기능성 등의 특성 검정을 통하여 품종 출원 및 등록과정을 거쳐 농가 에 보급되고 있다 (Kwon et al., 1991; 2000; 2001; 2003).
국내 인삼 품종은 2002년에 최초로 천풍과 연풍이 등록되 었으며, 그 후 고풍, 금풍, 선풍 등의 품종들이 잇달아 등록되 기 시작 하였다. 한편, 현재까지 우리나라에서 개발된 인삼 품 종은 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선, K-1, 천량의 11품종으로, 이들 품종 중에 현재 국내 인삼 농 가에서 주로 재배되고 있는 것은 천풍, 연풍 및 금풍의 3 품 종이다 (Bang et al., 2011).
1980년대에 다양한 유전분석을 위해 수행된 분자마커 개발 에 관한 연구는 기존에 사용되어왔던 형태적인 특성과 단백질 마커 활용에 비교하여 많은 장점을 지니고 있다. 그 장점은 활용할 수 있는 마커의 수가 제한적이지 않고, 다양한 토양과 재배조건 등 환경에 영향을 받지 않는다는 것이다.
분자마커 중에 가장 먼저 고안된 방법으로 알려진 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)는 인삼에서 고 려인삼의 변종과 품종별 차이 구명 (Yang and Kim, 2003), 국내 인삼 수집종의 유전적 다양성 (Seo et al., 2003) 등의 연구에 활용 되어져 왔다.
한편, 분자마커는 Mullis 등 (1986)에 의해 고안된 중합효소 연쇄반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)이 개발됨에 따 라 빠른 속도로 발달하였는데, 이 방법은 적은 노력과 비용으
로 다량의 샘플을 신속하고, 간단하게 분석할 수 있는 장점이 있다 (Williams et al., 1990). RAPD 분석 방법을 활용한 인 삼 연구는 미국삼을 대상으로 하여 수행된 유전적 다양성 분 석 (Bai et al., 1997; Lim et al., 2007), 고려인삼, 미국삼 등의 인삼종 간의 판별 (Boehm et al., 1999; Cui et al., 2003; Shim et al., 2003), 국내 재래종 간의 유연관계 분석 (Seo et al., 2003) 등이 수행 한 바 있다. 또한 공우성 마커 로써 재현성이 뛰어난 장점을 지니고 있는 SSR 분석방법은 고려인삼의 주요 품종 판별, 국내외 인삼 수집종의 유전적 다 양성을 분석 등에 활용되었으며 (Bang et al., 2011; Harmada et al., 1982; Tautz and Renz, 1984), SRAP (Sequence-related amplified polymorphism) 분석을 이용하여 중국에서 재배되고 있는 중국삼에 대한 유전적 다양성 연구도 진행되었다 (Xu et al., 2010).
인삼에서의 분자마커 개발에 관한 연구는 주로 ITS, RAPD, SSR 등이 기법들이 적용되었으며, 주로 종 수준에서의 유전적 차이를 밝히거나 국내에서 개발된 일부 품종들을 구분하기 위 한 연구가 진행되었을 뿐, 우리나라에 품종으로 출원 또는 등 록된 전체 품종들과 품종 육성단계에 있는 유망계통을 대상으 로 이들의 유전적 다양성 등을 분석한 연구는 진행된 바 없다.
따라서 본 연구는 RAPD (Random amplified polymorphic DNA), EST-SSR (Expressed sequence tag-Simple sequence Repeat)의 분자마커를 이용하여 국내에서 육성된 고려인삼 품 종과 유망계통을 대상으로 이들의 유전적 다양성 분석과 판별 가능성을 검토하여 인삼 육종에 활용하기 위한 기초자료를 얻 고자 수행하였다.
재료 및 방법
1. 시험재료
본 연구에서 사용한 재료는 충청북도 음성군 소재 농촌진흥 청 국립원예특작과학원 인삼특작부 시험연구 포장에서 재배중 인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1, 천량 등 11품종과 G08010 등 20계통을 대상으로 하였으 며, 인삼의 연근 (年根)은 4년생을 기준으로 하였다 (Table 1).
인삼 육성 계통은 2004년에 여주를 비롯한 인삼 재배 지역에 서 선발하여, 4년을 한 세대로 하여 3세대를 진전시켰으며, 인 삼 재배, 병해충 방제 및 기타 관리는 인삼 GAP 표준재배지 침서에 준하였다 (Rural Development Administration, 2009).
2. DNA 추출 및 정량
인삼 식물체로부터 genomic DNA를 확보하기 위하여 4년 생 잎을 채취하여 세척한 후 암실냉장 조건에서 하루 동안 보 관하였다. 이후 액체질소로 급랭시켜 막자사발과 유봉을 이용 하여 고운 분말 상태가 되도록 마쇄한 후, 분말 상태의 시료
를 2 ㎖ 튜브에 10 ㎎ 넣고, 68℃로 미리 가열된 extraction buffer type-Ⅰ용액 300 ㎕ (50 mM Tris, 25 mM EDTA 및 0.35 M sorbitol), 5% sarcosyl 용액 50 ㎕, 5M NaCl 용액 60㎕ 및 CTAB (8.6%) 35 ㎕ 를 넣어, 68℃ 조건의 항온 수 조에 30분 동안 처리하면서 시료가 뭉치지 않도록 5분 간격 으로 흔들어 주었다.
다음 과정은 PIC (phenol 25: chloroform 24: isoamylalchohol 1)용액을 600 ㎕ 첨가하여 시료가 잘 섞이도록 1분 이상 흔들 어준 후, 10℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하 였고, PIC를 통해 분리된 상층액 450 ~ 500 ㎕ 를 새 튜브에 옮긴 후, 3 M NaOAC (pH 5.2) 50 ㎕, Isopropyl alcohol 600㎕를 각각 넣어 하얀 펠릿이 생성 될 때까지 흔들어준 뒤
−70℃의 초저온 냉장고에 20분간 방치하여 펠릿을 응축시켰다.
응축된 펠릿을 확보하기 위하여 10℃에서 12,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리 하여 펠릿을 제외한 나머지 용액을 버린 후, 에탄올 (70%) 600 ㎕를 넣어 1분 이상 흔들어 주었으며, 10℃에서 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 에탄올을 버린 후 실온에서 펠릿을 건조하였다. 완전히 건조된 펠릿은 0.5× TBE 버퍼를 100 ㎕ 넣어 실온에서 잘 녹여주었다. 이러 한 과정을 거쳐 추출된 DNA는 Nano Drop (Thermo Fisher Scientific, USA) 기기를 이용하여 농도를 측정하였으며, 농도 측정이 완료된 각각의 DNA 샘플들은 멸균된 증류수를 이용 하여 최종 DNA 농도를 5 ng/㎕ 로 각각 정량하였다.
