Protective Effects of Individual Extract and Mixture of Forsythia Fructus and Corydalis Tuber on Chronic Pancreatitis in Mice

마우스 만성 췌장염 모델에서 연교(連翹)와

현호색(玄胡索) 단일 추출물 및 추출 혼합물의 보호 효과

신준연^1#, 최지원^1,2, 김동욱², 주자기¹, 권빛나¹, 배기상^2,3,4, 송호준¹, 박성주^1,2*

1 : 원광대학교 한의과대학 본초학교실, 2 : 원광대학교 한방심신증후군센터 3 : 원광대학교 한의과대학 약리학교실, 4 : 원광대학교 한국전통의학연구소　

Protective Effects of Individual Extract and Mixture of Forsythia Fructus and Corydalis Tuber on Chronic Pancreatitis in Mice

Joon Yeon Shin

, Ji-Won Choi

, Dong-Uk Kim

, Ziqi Zhou

, Bitna Kweon

Gi-Sang Bae

, Ho-Joon Song

, Sung-Joo Park

1 : Department of Herbology, School of Korean Medicine, Wonkwang University.

2 : Hanbang Cardio-Renal Syndrome Research Center, Wonkwang University.

3 : Department of Pharmacology, School of Korean Medicine, Wonkwang University.

4 : Research Center of Traditional Korean Medicine, Wonkwang University.

ABSTRACT

Objectives : Forsythiae Fructus has been reported to have anti-inflammatory effects in many diseases, and Corydalis Tuber has been used as a pain suppressor in Eastern Asia. However, the protective effects of individual water extract of Forsythiae Fructus (FF) and Corydalis Tuber (CT) and the mixture of FF and CT (FC) on chronic pancreatitis (CP) were not well-investigated. Therefore, we investigated the protective effects of FF, CT, and FC on CP in mice.

Methods : To induce CP, cerulein was injected 6 times a day, 4 times a week for 3 weeks. 1 h before the every cerulein injection, 200 ㎎/㎏ of FF, CT, or FC was intraperitoneally injected to mice. Histological analysis of pancreas was examined by hematoxylin and eosin stain and collagen deposition was examined by Masson’s trichrome stain.

Fibrogenic parameters such as α-smooth muscle actin (α-SMA), extracellular matrix (ECM) deposition, and fibrotic cytokines such as transforming growth factor (TGF)-β1 and platelet-derived growth factor (PDGF) were also analyzed by immunofluorescence stain and real-time PCR.

Results : Histological damages in pancreas were inhibited by pre-treatment of FF or FC but not CT. α-SMA and ECM in pancreas were inhibited by pre-treatment of CT or FC but not FF. Moreover, the expression of TGF-β1 and PDGF in pancreas were inhibited by FF, CT or FC.

Conclusions : Our results suggest that FC have protective effect on CP in mice through inhibition of α-SMA, ECM, TGF-β1 and PDGF in pancreas, and these findings could suggest new clinical strategy for CP.

Key words : Chronic pancreatitis, Forsythiae Fructus, Corydalis Tuber, Fibrosis, Inflammation

*Corresponding author : Sung-Joo Park, Department of Herbology, School of Korean Medicine, Wonkwang University, 460 Iksandaero, Iksan, Jeollabuk-do 54538, Republic of Korea.

·Tel : +82-63-850-6450 ·E-mail : [email protected]

#First author : Joon Yeon Shin, Department of Herbology, School of Korean Medicine, Wonkwang University, 460 Iksandaero, Iksan, Jeollabuk-do 54538, Republic of Korea

·Tel : +82-63-850-6837 ·E-mail : [email protected]

·Received : 04 Nov 2020 ·Revised : 23 Dec 2020 ·Accepted : 25 Jan 2021

Ⅰ. 서 론

만성 췌장염은 췌장 조직의 비가역적 손상과 외분비 및 내분 비 기능 저하를 초래하는 만성 염증성 질환이다

. 우리나라의 경우 서구화되어가는 식습관과 알코올 섭취량의 증가로 만성 췌장염의 유병률이 꾸준히 증가하는 추세이고, 진단법의 발달 에도 불구하고 조기 진단의 어려움으로 인해 사망률 또한 높은 질병이다

. 임상 증상으로는 대표적으로 지속적인 복통이 있 으며, 이 외에 지방변, 당뇨병, 여러 급성 및 만성 합병증 등이 있다

. 주요 병인은 알코올 섭취로 보고되어 있으며, 알코올 다음으로는 특발성 (idiopathic)으로 약 30-40% 정도의 만성 췌장염은 현재까지도 원인을 알 수 없다

. 치료법으로는 만성 췌장염의 진행을 늦추거나 완전히 억제하기는 어려우며, 일시 적 통증 완화와 합병증 관리에 그치고 있다

.

