소나무 잎과 가지의 정유와 그 성분들의 항산화 및 항노화 작용
김연정·조봉재·고명수·정재민·김희래·송호선·이지윤·심상수·김창종#
중앙대학교 약학대학 병태생리학교실
(Received January 20, 2010; Revised April 10, 2010; Accepted July 10, 2010)
Anti-oxidant and Anti-aging Activities of Essential Oils of Pinus densiflora Needles and Twigs
Youn Joung Kim, Bong Jae Cho, Myung Soo Ko, Jae Min Jung, Hee Rae Kim, Ho Sun Song, Ji Yun Lee, Sang Soo Sim and Chang Jong Kim#
Division of Pathophysiology College of Pharmacy Chung-Ang University, Seoul 156-756, Korea
Abstract — To investigate effects of pine essential oil isolated by steam distillation from Pinus densiflora needles (PN) and twigs (PT) on anti-oxidant and anti-aging activities, the experiments were carried out to determine anti-oxidant and anti- aging activities on DPPH radical scavenging activity, NBT/xanthine oxidase-superoxide scavenging activity, silica-induced intracellular H2O2 and hydroxyl radical generation in RAW264.7 cells, hyaluronidase and elastase activities in vitro. Essential oil of PN and PT were contained 0.225 and 0.176 (w/v) %, respectively. PN was contained with 30 kinds of essential oil and its major constituent is α-pinene (21.5%). Further PT was contained with 40 kinds of essential oil and its major constituent is β-pinene (22.4%) in GC/MS assay. Other essential oils of PN were β-pinene, camphene, myrcene, limonene, terpinolene, α-terpineol, bornyl acetate, α-copaene, caryophellene and humulene and PT were α-pinene, camphene, phellandrene, limonene, terpinolene, α-terpineol, bornyl acetate, α-copaene, caryophellene and humulene. The essential oil of PT have more active than that of PN in anti-oxidant activity which has significant DPPH radical and superoxide scavenging activity, and significant inhibitory activities on silica-induced intracellular H2O2 and hydroxyl radical generation, as well as, sig- nificantly inhibited elastase and hyaluronidase activities. Further, phellandrene, myrcene and α-pinene have DPPH radical and superoxide scavenging activities, β-pinene, terpinolene, myrcene and phellandrene inhibited silica-induced intracellular H2O2 and hydroxyl radical generations. And also phellandrene and β-pinene inhibited hyaluronidase and elastase activities.
In conclusion, the essential oils isolated from PN and PT have anti-oxidant and anti-aging activities.
Keywords □ pinus essential oil, superoxide, hydroxyl radical, hyaluronidase
스트레스를 풀어주고 몸과 마음을 새롭게 해 주는 삼림욕 효 과를 주는 산림향의 정체가 바로 피톤치드(phytoncide)1)인데, 그 주성분은 테르펜유이다. 테르펜이 휘산되어 있는 상태의 대기에 인간이 접하는 것을 삼림욕이라 부르고 있다. 피톤치드는 외부 유해환경에 대한 자체방어기제로 합성되는 생리활성 물질로서 항균, 살균 등 방부 효과가 뛰어나고, 항산화제로서 작용한다는 보고가 있다.2,3)
정유함량이 높은 상록침엽수로 잣나무, 소나무가 있는데, 소나 무의 잎 정유를 추출하여 분석해 보면 50여종의 테르펜 성분을 함유하고 있으며, 주성분은 α 및 β-pinene, myrcene, β-thujene, bornyl acetate 등인데, α-pinene의 함유량이 14~23%이다. 소나
무림에서 방출되는 테르펜의 종류는 모두 휘발성이 강하고 분자 량이 작은 모노테르펜류이다.4,5)우리나라에서 오래전부터 차를 끓여 마시거나 민속약인 자양강장제로 사용되어온 솔잎은 methanolic extracts에서 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거, hydroxyl radical 억제, reactive oxygen species generation, peroxynitrites 소거 효과가 있어 산화적 손상의 치 료에 유용하다고 보고되어있다.6)또한, 솔잎 정유추출물의 생리 활성 관련 연구로 항산화 활성 및 항노화,7-9)면역 활성,10,11)항 비만 및 지질대사에 미치는 영향,12) 뇌 조직의 acetylcholine esterase의 활성에 대한 연구13)가 상당히 많이 이루어져 있다.