3. RAPD 마커를 이용한 분석
인삼 품종과 육성 계통의 유전적 다양성을 확인하기 위 하여, Kang 등 (2002)이 보고한 URP 프라이머를 이용하여 RAPD 분석을 수행하였다 (Table 2). 12종의 URP 프라이머 들은 한국 재래적미로부터 분리된 1,189 bp 크기의 반복염기 서열 DNA에서 유래된 것으로, 벼의 염색체 상에 다양하게 분 포하는 것이 특징인 프라이머로 알려져 있다 (Kang and Kang, 2008).
DNA 증폭기기는 Tprofessional thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)을 이용하였고, PCR에 사용한 혼합용액 의 조성은 10 ng의 DNA를 1 ㎕, 100 ng의 프라이머를 2 ㎕, Excel TB 2× Premix with Dye (Inclone, Korea)를 12.5 ㎕ 넣고 멸균수로 전체 반응용액을 25 ㎕로 맞춰 주었다. PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 초기변성 후, 94℃에서 40초 동안 변성, 42 ~ 50℃에서 40초 동안 결합 및 72℃에서 2분 동안 신장의 조건으로 총 40 cycles을 수행하였고, 마지막으로 72℃
에서 10분간 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.5× TBE buffer를 이용하여 2% agarose gel에 loading한 후 180 volt로 전기영동 하였으며, EtBr (Ethidium bromide)로 Table 1. Information of 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding
lines used in this study.
No. Name Breeding lines or cultivars
Classification of stem or berry color 1 Chunpoong
Cultivar
Jakyung
2 Yunpoong Jakyung
3 Gopoong Jakyung
4 Kumpoong Hwangsook
5 Sunpoong Jakyung
6 Sunun Jakyung
7 Sunone Jakyung
8 Cheongsun Cheongkyung
9 Sunhyang Hwangsook
10 Cheonryang Jakyung
11 K-1 Jakyung
12 G03146
Breeding lines
Jakyung
13 G04062 Jakyung
14 G04075 Jakyung
15 G04110 Jakyung
16 G08012 Hwangsook
17 G04058 Jakyung
18 G04068 Jakyung
19 G04079 Jakyung
20 G08010 Hwangsook
21 G08020 Cheongkyung
22 G08089 Jakyung
23 G08078 Hwangsook
24 G08042 Jakyung
25 G08038 Jakyung
26 G08034 Jakyung
27 G08085 Jakyung
28 G08055 Jakyung
29 G08039 Jakyung
30 G08036 Jakyung
31 G08031 Jakyung
Table 2. List of primer used in RAPD analysis.
Primer Sequence( 5'→3') Annealing temp. (℃) URP1 ATC CAA GGT CCG AGA CAA CC 48 URP2 GTG TGC CAT CAG TTG CTG GG 46 URP3 CCC AGC AAC TGA TCG CAC AC 48 URP4 AGG ACT CGA TAA CAG GCT CC 46 URP5 GGC AAG CTG GTG GGA GGT AC 50 URP6 ATG TGT GCG ATC AGT TGC TG 48 URP7 TAC ATC GCA AGT TAC ACA GG 50 URP8 AAT GTG GGC AAG CTG GTG GT 44 URP9 GAT GTG TTC TTG GAG CCT GT 50 URP10 GGA CAA GAA GAG GAT GTG GA 42 URP11 TAC ACG TCT CGA TCT ACA GG 50 URP12 AAG AGG CAY YCY ACC ACC AC 48
염색하여 UV transilluminator로 유전양상을 확인하였다.
4. EST-SSR 마커를 이용한 분석
EST-SSR 분석은 Yang 등 (2008)이 발표한 논문에서 polymorphism이 높은 30쌍의 프라이머를 선정하여 인삼 품종 및 육성 계통을 대상으로 유전분석을 수행하였다 (Table 3).
PCR에 사용한 혼합용액의 조성은 5 ng의 DNA를 2 ㎕, 20 pmoles의 forward와 reverse 프라이머를 각각 1 ㎕, Excel TB 2× Premix with Dye (Inclone, Korea)를 12.5 ㎕를 넣고 멸균수로 전체 반응용액을 25 ㎕ 로 맞춰 주었다.
DNA 증폭기기는 Tprofessional thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)을 이용하였고, PCR 반응은 95℃에서 5 분 동안 초기변성 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 55 ~ 62℃에 서 30초 동안 결합 및 72℃에서 1분 동안 신장의 조건으로 총 35 cycles을 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 신
장 반응을 수행하였다.
증폭된 PCR 산물은 5% polyacrylamide gel에 loading한 후 280 volt로 전기영동 하였으며, EtBr (Ethidium bromide) 로 염색하여 UV transilluminator로 DNA 단편의 유전양상을 확인하였다.
5. 통계처리를 통한 유연관계 분석
RAPD와 EST-SSR 프라이머에 의해 증폭된 PCR 산물의 분석은 DNA 단편이 있는 것을 “1” 없는 것을 “0” 으로 하여 data matrix를 작성하였으며, 유전적 다양성과 유전적 거 리를 산출하기 위하여 POPGENE software (version1. 31) (Yeh et al., 1997)를 이용하여 분석하였다. 또한 UPGMA (Unweighed pair group method using arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하여 유연관계를 비교 분석하 였다.
Table 3. List of primer used in EST-SSR analysis.