만성 췌장염의 동물 모델로는 마우스에 cholecystokinin 유사물질인 cerulein을 투여하여 만성 췌장염을 유발하는 모 델이 보편적으로 사용되며, 이는 사람의 만성 췌장염과 조직 병리학적으로 유사하며 재현성이 우수하다

. 만성 췌장염 발 병 시 조직학적으로 광범위한 염증성 세포의 침윤, 선방 세포의 사멸 및 섬유화의 발달이 특징으로 나타난다

. 한편, 췌장 섬유 화는 췌장 내 성상 세포 (pancreatic stellate cells, PSC)에 의해 나타나는 것으로 알려져 있으며, PSC는 과도하게 생성된 transforming growth factor (TGF)-β1과 platelet-derived growth factor (PDGF)에 의해 활성화되고, 활성화된 PSC는 collagen, fibronetin과 같은 세포 외 기질 (extracellular matrix, ECM)를 다량 생성하게 된다

.

한의학에서는 만성 췌장염에 대한 명칭은 없지만 腹痛, 胃 脘痛, 痺心痛, 結胸 등과 같은 증상으로 기록되어 있으며

, 이는 脾胃實熱, 肝鬱氣滯 등을 변증으로 하여, 淸熱解毒, 理氣 止痛 치법을 사용한 처방으로 치료한다

. 連翹 (Forsythiae Fructus, Oleaceae)는 性味가 微寒 苦하고, 歸經은 心肺膽經 에 入하며, 淸熱解毒효과가 있으며

, 또한 玄胡索 (Corydalis Tuber, Papaveraceae)은 理氣止痛 작용이 있어, 肝鬱经气滞 와 血瘀로 인한 胸胁痛과 脘腹疼痛 등의 진통 효과를 목적으로 사용되고 있다

. 連翹의 경우 염증성 사이토카인 억제, 염증 매개물질 억제 등 항염증 작용에 효과적이라 보고되어 있으며

17-19)

, 또한 玄胡索은 항염, 통증 억제, 항암 작용에 효과가 있

다고 보고되어 있으나

, 만성 췌장염에서의 효능은 아직까 지 밝혀진 바가 없다. 이에 저자는 통증을 수반한 만성 염증성 질환인 마우스 만성 췌장염에서 항염증에 효과적인 連翹 물 추 출물 (water extract of Forsythiae Fructus, FF)과 통증 억 제에 효과적인 玄胡索 물 추출물 (water extract of Corydalis Tuber, CT), 그리고 추출 혼합물 (FF+CT, FC)이 만성 췌장 염에서 염증과 통증을 조절할 것이라 사료되어 보호 효과를 조사하였으며, 유의미한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

II. 재료 및 방법

1. 재료

連翹와 玄胡索은 옴니허브 (영천, 대한민국)에서 구입하였으 며, 원광대학교 한의과대학 본초학교실에서 정선하여 사용하였 다. 連翹와 玄胡索은 각각 100 g을 증류수 1 L를 넣은 뒤 끓는 시점부터 2시간 30분 동안 전탕하여 추출하였다. FF와 CT는 여과한 후 동결 건조하였으며, 3차 증류수에 녹여 필터한 후 실험에 사용하였다. 동결 건조시킨 후 최종 얻은 추출물은 FF 12.15 g, CT 11.98 g으로 수율은 FF 12.15 %, CT 11.98 % 였다. FC는 FF와 CT를 1 : 1 비율로 섞어서 제조하였다.