Primer Code Repeat motif Primer sequences Position Annealing temp. (℃)
P2 (TA)10 ACTACCGGACTCAAGCCTCA ACGGCCATCATTAATCCAAA 5'UTR 56
P3 (TA)10 GAAGACCCGGATAGATGCAA AAGCACCACACAGGTGACAG 3'UTR 55
P4 (TA)10 ACTGCCGTTATAGGTGCTGC ACGGCCATCATTAATCCAAA 3'UTR 56
P17 (TA)7 AGCAAGCTTCTCATTCTGTGG ATGCACCTGACTCCGTAGGCT 5'UTR 55
P20 (AT)56 GGCCGGGTTAGAGATGAACT CATATATATACACCCGCCCA CDS 55
P21 (CA)18 (AT)22 TTCCTTTCTCCCTCCCTCTC GATGATGGTGTGACGACGAC CDS 55
P22 (AC)8 AGTGCCAGAGAAGCAACCAT ATGTTCACCACACCACTGGA 5'UTR 55
P25 (AAT) ATTGAGGCATCAGGATCAGG CGACTAACCTTGTACCCGGA CDS 55
P26 (GAT)11 (CAG)5 GGGCAAATCAAATAAAGGAG GAGTGATTGCAGAGCAGGGT CDS 56 P27 (AAG)5 (CAG)4 TAGTAGCGACGATCACCACG AATTAATGCTCCGGTCTCCCT CDS 55 P29 (AGC)10 CAACGTGCCTTGTGTTGGTA CGTCCTCTTGCTCTTTCCAC 5'UTR 55
P30 (AGC)7 AGGGATGCTAGTGCGTCAAT CCATGGGTATGGGTGTCACT CDS 55
P32 (CAG)6 AGGATGACCCACACAAGAGG TTTGGGCTATTAGGAATCCA 3'UTR 55
P34 (ATC)8 CGCACAGTGAGGAAGAAGAA CCATAATCTCCGCTTGTGGT 5'UTR 55
P35 (GCT)9 AAAGCAGGGTGTGCTCACTT AGGGAGACCGGAGCATTATT 5'UTR 60
P36 (TAA)5 AAAGCAGGGTGTGCTCACTT AAGGACAAGAAGAAGCACGG 5'UTR 50
P39 (TGA)8 ACAACTGCCAACCATGTTCA GCACAAGGTTGTCATCTCCC 5'UTR 55
P40 (TTA)9 GTCTCATGCAAACGAGCCTT GAATTGGCCAAGTGAGCTTC 3'UTR 55
P42 (ATC)8 CGCACAGTGAGGAAGAAGAA CGTTCTTAGCCTTGATTGCC CDS 62
P46 (CGA)6 TGCGCAGATACCTACTCGTG TCCACGGTCTCAAATCCTTC CDS 55
P47 (CTA)10 CATGGATCACCACCACAAGA CGTAATCTCTTCCGCGTTTG CDS 56
P55 (AAG)52 TACCTAATTGCCAGCGGTTC TGGGAAGTTGGAGAGGATTG 5'UTR 56 P56 (CTT)9 TTCTGATCGAATTCTACACCTG AGTTCCTGCACTCGCTTGAT 5'UTR 62 P57 (AGA)9 CTAGGCCTACCCTCGGTATCT CAGGGCTATTGCGCTCCTTG 5'UTR 56
P58 (TTC)6 AGAATCTGCTGTATTCGCCG AATAACGGGATCGGTAAGGC CDS 58
P60 (CTC) TGAACCTCACCTTCCTAACCTC CAATAGCAGCCACATCATGG CDS 55
P61 (TGC) AGAAGTTGGGCAGCAATAGG GAAACGATTCACCGTAGGGA CDS 55
P63 (AT)10 (AT)9 (TGC)7 (TA)9 TCTGAGAACGATGGCAAGTG CCACAACAACACGTACACCC 3'UTR 55 P64 (TATG)6 GGTTAGCCATGCAAAGGAGA TTAAAGTTGTGTGGGCCGAG 5'UTR 55
P68 (TCAA)5 CTGTCTGTCTCCCTAGGCTTG TAGACGAGAATGGACCTCGG CDS 55
결과 및 고찰
1. RAPD 마커를 이용한 분석
인삼 11품종 및 육성 계통 20종을 대상으로 12종의 URP 프라이머를 사용하여 유전분석을 수행한 결과, 품종과 계통 간 에 다형성을 나타내는 7종의 프라이머 (URP1, URP2, URP5, URP7, URP9, URP10, URP12)를 선발하였다. 증폭된 DNA 단편의 수는 53개이었고, 증폭된 DNA 단편의 크기 범위 는 300 ~ 3,000 bp 이었다. 선발된 각각의 프라이머들에 의해 증폭된 DNA 단편의 수는 최소 4개에서 최대 11개로 다 양하였으며 프라이머 한 개당 평균 7.5개의 DNA 단편이
증폭되었다 (Table 4).
URP1과 URP9 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 인삼 11품종과 20계통 등 총 31개의 샘플이 두 유형의 유전 양상으로 나타냈다. URP2 프라이머를 이용하여 유전분석을 한 결과, 네 타입의 유전양상이 관찰되었으며 K-1 품종에서만 특이적인 DNA 단편이 확인되었다. 또한 URP9 프라이머를 이용하여 PCR을 하였을 때에도 K-1 품종에서만 특이적인 DNA 단편이 확인 되었다 (Fig. 1).
URP7과 URP12 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 각각 10개와 11개의 유전양상을 확인 할 수 있었는데, 이들 프라이머는 본 실험의 인삼 품종 및 육성 계통들의 유전적 다 양성 및 유연관계 분석에 중요한 요소로 작용한 것으로 생각 된다. 한편, URP10 프라이머를 이용한 유전분석 결과, 약 1,000 bp에서 선향 품종에서만 DNA 단편이 나타나지 않는 것 을 확인 할 수 있었다 (Fig. 1).
표 5는 프라이머 별 유전적 다양성을 조사한 결과로써, Nei 의 유전적 다양성은 전체 평균이 0.11으로 나타났으며, URP7 이 0.32로 가장 높았고 URPP10이 0.01로 가장 낮은 값을 나 타냈다. 한편 Shannon's Index 값도 Nei의 유전적 다양성 값 과 비교하여 수치간의 차이는 있었으나 동일한 경향을 나타냈 는데, 전체 평균이 0.17으로 나타났으며, URP7이 0.46으로 가 장 높았고, URP10이 0.20으로 가장 낮은 값을 나타내었다.
표 6은 고려인삼 11 품종 및 육성 계통 20 계통간의 유전 적 거리를 Nei의 공식에 따라 구한 것으로 이들 간의 유전적 거리는 0 ~ 0.36 범위로 분포하였다. 천량과 청선은 유전적인 거리가 가장 가까운 것으로 나타났고, 선풍은 G04062 및 G04075 계통과 유전적 거리가 가장 먼 것으로 나타났다.
천풍을 포함한 고려인삼 11 품종과 G03146을 포함한 육성 계통 20 계통을 대상으로 군집분석을 수행한 결과, 그룹을 형 성하지 않은 K-1과 G04075를 제외하고 29개의 품종 및 육성 계통은 6 그룹으로 분류되었다. Ⅰ 그룹에는 천풍 등 7 개의 품종 (24%), Ⅱ 그룹에는 고풍 등 3 품종 (10%), Ⅲ 그룹에 Table 4. RAPD primers amplifying polymorphic bands among 11
Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines.
Primers Size(bp) Number of band
Polymorphic (%) Monomorphic (%) Total URP1 400 ~ 3,000 1(14.2) 6(85.8) 7 URP2 400 ~ 3,000 3(33.3) 6(66.7) 9 URP5 300 ~ 3,000 1(25.0) 3(75.0) 4 URP7 500 ~ 3,000 10(90.9) 1(9.9) 11 URP9 500 ~ 3,000 3(50.0) 3(50.0) 6 URP10 600 ~ 2,000 1(16.6) 5(83.4) 6 URP12 800 ~ 3,000 6(60.0) 4(40.0) 10 TOTAL 300 ~ 3,000 25(47.1) 28(52.9) 53
Fig. 1. Genetic polymorphisms by URP1(A), URP2(B), URP5(C) URP7(D), URP9(E), URP10(F) and URP12(G) primers among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines. Lanes 1-31; cultivars and breeding lines in Table 1.
White arrows indicate examples of polymorphic bands.
Table 5. Genetic diversity within 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines.
Markers h† I‡
URP1 0.07 0.10
URP2 0.04 0.08
URP5 0.11 0.16
URP7 0.32 0.48
URP9 0.04 0.09
URP10 0.01 0.02
URP12 0.18 0.29
Mean 0.111 0.173
†h = Nei’s (1973) gene diversity.
‡I = Shannon’s Information index (Lewontin, 1972).
Table 6. Matrix values of genetic similarity and genetic distance of 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines by RAPD analysis. NO.§2 2345678910111213141516171819202122232425262728293031 10. 92† 0.91 0.98 0.87 0.98 0.96 0.98 0.89 0.98 0.89 0.89 0.83 0.79 0.83 0.79 0.79 0.85 0.79 0.87 0.85 0.89 0.89 0.89 0.85 0.87 0.83 0.83 0.89 0.85 0.81 20.08‡ 0.87 0.94 0.91 0.94 0.96 0.94 0.85 0.94 0.89 0.85 0.75 0.79 0.79 0.79 0.83 0.77 0.83 0.83 0.81 0.85 0.85 0.85 0.81 0.83 0.83 0.83 0.85 0.85 0.81 30.10 0.140.92 0.92 0.89 0.87 0.89 0.94 0.89 0.83 0.83 0.77 0.74 0.77 0.77 0.77 0.79 0.74 0.81 0.79 0.79 0.83 0.83 0.79 0.81 0.81 0.85 0.79 0.79 0.83 40.02 0.06 0.08 0.89 0.96 0.94 0.96 0.87 0.96 0.91 0.87 0.81 0.77 0.81 0.81 0.77 0.83 0.77 0.85 0.83 0.87 0.87 0.87 0.83 0.85 0.85 0.81 0.87 0.83 0.79 50.14 0.10 0.08 0.12 0.89 0.91 0.89 0.91 0.89 0.83 0.83 0.70 0.70 0.77 0.74 0.77 0.72 0.77 0.77 0.75 0.79 0.79 0.79 0.75 0.77 0.81 0.81 0.79 0.75 0.79 60.02 0.06 0.12 0.04 0.12 0.98 0.96 0.87 0.96 0.87 0.87 0.81 0.77 0.81 0.77 0.81 0.83 0.81 0.85 0.83 0.87 0.87 0.87 0.83 0.85 0.81 0.81 0.87 0.83 0.79 70.04 0.04 0.14 0.06 0.10 0.02 0.98 0.89 0.98 0.89 0.89 0.79 0.79 0.83 0.79 0.83 0.81 0.83 0.87 0.85 0.89 0.89 0.89 0.85 0.87 0.83 0.83 0.89 0.85 0.81 80.02 0.06 0.12 0.04 0.12 0.04 0.02 0.91 1.00 0.91 0.91 0.81 0.81 0.85 0.81 0.81 0.83 0.81 0.89 0.87 0.91 0.91 0.91 0.87 0.89 0.85 0.85 0.91 0.87 0.83 90.12 0.16 0.06 0.14 0.10 0.14 0.12 0.10 0.91 0.81 0.85 0.75 0.75 0.79 0.75 0.79 0.77 0.75 0.83 0.81 0.81 0.85 0.85 0.81 0.83 0.79 0.87 0.81 0.81 0.85 100.02 0.06 0.12 0.04 0.12 0.04 0.02 0.00 0.10 0.91 0.91 0.81 0.81 0.85 0.81 0.81 0.83 0.81 0.89 0.87 0.91 0.91 0.91 0.87 0.89 0.85 0.85 0.91 0.87 0.83 110.12 0.12 0.19 0.10 0.19 0.14 0.12 0.10 0.21 0.10 0.81 0.72 0.72 0.75 0.75 0.75 0.74 0.72 0.79 0.77 0.81 0.81 0.81 0.77 0.79 0.79 0.75 0.81 0.77 0.74 120.12 0.16 0.19 0.14 0.19 0.14 0.12 0.10 0.16 0.10 0.21 0.87 0.87 0.94 0.83 0.83 0.89 0.83 0.91 0.89 0.92 0.92 0.92 0.92 0.91 0.87 0.91 0.92 0.89 0.89 130.19 0.28 0.26 0.21 0.36 0.21 0.23 0.21 0.28 0.21 0.33 0.14 0.89 0.89 0.85 0.81 0.94 0.85 0.89 0.87 0.83 0.87 0.87 0.91 0.89 0.81 0.81 0.83 0.87 0.83 140.23 0.23 0.31 0.26 0.36 0.26 0.23 0.21 0.28 0.21 0.33 0.14 0.12 0.89 0.89 0.89 0.87 0.89 0.89 0.91 0.87 0.91 0.91 0.94 0.89 0.85 0.89 0.91 0.94 0.91 150.19 0.23 0.26 0.21 0.26 0.21 0.19 0.16 0.23 0.16 0.28 0.06 0.12 0.12 0.89 0.85 0.91 0.89 0.92 0.91 0.91 0.91 0.91 0.94 0.92 0.85 0.89 0.91 0.91 0.91 160.23 0.23 0.26 0.21 0.31 0.26 0.23 0.21 0.28 0.21 0.28 0.19 0.16 0.12 0.12 0.81 0.87 0.85 0.92 0.94 0.87 0.87 0.87 0.91 0.89 0.89 0.81 0.87 0.87 0.83 170.23 0.19 0.26 0.26 0.26 0.21 0.19 0.21 0.23 0.21 0.28 0.19 0.21 0.12 0.16 0.21 0.83 0.92 0.85 0.87 0.87 0.91 0.91 0.91 0.89 0.85 0.92 0.87 0.94 0.94 180.16 0.26 0.23 0.19 0.33 0.19 0.21 0.19 0.26 0.19 0.31 0.12 0.06 0.14 0.10 0.14 0.19 0.87 0.94 0.89 0.89 0.92 0.92 0.92 0.94 0.87 0.87 0.89 0.89 0.85 190.23 0.19 0.31 0.26 0.26 0.21 0.19 0.21 0.28 0.21 0.33 0.19 0.16 0.12 0.12 0.16 0.08 0.14 0.89 0.87 0.87 0.91 0.91 0.91 0.92 0.89 0.89 0.87 