2) 시약

Cerulein, Formalin, Xylene, Hematoxylin, Eosin은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

Masson’s trichrome (MT) staining kit는 Polysciences (PA, USA)에서 구입하였다. Easy-Blue

Total RNA extraction kit는 iNtRON Biotechnology (성남, 대한민국)에서 구입하 였다. ABI cDNA synthesis kit와 TaqMan master mix는 Applied Biosystems (CA, USA)에서 구입하였다. α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

3) 실험 동물

C57BL/6 mouse (15-20 g, female)는 오리엔트 (성남, 대한민국)에서 구입 하였으며, 모든 실험은 원광대학교의 동물 관리 규정에 따라 수행되었다 (approved number : WKU20- 112). 원광대학교 한의과대학 동물 사육실은 일정한 조건 (온 도 : 21 ± 2℃, 습도 : 50 ~ 60 %, 명암 : 12 시간 주기)을 유지해 주었으며, 모든 실험 동물은 실험에 사용하기 전 일주 일간 일반 고형사료 (오리엔트, 성남, 대한민국)와 물을 충분히 공급하며 환경에 적응시킨 후 사용하였다.

2. 방법

1) 만성 췌장염 유발

실험 동물은 군당 6마리씩 구분하여 실험을 진행하였다. 만 성 췌장염은 하루에 cerulein (50 ㎍/㎏)을 1시간 간격으로 총 6번 복강주사 하였으며, 일주일에 4일, 총 3주간 유발 하였다.

매 첫번째 cerulein을 주사하기 1시간 전 FF (200 ㎎/㎏), CT (200 ㎎/㎏), FC (200 ㎎/㎏)을 복강 주사 하였다. 마지막 cerulein을 주사 한 후 24시간 뒤에 개복하여 췌장 조직을 적 출하였다.

2) 생화학 독성 평가

FF와 CT의 in vivo에서 미치는 독성을 평가하기 위해 마

우스를 7 군으로 나누어 실험하였다. 마우스에 FF (100,

200, 500 ㎎/㎏)와 CT (100, 200, 500 ㎎/㎏)를 복강주사

하였으며 24시간 뒤에 혈액을 채취하였다. 혈액은 5,000

rpm으로 5분간 원심분리하여 serum을 분리하였다. 분리한

serum은 Blood Urea Nitrogen (BUN), creatinine (CREA),

alkaline phosphatase (ALP), Alanine Transaminase

(ALT), Aspartate Transaminase (AST) 측정에 사용하였다

(Table 1).

Group BUN (mg/dL) CREA (mg/dL) ALP (IU/L) ALT (IU/L) AST (IU/L)

Normal 23.33 ± 3.06 0.17 ± 0.01 359.00 ± 4.58 33.00 ± 7.94 224.33 ± 35.53

FF 100 ㎎/㎏ 18.00 ± 4.00 0.14 ± 0.03 367.00 ± 14.53 32.67 ± 4.73 249.67 ± 9.61 FF 200 ㎎/㎏ 22.67 ± 2.31 0.15 ± 0.01 340.33 ± 16.50 35.67 ± 1.53 233.33 ± 4.04

FF 500 ㎎/㎏ 20.67 ± 1.53 0.19 ± 0.03 357.00 ± 9.00 34.00 ± 6.24 232.00 ± 2.65

CT 100 ㎎/㎏ 23.00 ± 2.65 0.16 ± 0.02 351.00 ± 15.87 34.33 ± 3.51 265.00 ± 32.19 CT 200 ㎎/㎏ 23.67 ± 3.51 0.16 ± 0.01 358.33 ± 15.01 29.33 ± 2.31 215.67 ± 47.54 CT 500 ㎎/㎏ 25.33 ± 1.53 0.16 ± 0.04 369.67 ± 18.34 34.67 ± 4.04 247.33 ± 39.55 Mice pretreated with FF or CT (100, 200, or 500 ㎎/㎏) were administered with intraperitoneal injections. Blood were harvested at 24 h after administration. Data are represented as mean ± S.E.M. (n = 6). BUN, blood urine nitrogen. CREA, creatinine. ALP, alkaline phosphatase.

ALT, Alanine Transaminase. AST, Aspartate Transaminase.

Table 1. Effect of FF and CT on biochemical toxicity

3) Hematoxylin & Eosin 염색

적출한 췌장 조직은 4% formalin용액을 이용해 고정시켜 준 후, 일반적인 조직표본 제작방법으로 paraffin에 포매한 후 4

㎛ 두께로 절단하였다. Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 이용하여 조직학적 관찰을 하였으며, 카메라부착 광학현미경 (Olympus BX51, Japan)을 사용하여 사진을 촬영하였다. 각 췌장 조직은 기존 보고되어 있는 논문

을 참고하여, 선방 세포 위축정도 및 염증성 세포 침윤 정도 (정상적인 조직 0점부터 질병상태의 조직 3점까지)를 기반으로 채점하였다.

4) Masson’s trichrome 염색

4 ㎛ 두께 췌장 절편의 파라핀을 제거한 후, 콜라겐 염색을 하기 위해 MT staining kit (Polysciences, PA, USA)를 사용 하였으며, 제조사의 권장 사용 지침을 토대로 염색하였다.

5) RNA 추출

적출한 각 췌장 조직은 1 ㎖의 Easy Blue 용액에 넣어 파 쇄한 후 100 ㎕의 chloroform 용액을 더하여 혼합하였다.

13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 그 상층액을 취한 뒤, 2-propanol을 1:1 비율로 섞어주고 10분간 상온에서 반응 시켰다. 그 후 13,000 rpm으로 5분간 원심분리 한다. 분리 된 상층액은 버리고 침전물에 1 ㎖ 80 % ethanol을 넣어 세정 하였다. 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후, 상층액은 버 리고 침전물을 건조시켰다. 침전물에 50 ㎕의 DEPC 처리한 증류수를 넣어 RNA를 용해시킨 뒤 정량하였다.

6) Real time RT-PCR

mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 각각의 샘플은 중복실험을 진행하였으며, 합성된 cDNA 1 ㎕, real time PCR master mix 4 ㎕, primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다. 모든 PCR 결과 는 housekeeping gene인 hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT)에 의해 정량화 하였다.

PCR 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 이후 95℃에서 10초, 60℃에서 30초를 35 cycle 진행하였다. PCR 결과는 Step One

software (version2.3)를 이용하여 분석하였다.

7) 면역 형광 분석

췌장 조직에서의 α-SMA 발현을 확인하기 위해 9 ㎛의 동

결 췌장 조직 절편에 0.1 % Triton X-100이 포함된 phosphate buffer saline (PBS)를 상온에서 10분간 처리하였다. 이후 비 특이적 항체 결합 방지를 위해 blocking buffer (5 % goat serum, 3 % BSA 를 포함한 PBS)를 상온에서 2시간 처리하 였다. α-SMA primary antibody를 1:500으로 blocking buffer에 희석하여 4℃에서 overnight으로 반응시켰다. 마지 막으로 Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary antibody를 blocking buffer에 1:2,000으로 희석하여 상온 에서 2시간 반응시켰다. 세포핵 염색은 DAPI로 진행하였으며 상온에서 5분간 반응시켰다. 면역 형광 이미지는 confocal laser microscope (Olympus, Japan)으로 관찰 및 분석하였다.

8) 통계처리

모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± S.E.M.로 나타내었다. 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램 (v22.0)의 one way ANOVA에 준하였고, Duncan method로 사후검증을 하였다. Control 혹은 만성 췌장염 유발 군과 비교 분석하여 P-value가 0.05, 0.01, 0.001 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

III. 결 과

1. 만성 췌장염에서 FF, CT, FC가 췌장 조직 손 상에 미치는 효과

Cerulein에 의해 만성 췌장염이 유발된 췌장 조직의 병리학

적 변화는 췌장 선방 세포 (pancreatic acinar cells, PAC)의

위축과 염증성 세포 침윤의 증가 등이 있다

. 이러한 조직학적

손상을 FF, CT, FC가 억제 할 수 있는지 관찰하기 위해 H&E

염색을 통해 관찰 하였다. 그 결과, 정상 군에 비해 만성 췌장

염 유발 군에서는 심각한 조직 손상이 나타나며, PAC 및 췌관

의 atrophy 및 염증성 세포의 침윤이 증가됨을 발견할 수 있

었다. 반면 FF를 처리한 군에서는 약간의 개선효과가 보였고,

CT를 처리한 군에서는 보호 효과가 거의 없었다. 하지만, FF

와 CT를 혼합하여 처리한 FC 군에서는 PAC 및 췌관의 atrophy

및 염증성 세포 침윤이 유의하게 억제되는 것을 볼 수 있었다

(

P < 0.001 vs. Saline+CP group) (Fig. 1).

Fig. 1. Effects of FF, CT, or FC on cerulein-induced pancreatic damage in mice.

(A) Representative H&E-stained pancreatic tissue section. FF (200 ㎎/㎏), CT (200 ㎎/㎏) or FC (200 ㎎/㎏) were pre-treated at 1 h before the cerulein injection. (B) Pancreatic sections were histologically scored from 0 (normal) to 3 (severe) for glandular atrophy and inflammation.