0.94 0.91 200.14 0.19 0.21 0.16 0.26 0.16 0.14 0.12 0.19 0.12 0.23 0.10 0.12 0.12 0.08 0.08 0.16 0.06 0.12 0.94 0.91 0.94 0.94 0.94 0.96 0.89 0.89 0.91 0.91 0.87 210.16 0.21 0.23 0.19 0.28 0.19 0.16 0.14 0.21 0.14 0.26 0.12 0.14 0.10 0.10 0.06 0.14 0.12 0.14 0.06 0.92 0.92 0.92 0.96 0.91 0.91 0.87 0.89 0.92 0.89 220.12 0.16 0.23 0.14 0.23 0.14 0.12 0.10 0.21 0.10 0.21 0.08 0.19 0.14 0.10 0.14 0.14 0.12 0.14 0.10 0.08 0.96 0.96 0.92 0.94 0.94 0.91 0.96 0.92 0.89 230.12 0.16 0.19 0.14 0.23 0.14 0.12 0.10 0.16 0.10 0.21 0.08 0.14 0.10 0.10 0.14 0.10 0.08 0.10 0.06 0.08 0.04 1.00 0.96 0.98 0.94 0.94 0.96 0.96 0.92 240.12 0.16 0.19 0.14 0.23 0.14 0.12 0.10 0.16 0.10 0.21 0.08 0.14 0.10 0.10 0.14 0.10 0.08 0.10 0.06 0.08 0.04 0.00 0.96 0.98 0.94 0.94 0.96 0.96 0.92 250.16 0.21 0.23 0.19 0.28 0.19 0.16 0.14 0.21 0.14 0.26 0.08 0.10 0.06 0.06 0.10 0.10 0.08 0.10 0.06 0.04 0.08 0.04 0.04 0.94 0.91 0.91 0.92 0.96 0.92 260.14 0.19 0.21 0.16 0.26 0.16 0.14 0.12 0.19 0.12 0.23 0.10 0.12 0.12 0.08 0.12 0.12 0.06 0.08 0.04 0.10 0.06 0.02 0.02 0.06 0.92 0.92 0.94 0.94 0.91 270.19 0.19 0.21 0.16 0.21 0.21 0.19 0.16 0.23 0.16 0.23 0.14 0.21 0.16 0.16 0.12 0.16 0.14 0.12 0.12 0.10 0.06 0.06 0.06 0.10 0.08 0.89 0.91 0.91 0.87 280.19 0.19 0.16 0.21 0.21 0.21 0.19 0.16 0.14 0.16 0.28 0.10 0.21 0.12 0.12 0.21 0.08 0.14 0.12 0.12 0.14 0.10 0.06 0.06 0.10 0.08 0.12 0.91 0.94 0.98 290.12 0.16 0.23 0.14 0.23 0.14 0.12 0.10 0.21 0.10 0.21 0.08 0.19 0.10 0.10 0.14 0.14 0.12 0.14 0.10 0.12 0.04 0.04 0.04 0.08 0.06 0.10 0.10 0.92 0.89 300.16 0.16 0.23 0.19 0.28 0.19 0.16 0.14 0.21 0.14 0.26 0.12 0.14 0.06 0.10 0.14 0.06 0.12 0.06 0.10 0.08 0.08 0.04 0.04 0.04 0.06 0.10 0.06 0.08 0.96 310.21 0.21 0.19 0.23 0.23 0.23 0.21 0.19 0.16 0.19 0.31 0.12 0.19 0.10 0.10 0.19 0.06 0.16 0.10 0.14 0.12 0.12 0.08 0.08 0.08 0.10 0.14 0.02 0.12 0.04 † Nei’s genetic identity (above diagonal). ‡Genetic distance (below diagonal). §The number is listed in Table 1.
는 G03146 등 2 계통 (7%), Ⅳ 그룹에는 G08012 등 10 계통 (35%), Ⅴ 그룹에는 G04075 등 5 계통 (17%), Ⅵ 그 룹에는 G04062 등 2 계통 (7%)이 포함되었다.
7개의 URP 프라이머를 이용하여 인삼 계통과 품종의 유연 관계를 종합하여 보면, 유사도가 같은 청선 등 2 품종과 G08078 등 2 계통을 제외한 인삼 품종 및 계통은 27개로 구 분할 수 있었으며 이 중에서도 K-1와 G04075은 확실하게 구 분되는 결과를 보였다 (Fig. 2).
RAPD 분석방법은 다른 DNA 기법에 비해 재현성이 상대 적으로 낮은 문제가 있으나, 분석이 간단하고 짧은 시간에 대 량분석이 가능하다는 점에서 밀 (Devos and Gale, 1992)과 오 이 (Bernet et al., 2003) 등의 다른 작물에서도 많이 이용되고 있다. 인삼에서는 국내 수집종 인삼을 대상으로 유전적인 다양 성을 확인하였으며 (Seo et al., 2003; Rhim et al., 2010), 미국삼 (P. quinquefolius)을 대상으로도 유전적인 다양성이 확 인된바 있다 (Bai et al., 1997). 본 실험을 통하여 선발된 프 라이머들 (URP2, URP9, URP10)에 의해 생성된 품종 특이적 인 DNA 단편들은, 향후 유전자 클로닝 방법을 통하여 SCAR 마커로 전환한다면 좀 더 재현성 있는 DNA 마커로 활용될 수 있으리라 판단된다 (Bang et al., 2004; Lee et al., 2011).
2. EST-SSR 마커를 이용한 분석
현재 활용되고 있는 분자마커 중 반복염기서열 부위를 대상
으로 하고 있는 SSR 마커는 마커 개발에 드는 비용과 노력이 높은 단점이 있지만, 다른 분자마커 기법들에 비하여 유전적 다형성이 높은 장점을 갖고 있어서 다양한 동식물의 유전분석 에 많이 활용되고 있다.
본 실험에서는 인삼 품종 및 계통 간 유전분석을 수행하기 위하여 Yang 등 (2008)이 발표한 논문으로부터 제작한 30개 의 EST-SSR 프라이머를 활용하였는데, 그 결과 다형성을 나 타내는 11개의 프라이머를 선발 하였다. Kim 등 (2012)은 천 풍 등 9품종을 대상으로 EST-SSR 분석을 수행하여 품종 판 별의 가능성을 제시 하였으나, 본 실험에서 사용된 인삼 11품 종 및 육성 계통 등을 대상으로 이들의 유전적인 특성을 분석 한 결과는 없는 실정이다.
Fig. 2. Dendrogram of genetic similarity among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines constructed on the data obtained with seven RAPD primers.
Table 7. EST-SSR primers amplifying polymorphic bands among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines and their marker information.