Data are represented as means ± S.E.M. for 6 mice in each group. Results are representative of three experiments. *P < 0.05 vs. Saline group, ^##P < 0.01 vs. Saline+CP group, ^###P < 0.001 vs. Saline+CP group. Original magnification x400.

2. 만성 췌장염에서 FF, CT, FC가 PSC 활성에 미치는 효과

일반적으로 정상 췌장 조직 내에서 PSC는 비활성화 상태로 존재하고 있으나, 만성 췌장염 시에는 활성화되며 α-SMA을 발현하게 된다

. 따라서 면역 형광 분석법과 PCR방법을 통해 췌장 조직의 α-SMA 발현을 조사하여 PSC의 활성화 정도를

평가하였다. 그 결과 만성 췌장염 유발 군의 췌장조직에서 α- SMA의 발현이 정상군에 비해 크게 증가하는 것을 볼 수 있었 고, 이러한 증가는 FF 혹은 CT처리에 의하여 약간의 억제효과 를 보였다. 또한 FC 처리 군에서도 α-SMA의 발현이 유의하게 억제되는 것을 볼 수 있었으며 (

P < 0.001 vs. Saline+CP group), 이는 FF 단독 처리군 보다 더 많은 보호 효과를 보였 다 (Fig. 2).

Fig. 2. Effects of FF, CT, or FC on PSC activation during CP. (A) Confocal image of immunofluorescence staining of α-SMA (red) and DAPI (blue). (B) mRNA levels of Acta2 was measured using RT-qPCR. Data are represented as means ± S.E.M. for 6 mice in each group. Results are representative of three experiments. *P < 0.05 vs. Saline group, ^#P < 0.05 vs. Saline+CP group, ^###P < 0.001 vs. Saline + CP group. Scale bar 30 µm.

3. 만성 췌장염에서 FF, CT, FC가 ECM 생성에 미치는 효과

Collagen과 fibronectin과 같은 ECM의 축적은 만성 췌장 염의 주요한 특징이다

. 따라서 FC가 만성 췌장염 마우스 의 췌장 조직 내 ECM 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 먼저, collagen 축적 정도를 MT 염색 (Fig. 3A, 3B)과 real time

PCR 방법 (Fig. 3C, 3D)을 통해 관찰한 결과 만성 췌장염 유발 췌장 조직에서 collagen 축적이 증가 되었으며, 이는 CT 처리 에 의하여 약간의 억제효과를 보였고, FF 단독 처리한 군에서 는 억제 효과가 나타나지 않았다. 그러나 FC 처리 군에서는 단독 처리 군에 비해 collagen 축적이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다 (

P < 0.001 vs. Saline+CP group) (Fig. 3).

Fig. 3. Effects of FF, CT, or FC on ECM deposition in pancreas during CP. (A) Collagen deposition was measured by MT staining. (B) Related intensity of MT stain positive area. (C) Collagen I and (D) fibronectin 1 mRNA levels were measured using RT-qPCR. Data are represented as means ± S.E.M. for 6 mice in each group. Results are representative of three experiments. *P < 0.05 vs. Saline group, ^#P < 0.05 vs.

Saline+CP group, ^##P < 0.01 vs. Saline+CP group, ^###P < 0.001 vs. Saline+CP group. Original magnification x400.

4. 만성 췌장염에서 FF, CT, FC가 섬유화 사이 토카인에 미치는 효과

TGF-β1과 PDGF는 만성 췌장염 시 PSC를 활성화 시키며 섬유화에 관여하는 것으로 보고되고 있다

. 따라서 췌장 섬유 화에서 TGF-β1과 PDGF의 발현 조절은 중요한데, 본 연구 에서 real time PCR 방법을 통해 이들의 발현 변화를 관찰한

결과, 만성 췌장염 유발 군에서 증가된 TGF-β1과 PDGF의 mRNA 발현은 FF, CT 전 처리 군에서 각각 유의한 억제효과 를 보였다 (

P < 0.01 vs. Saline+CP group). 그러나 FC 군 에서는 각각을 처리하여 나타난 억제 효과 이상으로 TGF-β 1과 PDGF의 mRNA 증가가 더 유의성 있게 억제되는 것을 확 인 하였다 (

P < 0.001 vs. Saline+CP group) (Fig. 4).

Fig. 4. Effects of FF, CT, or FC on expression of mediator of fibrosis in pancreas during CP. (A) TGF-β1 and (B) PDGF mRNA levels were measured using RT-qPCR. Data are represented as means ± S.E.M. for 6 mice in each group. Results are representative of three experiments. *P < 0.05 vs. Saline group, ^#P < 0.05 vs. Saline+CP group, ^##P < 0.01 vs. Saline+CP group, ^###P < 0.001 vs. Saline+CP group.

Ⅳ. 고 찰

만성 췌장염은 통증이 주요한 증상으로 나타나는 섬유화 질 환이다

. 지속적인 복통은 삶의 질이 저하되는 문제로 이어지 기 때문에, 사회적 비용이 큰 질병이다

. 만성 췌장염의 발병 률은 계속해서 증가하는 추세이며, 완치가 어렵고 뚜렷한 치료 제가 아직 없다. 만성 췌장염이 발병되는 원인으로는 반복되는 급성 췌장염에 의한 결과 라는 가설이 있으나, 급성 췌장염이 만성 췌장염으로 발달하는 명확한 메커니즘은 밝혀져 있지 않 다

.

連翹는 arctigenin, pinoresinol, rutin, acteoside 등의 항 염증에 효과적인 성분을 함유한다고 보고되어 있다

. 또한 玄胡索이 함유한 성분으로는

-Tetrahydropalmatine이 있 으며, 이 성분은 통증 억제 효과가 보고되어 있다

. 이에 본 연구에서는 마우스 만성 췌장염 모델에서 염증 조절에 효과적 인 連翹와 통증 조절에 효과적인 玄胡索을 사용하여 만성 췌 장염 보호 효과를 관찰하였으며, 連翹와 玄胡索의 혼합물에서 각각의 효과가 중첩되어 더 효과적인 보호 효과를 나타내는지 관찰하였다.

FF와 CT의 보호 효과를 관찰하기 위한 적정 농도를 설정하 기 위해 in vivo toxicity를 평가하였다. FF와 CT 각각 500

㎎/㎏의 농도까지 유의미한 독성을 나타내지 않았으며, 만성 췌장염 보호 효과를 관찰하였다. 그러나 FF와 CT 모두 200

㎎/㎏와 비교하여 500 ㎎/㎏의 농도에서 더 개선되는 효과를 관찰하지 못하였기에 200 ㎎/㎏의 농도로 설정하였으며, 이후 실험을 진행하였다 (Table. 1).

만성 췌장염이 유발되면 조직학적으로 PAC 및 췌관의 손상 이 일어나고 염증성 세포의 침윤이 증가된다

. 본 연구에서 도 기존 보고와 마찬가지로 만성 췌장염 유발 시 조직 손상을 발견할 수 있었다 (Fig. 1). 만성 췌장염 유발 군과 비교해서 FC 투여 군에서 PAC의 손상을 억제하였으며, 염증성 세포의 침윤 정도도 감소한 것을 발견하였다. FF와 CT를 각각 단독 투 여한 결과, FF 투여 군에서는 PAC 손상과 염증성 세포를 약간 억제하였지만 (Fig. 1), 그 효과가 FC에 미치지는 못하였으며, CT 투여 군에서는 유의한 억제 효과를 관찰하지 못하였다.

이 결과는, FF는 조직 손상 억제에 약간의 효과가 있고, CT는 효과가 거의 없지만, FF와 CT를 혼합하여 사용하면 상승효과 를 통하여 췌장 조직 손상 억제에 더 효과적으로 기여할 수 있 음을 의미한다.

만성 췌장염 발병 시 조직 섬유화가 진행되는데, 췌장 섬유 화에 작용하는 주요 세포로는 PSC가 있다. PSC는 일반적으로 desmin을 발현하는 비활성 상태로 췌장에 존재하게 된다. 그 러나 외부 요인이 작용하면 활성화 되면서 α-SMA을 발현하게 된다

. 따라서 α-SMA은 PSC의 활성 마커로 여겨져 왔다.