Primers Size(bp) Number of band
Polymorphic(%) Monomorphic(%) Total P2 200 ~ 300 2(50.0) 2(50.0) 4 P4 150 ~ 400 2(50.0) 2(50.0) 4 P26 150 ~ 220 5(100.0) 0(0.0) 5 P35 150 ~ 350 7(100.0) 0(0.0) 7 P36 450 ~ 800 5(100.0) 0(0.0) 5 P42 200 ~ 220 2(100.0) 0(0.0) 2 P47 400 ~ 1,500 6(85.7) 1(14.3) 7 P55 260 ~ 270 2(100.0) 0(0.0) 2 P56 380 ~ 700 4(80.0) 1(20.0) 5 P57 380 ~ 700 6(100.0) 0(0.0) 6 P58 150 ~ 250 2(100.0) 0(0.0) 2 TOTAL 150 ~ 1,500 43(87.7) 6(12.3) 49
Table 8. Genetic diversity within 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines.
Markers h† I‡
SSR02 0.23 0.33
SSR04 0.22 0.32
SSR26 0.25 0.41
SSR35 0.22 0.36
SSR36 0.16 0.29
SSR42 0.06 0.14
SSR47 0.16 0.29
SSR55 0.06 0.14
SSR56 0.28 0.43
SSR57 0.22 0.36
SSR58 0.31 0.49
Mean 0.198 0.323
†h = Nei’s (1973) gene diversity.
‡I = Shannon’s Information index [Lewontin (1972)].
Table 9. Matrix values of genetic similarity and genetic distance of 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines by EST-SSR analysis. No.§12345678910111213141516171819202122232425262728293031 10.84† 0.92 0.73 0.65 0.90 0.65 0.90 0.51 0.63 1.00 0.88 0.78 0.88 0.73 0.78 0.69 0.69 0.88 0.76 0.90 0.84 1.00 0.73 0.90 0.88 0.76 0.78 0.86 0.84 0.84 20.18‡ 0.92 0.73 0.82 0.90 0.82 0.90 0.51 0.63 0.84 0.96 0.82 0.88 0.73 0.78 0.78 0.86 0.80 0.84 0.94 0.84 0.84 0.73 0.94 0.96 0.84 0.82 0.98 1.00 1.00 30.09 0.090.82 0.73 0.98 0.73 0.98 0.59 0.71 0.92 0.96 0.86 0.96 0.82 0.86 0.78 0.78 0.80 0.84 0.98 0.92 0.92 0.82 0.98 0.96 0.84 0.86 0.94 0.92 0.92 40.31 0.310.20 0.55 0.84 0.55 0.84 0.61 0.53 0.73 0.78 0.76 0.86 0.67 0.88 0.59 0.67 0.78 0.90 0.80 0.90 0.73 0.63 0.80 0.78 0.69 0.88 0.76 0.73 0.73 50.43 0.200.31 0.600.71 1.00 0.71 0.53 0.73 0.65 0.78 0.63 0.69 0.55 0.59 0.96 0.67 0.61 0.65 0.76 0.65 0.65 0.92 0.76 0.78 0.65 0.63 0.80 0.82 0.82 60.11 0.110.02 0.18 0.34 0.71 0.96 0.61 0.69 0.90 0.94 0.84 0.94 0.84 0.84 0.76 0.76 0.78 0.82 0.96 0.90 0.90 0.80 0.96 0.94 0.86 0.88 0.92 0.90 0.90 70.43 0.200.31 0.60 0.00 0.34 0.71 0.53 0.73 0.65 0.78 0.63 0.69 0.55 0.59 0.96 0.67 0.61 0.65 0.76 0.65 0.65 0.92 0.76 0.78 0.65 0.63 0.80 0.82 0.82 80.11 0.110.02 0.18 0.34 0.04 0.340.57 0.69 0.90 0.94 0.88 0.98 0.80 0.88 0.76 0.80 0.78 0.86 0.96 0.90 0.90 0.80 0.96 0.94 0.82 0.84 0.92 0.90 0.90 90.67 0.670.52 0.49 0.63 0.49 0.63 0.560.67 0.51 0.55 0.61 0.55 0.69 0.61 0.57 0.57 0.55 0.59 0.57 0.67 0.51 0.61 0.57 0.55 0.51 0.69 0.53 0.51 0.51 100.46 0.460.34 0.63 0.31 0.37 0.31 0.37 0.40 0.63 0.67 0.73 0.67 0.73 0.57 0.78 0.69 0.51 0.55 0.69 0.63 0.63 0.82 0.69 0.67 0.55 0.57 0.65 0.63 0.63 110.000.180.09 0.31 0.43 0.11 0.43 0.11 0.67 0.46 0.88 0.78 0.88 0.73 0.78 0.69 0.69 0.88 0.76 0.90 0.84 1.00 0.73 0.90 0.88 0.76 0.78 0.86 0.84 0.84 120.13 0.040.04 0.25 0.25 0.06 0.25 0.06 0.60 0.40 0.130.82 0.92 0.78 0.82 0.82 0.82 0.84 0.88 0.94 0.88 0.88 0.78 0.94 0.92 0.80 0.82 0.98 0.96 0.96 130.25 0.200.15 0.28 0.46 0.18 0.46 0.13 0.49 0.31 0.25 0.20 0.90 0.84 0.76 0.63 0.92 0.65 0.78 0.88 0.78 0.78 0.67 0.88 0.86 0.73 0.71 0.84 0.82 0.82 140.13 0.130.04 0.15 0.37 0.06 0.37 0.02 0.60 0.40 0.13 0.09 0.11 0.78 0.86 0.73 0.82 0.76 0.88 0.94 0.88 0.88 0.78 0.94 0.92 0.80 0.82 0.90 0.88 0.88 150.31 0.310.20 0.40 0.60 0.18 0.60 0.23 0.37 0.31 0.31 0.25 0.18 0.250.67 0.59 0.80 0.61 0.65 0.80 0.73 0.73 0.63 0.80 0.78 0.82 0.76 0.76 0.73 0.73 160.25 0.250.15 0.13 0.52 0.18 0.52 0.13 0.49 0.56 0.25 0.20 0.28 0.15 0.40 0.63 0.67 0.82 0.90 0.84 0.94 0.78 0.67 0.84 0.82 0.78 0.88 0.80 0.78 0.78 170.37 0.250.25 0.52 