활성화된 PSC는 ECM을 생성하고, 과도하게 생성된 ECM이 조직에 축적되어 섬유화 현상을 불러오게 된다

. 만성 췌장염 유발 군에서 α-SMA과 이와 관련한 유전자인 Acta2의 증가로 보아 PSC의 활성이 증가하였으며, 이는 FC 투여 시 현저히 감 소하였다. FF와 CT 단독 투여 군에서도 PSC의 활성을 억제하 였으나, FC 투여 군에 미치지 못하였다 (Fig. 2). 추가적으로 MT 염색을 통해 collagen 축적을 확인한 결과 만성 췌장염 시 collagen 축적양이 증가되어 있었으며, FC 전 처리 군에서는

확연히 감소되어 있었다. FF와 CT 단독 투여 군을 평가한 결 과, FF가 collagen 축적을 유의미하게 감소시키지는 못하였다.

그에 반해 CT는 collagen 억제에 대해 유의한 효과를 나타내 었다. 또한 ECM과 관련한 유전자인 collagen과 fibronetin 에서도 비슷한 결과를 나타내었다 (Fig. 3). 앞선 조직학적 손 상과 달리 PSC 활성과 ECM 축적에는 FF 단독 투여 군에서 유의미한 억제 효과를 보이지 않았으며, CT 단독 투여 군에서 만성 췌장염과 비교해 개선되는 모습을 보였다. 이 결과를 통해, CT는 PSC의 활성 및 ECM 물질 축적을 억제하고, FF는 효과 가 거의 없지만, FF와 CT를 혼합하여 사용하면 상승효과를 통 하여 PSC활성 억제 및 ECM물질 축적 억제에 기여할 수 있음 을 확인하였다.

PSC는 여러 자극 인자에 의해 활성화 되는데 대표적으로 TGF-β1와 PDGF가 있다. TGF-β1과 PDGF는 손상된 PAC 및 염증성 세포에서 생성되며, 인접한 PSC를 활성화 시킨다

39-41)

. 본 연구에서도 기존 보고와 마찬가지로 만성 췌장염 유발

군에서 췌장 내 TGF-β1과 PDGF의 mRNA 발현이 증가되었 다 (Fig. 4). 이러한 증가는 FF와 CT 투여 시 억제되고 있었으 나, 그 효과는 FC 투여 군에서 더 유의하게 나타났다 (Fig. 4).

이 결과를 통해, FF와 CT를 혼합하여 사용하면 상승효과를 통 하여 섬유화 사이토카인 억제에 기여할 수 있음을 확인하였다.

앞선 결과들로 보아 만성 췌장염에서 FF와 CT 각각이 췌장 보호 효과를 가지고 있는 것으로 확인하였다. PAC 손상 및 염증 세포 침윤 억제에는 FF가 효과적이며, PSC 활성 및 ECM 축적 억제에는 CT가 더 효과적임을 확인하였다. FC의 경우, FF와 CT가 가지는 장점이 혼합되어 각각이 가지는 효과보다 더 유의 적인 만성 췌장염 보호 효과를 보이는데, 이는 만성 췌장염 보호 효과에서 FF와 CT가 서로 다른 조절 기전을 가지고 있을 가능성을 의미한다. 그러나 FF와 CT 단독 처리 군에 비해 FC가 더 큰 보호 효과를 가지는 명확한 이유 및 기전은 아직 밝히지 못하였으며, 추가적인 실험이 필요하다. 한의학에서는 보다 효과적인 치료를 목적으로 약물을 혼합하여 사용하는 경 우가 있기에 상승 효과를 나타내는 FC의 효과는 만성 췌장염 치료에 기초적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

Ⅴ. 결 론

본 연구는 통증을 동반한 만성 염증성 질환인 만성 췌장염에 효과적인 약물을 탐색하기 위해 連翹 (FF), 玄胡索 (CT) 각각의 물 추출물과 連翹, 玄胡索 혼합물 (FC)의 만성 췌장염 보호효 과를 알아보았으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.

만성 췌장염에서 連翹는 PAC 손상과 염증성 세포의 침윤을 억제하고 있었으며, 玄胡索은 PSC의 활성화와 ECM 축적을 억제하였다. 또한, 섬유화 사이토카인은 連翹와 玄胡索이 모두 억제하였다. FC는 連翹와 玄胡索 각각의 효과가 혼합되어 PAC 손상, 염증성 세포 침윤, PSC 활성화, ECM 축적, 섬유화 사이 토카인을 모두 억제하고 있었으며, 連翹와 玄胡索 단독 투여보 다 더 많은 보호 효과를 보였다.

이상의 결과로 보아 FC는 만성 췌장염에 대한 보호 효과가

있음을 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 보건장학회의 지원으로 수행하였음

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