0.04 0.28 0.04 0.28 0.56 0.25 0.37 0.20 0.46 0.31 0.52 0.46 0.63 0.65 0.69 0.76 0.69 0.69 0.96 0.76 0.73 0.61 0.63 0.80 0.78 0.78 180.37 0.150.25 0.40 0.40 0.28 0.40 0.23 0.56 0.37 0.37 0.20 0.09 0.20 0.23 0.40 0.460.65 0.78 0.80 0.69 0.69 0.59 0.80 0.82 0.69 0.67 0.84 0.86 0.86 190.13 0.230.23 0.25 0.49 0.25 0.49 0.25 0.60 0.67 0.13 0.18 0.43 0.28 0.49 0.20 0.43 0.43 0.88 0.78 0.88 0.88 0.61 0.78 0.76 0.63 0.82 0.82 0.80 0.80 200.28 0.180.18 0.11 0.43 0.20 0.43 0.15 0.52 0.60 0.28 0.13 0.25 0.13 0.43 0.11 0.37 0.25 0.13 0.82 0.92 0.76 0.65 0.82 0.80 0.67 0.86 0.86 0.84 0.84 210.11 0.060.02 0.23 0.28 0.04 0.28 0.04 0.56 0.37 0.11 0.06 0.13 0.06 0.23 0.18 0.28 0.23 0.25 0.200.90 0.90 0.80 1.00 0.98 0.86 0.84 0.96 0.94 0.94 220.18 0.180.09 0.11 0.43 0.11 0.43 0.11 0.40 0.46 0.18 0.13 0.25 0.13 0.31 0.06 0.37 0.37 0.13 0.09 0.110.84 0.73 0.90 0.88 0.76 0.94 0.86 0.84 0.84 230.000.180.09 0.31 0.43 0.11 0.43 0.11 0.67 0.46 0.00 0.13 0.25 0.13 0.31 0.25 0.37 0.37 0.13 0.28 0.11 0.18 0.73 0.90 0.88 0.76 0.78 0.86 0.84 0.84 240.30 0.310.20 0.46 0.09 0.23 0.09 0.23 0.49 0.20 0.31 0.25 0.40 0.25 0.46 0.40 0.04 0.52 0.49 0.43 0.23 0.31 0.31 0.80 0.78 0.65 0.67 0.76 0.73 0.73 250.10 0.060.02 0.23 0.28 0.04 0.28 0.04 0.56 0.37 0.11 0.06 0.13 0.06 0.23 0.18 0.28 0.23 0.25 0.20 0.00 0.11 0.11 0.230.98 0.86 0.84 0.96 0.94 0.94 260.13 0.040.04 0.25 0.25 0.06 0.25 0.06 0.60 0.40 0.13 0.09 0.15 0.09 0.25 0.20 0.31 0.20 0.28 0.23 0.02 0.13 0.13 0.25 0.02 0.88 0.86 0.94 0.96 0.96 270.28 0.180.18 0.37 0.43 0.15 0.43 0.20 0.67 0.60 0.28 0.23 0.31 0.23 0.20 0.25 0.49 0.37 0.46 0.40 0.15 0.28 0.28 0.43 0.15 0.13 0.82 0.82 0.84 0.84 280.25 0.200.15 0.13 0.46 0.13 0.46 0.18 0.37 0.56 0.25 0.20 0.34 0.20 0.28 0.13 0.46 0.40 0.20 0.15 0.18 0.06 0.25 0.40 0.18 0.15 0.200.80 0.82 0.82 290.15 0.020.06 0.28 0.23 0.09 0.23 0.09 0.63 0.43 0.15 0.02 0.18 0.11 0.28 0.23 0.23 0.18 0.20 0.15 0.04 0.15 0.15 0.28 0.04 0.06 0.20 0.23 0.98 0.98 300.17 0.000.09 0.31 0.20 0.11 0.20 0.11 0.67 0.46 0.18 0.04 0.20 0.13 0.31 0.25 0.25 0.15 0.23 0.18 0.06 0.18 0.18 0.31 0.06 0.04 0.18 0.20 0.02 1.00 310.17 0.000.09 0.31 0.20 0.11 0.20 0.11 0.67 0.46 0.18 0.04 0.20 0.13 0.31 0.25 0.25 0.15 0.23 0.18 0.06 0.18 0.18 0.31 0.06 0.04 0.18 0.20 0.02 0.00 † Nei’s genetic identity (above diagonal). ‡ Genetic distance (below diagonal). §The number is listed in Table 1.
11개의 EST-SSR 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편의 수는 49개이며, DNA 단편의 범위는 150 ~ 1,500 bp 이었다.
각각의 프라이머에 의해 증폭된 DNA 단편 수는 최소 2개에 서 최대 7개 이었으며, 프라이머 한 개당 평균 4.5개의 DNA 단편이 증폭되었다 (Table 7).
P2 프라이머를 이용하여 유전분석을 한 결과, 2가지의 유전 양상을 확인 할 수 있었으며 3품종 (연풍, 선풍, 선원)과 8계 통 (G03146, G04058, G08038, G08034, G08085, G08039, G08036, G08031)이 동일한 유전양상을 나타냈다. P4 프라이 머에서는 3품종 (연풍, 선풍, 선운)과 9계통 (G04062.
G04068, G08020, G08038, G08034, G08085, G08039, G08036, G08031)이 같은 유전양상을 보였다. P26 프라이머를 이용하였을 때에는 150 ~ 200 bp 범위에서 3가지의 유전양상 이 나타났는데, 11 품종 중 선향에서만 특이적인 DNA 단편 이 증폭되었으며, 3품종 (선풍, 선운, 천량)이 같은 유전양 상을, 반면 7품종 (천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선운, 청선, K-1)이 같은 유전양상을 나타냈다. P35 프라이머에서는 180 ~ 300 bp 범위에서 5가지의 유전양상이 나타났는데, 2품 종 (고풍, 선풍)이 동일한 유전양상을, 3품종 (선풍, 선원, 천 량)과 2계통 (G04058, G08042)이 같은 유전양상을 보였고, 3
계통 (G04110, G08085, G08055)이 같은 유전양상을 나타냈 으며, 선향에서 특이적인 DNA 단편이 증폭 되었다. P36 프 라이머를 이용하였을 때에는 선향에서만 특이적인 DNA 단편 이 확인되었으며, 2계통 (G04110, G08085)이 동일한 유전양 상을, 2품종 (선풍, 선운)과 2계통 (G04058, G08042)이 같은 유전양상을 나타냈다. P42 프라이머에서는 약 200 bp 크기에 서 천량에서만 특이적 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 3).
P47 프라이머를 이용하여 유전분석한 결과, 2품종 (천풍, K- 1)과 2계통 (G04079, G08078)이 같은 유전 양상을 보였으며, 2계통 (G08012와 G08085)이 동일한 유전양상을 나타냈다. 한 편, P55 프라이머에서는 금풍에서만 특이적인 DNA 단편이 증폭되는 것을 확인 할 수 있었다. P56 프라이머에서는 2가지 의 유전양상이 나타났는데, 2품종 (금풍, 선향)과 5계통 (G08012, G04079, G08010, G08089, G08055)이 같은 유전 양상을 보였다. P57 프라이머에서는 2품종 (선향, 천량)과 3계 통 (G04062, G04110, G04068)이 동일한 유전양상을 나 타냈다. P58 프라이머에서는 120 ~ 250 bp 범위에서 3가지 유 전양상이 나타났는데, 청선과 G08012가 동일한 유전양상을 보 였으며, 금풍과 4계통 (G04062, G04075,G04068, G08010)이 같은 유전양상을 나타냈다 (Fig. 4).
인삼 품종 및 육성계통을 대상으로 EST-SSR 분석을 한 결 과, 품종 특이적으로 나타난 3종의 프라이머 (P36, P42, P55) 는 향후 선향, 천량, 금풍의 유전적 구별성 확보와 종자의 순 도유지를 위한 식물체의 균일성 검정 등에 유용하게 활용될 Fig. 3. Genetic polymorphisms by p2(A), p4(B) p26(C), p35(D),
p36(E) and p42(F) primers among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines. Lanes 1-31; cultivars and breeding lines in Table 1. White arrows indicate examples of polymorphic bands.
Fig. 4. Genetic polymorphisms by p47(A), p55(B) p56(C), p57(D) and p58(E) primers among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines. Lanes 1-31; cultivars and breeding lines in Table 1. White arrows indicate examples of polymorphic bands.
Fig. 5. Dendrogram of genetic similarity among 11 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines constructed on the data obtained with 11 EST-SSR primers.
수 있을 것으로 사료된다.
표 8은 선발된 프라이머 별 유전적 다양성을 조사한 결과로 써, Nei의 유전적 다양성은 전체 평균이 0.198으로 나타났으 며, P58이 0.31로 가장 높았고, P55가 0.06으로 가장 낮은 값을 나타내었다. 또한 Shannon’s Index 값도 Nei의 유전적 다양성분석 값과 비교하여 수치간의 차이는 있었으나, 동일한 경향을 나타냄을 확인 할 수 있었다. Shannon’s Index 값은 전체 평균이 0.323로 나타났으며, P58이 0.49로 가장 높았으 며, P42와 P55가 0.14로 가장 낮은 수치를 나타내었다. 표 9 는 고려인삼 11 품종과 육성 계통 20계통간의 유전적 거리를 Nei의 공식에 따라 구한 것으로 이들 간의 유전적 거리는 0 ~ 0.67 범위로 분포하였다. 유전적 거리는 고풍과 선운, 천풍 은 K-1 및 G08078, 연풍은 G08036 및 G08031이 가장 가 까웠으며, 천량은 G04079, 선운은 천풍, 연풍, K-1, G08078, G08085, G08036, G08031와 유전적 거리가 가장 먼 것으로 나타났다.
한편, 인삼 11품종과 20계통을 대상으로 군집분석을 수행한 결과, 그룹을 형성하지 않은 2품종 (천량, 선향)과 2계통 (G04110, G08085)을 제외하고, 27개의 품종 과 육성 계통은 5 그룹으로 분류되었다. Ⅰ 그룹에는 천풍 등 2품종과 G08078 등 2계통 (15%)이, Ⅱ 그룹에는 연풍 등 4품종과 G08036 등 8계통 (44%), Ⅲ 그룹에는 금풍과 G08012 등 4 계통 (19%), Ⅳ 그룹에는 G04062 등 2계통 (7%), Ⅴ 그룹에 는 선풍 등 2품종과 G04058 등 2계통 (15%)이 포함되었다.
11개의 EST-SSR 프라이머를 이용하여 인삼 품종과 육성 계통 의 유연관계를 종합해 보면, 유사도가 같은 천풍 등 5품종과 G08078 등 5계통을 제외한 인삼 품종 및 육성 계통은 21개 로 구분할 수 있었으며 이중에서도 천량, 선향 등 2품종과 G04110, G08085 등 2계통은 확실하게 구분되는 결과를 보였다 (Fig 5).
한편 Bang 등 (2010)과 Kim 등 (2012)은 천풍 등 고려인 삼의 주요 품종들을 DNA 수준에서 판별하기 위하여, 각각 4 쌍의 STS 마커 (UFGp163, MFGp108, MFGp81, UFGp156) 와 6쌍의 EST-SSR 마커 (gm47n, gm104, gm184, gm175, gm129, gm45n)를 개발하여 품종 판별에 적용한 바 있다. 하 지만 아직까지 품종 특이적인 마커 발굴과 국내에서 육성중인 품종과 육성 계통들의 판별 및 유전적 다양성을 분석하기 위 한 DNA 마커의 수는 부족한 실정이어서, 이에 대한 지속적 인 연구가 필요하리라 판단된다.
방 등 (2012)은 EST-SSR 프라이머를 이용하여 고려인삼 주요 품종과 육성 계통을 대상으로 유전적 다양성을 분석한 결과, Nei의 유전적 다양성 평균값을 0.127로, Shannon’s Index 평균값은 0.177로 보고하였다. 본 실험에서는 Nei의 유 전적 다양성 평균값이 0.198로, Shannon’s Index 평균값이 0.323으로, 이전에 보고되었던 선행 연구결과보다 유전적 다양
성 값이 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 이러한 이유는 현 재까지 국내에서 개발된 고려인삼 11 품종 모두와 유전적으로 구별성이 있는 유망계통들이 본 실험에 포함되었기 때문으로 생각된다.
RAPD 마커를 이용한 유전적 유사도 분석결과 K-1을 제외 한 10개의 품종들이 2개의 군으로 분류된 반면, EST-SSR 분 석 시에는 천량과 선향을 제외한 9개의 품종들이 4개의 군에 분포되는 결과를 보였다. 이러한 유전분석 결과를 육종에 보 다 실질적으로 활용하기 위해서는 인삼 품종과 육성계통의 열 매, 줄기, 잎, 뿌리 등의 형태적 특성으로부터 도출된 육종 데 이터와 RAPD, EST-SSR, STS 등 보다 다양한 DNA 마커들 을 적용한 유전분석 결과를 종합적으로 비교분석하여야 할 것 으로 판단된다. 또한 향후 인삼의 육종효율을 향상시키기 위 해서는 육종가의 내병성과 내염성, 내고온성 등 각종 환경스 트레스에 저항성을 지닌 식물체 선발을 위한 노력과 더불어 차세대염기서열 분석기술을 이용한 전사체 (transcriptome) 연 구 등 이들 식물체의 목적형질과 연관된 바이오마커를 중점적 으로 개발하여야 할 것으로 판단된다.
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