정유 즉 휘발성 방향물질은 식물체가 주위의 외부환경으로부 터 자신을 지키기 위해 발산하는 일종의 방어물질이라 할 수 있 다. 소나무속의 침엽수들의 모든 나무는 모든 부위(wood, bark, needles)에서 수많은 병원균과 초식 곤충들을 방어하기 위해서 많은 양의 balsam을 생산한다. 나무가 해충의 공격을 받으면 이
#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-820-5600 (팩스) 02-821-7680 (E-mail) [email protected]
종설
들 벌레가 싫어하는 성분을 잎에 축적하여 갉아 먹히지 않도록 하고 있다.14)
피톤치드의 좋은 점은 수목이 가지고 있는 특성상 어떤 균을 죽일 것인가에 초점을 맞출 수 있고 인간의 신체에 무리 없이 부 드럽게 흡수되는 점, 그리고 화학합성 물질이 아니라는 점이 특 징이다. 또 항생물질은 그 강력한 살균력에 의해 미생물을 변화 시키고, 진화시키며, 내성이 있는 새로운 질병을 발생시키는데 반해, 피톤치드는 전염병에 효과가 있는 약으로서의 조건을 가 지고 있으므로 인간에 기생하는 병원체의 활동을 억제하여 인간 이 갖는 방위력을 촉진시킬 수 있다. Terpinene-4-ol은 항균 효 과가, α-terpineol, α-pinene은 미생물의 성장억제효과가 있다고 보고되어 있다. 여러 침엽수로부터 정유를 추출하여 비교한 결 과 소나무는 항균성, 전나무는 항진균성, 편백나무는 두 가지 모 두 효과가 있다고 보고되어 있다.11)
정유는 이와 같이 강력한 항균력을 가졌을 뿐만 아니라 악취 제거, 스트레스 해소, 긴장완화, 구충, 이뇨, 거담, 강장, 혈압강 하 효과 등이 있다고 보고되고 있다. 소나무 잎 정유는 chromosome aberration(CA)-염색체 변이, sister chromatid exchange(SCE)-자녀 염색분체 교환 실험, in vivo Drosophila melanogaster somatic mutation and recombination test (SMART)-돌연변이와 재조합 등 3가지 유전독성 실험에서 Drosophila melanogaster에서 돌연변이를 야기해도 림파구에서 의 유전독성은 상당히 낮다고 보고되어 인체 사용에 무해하다.15) 또한 pine essential oil이 골다공증 모델에서 골 손실을 막는다 고 보고하였다.16)또한 소나무의 4종의 가지로부터 얻은 essential oil을 공기에 산포해 음식에 저장된 긴털 가루 진드기에 대해 진 드기퇴치 활성을 평가한 결과, 모든 essential oil에서 좋은 효과 가 있었고, Pinus pinea와 그 두 성분(1,8-cineole, limonene)은 8µl(1,8-cineole은 6 µl)에서 완전한 진드기 퇴치 효과를 보였다.17) Rosewood oil, White pine oil, Taiwan Hinoki oil이 호흡과 접 촉 독성에 연관된 진드기 고정효과를 갖고, Hinoki oil의 10성분 들 중에 특히 Linalool, Geranyl acetate, α-terpineol은 강한 진 드기 고정 효과를 갖는다고 밝혔다.18)
따라서 본 연구에서는 가장 많은 피톤치드를 방출하고 손쉽게 구할 수 있는 소나무의 잎과 가지부위로부터 추출한 정유가 노 화방지제로서의 기능성화장품 응용 가능성을 제시하고자 DPPH 로 Radical 소거, NBT를 이용한 Xanthin oxidase로 superoxide 소거, H2O2, hydroxyl radical 생성 등 활성산소 억제 작용을 측 정하고 hyaluronidase와 elastase 작용을 통해 피부 보습과 탄력 에 미치는 영향을 연구하였다.
실험방법
재료 및 시약
소나무의 잎과 가지는 2005년4월20일에 경기도 이천시 모가
면 서경리의 마옥산에서 채취하여, 기기분석 후 성분의 활성 실 험시에 필요한 표준품과, 1-diphenyl-2-picrylhydroazyl(DPPH), xanthine oxidase(XO), nitroblue tetrazolium chloride(NBT), hypoxanthine 들은 Sigma chemical Co.로부터 구입하였다. 2',7'- dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA), dihydrorhodamine(DHR) 는 Molecular Probe Co.에서 구입하였다. 기타 시약은 sigma에 서 구입하였다.
세포배양
Raw 264.7 세포는 서울대학교 세포주 은행으로부터 구입하였 고 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomysin(100 IU/
50µg/ml)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 용액으로 37oC로 유지되는 5% CO2배양기에서 배양 하였다.
정유의 추출 및 성분분석
서로 불용인 혼합물 증기의 전 압력은 순성분 각각의 증기압 의 합과 같으므로, 정유의 증기압과 물의 증기압의 합이 증류조 내의 압력과 같아지면, 정유는 수증기와 함께 비등하여 유출하 는 steam distillation 방법으로 채취한 소나무의 잎과 가지를 음 건 세절한 후 분쇄하여 100oC에서 6시간 동안 추출하여 잎 (needles) 4 kg에서 9 ml, 가지(twigs) 1.7 kg에서 3 ml의 각각 0.225%(v/w), 0.176%(v/w) yield의 essential oil을 얻었다.
GC-MS − AutoSpec EBE mass spectrometer(Micromass, Manchester, UK). HP 6890 Series, Columm: DB-5 MS를 사 용하여 분석하였다. GC column은 fused silica capillary을 사용 하였고 온도는 100oC에서 5분간 유지한 후 분당 2oC의 비율로 150oC까지 상승시켰으며 150oC에서 다시 분당 6oC의 비율로 280oC까지 승온시켰다. 질량분석은 70 eV에서 Eletron Impact Mode 로 분석하였다.
DPPH radical 소거 정량
96 well plate에 무수 에탄올에 녹인 0.1 mM 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl(DPPH) 용액 180 µl와 DMSO에 희석시킨 0.1, 1, 10, 100, 1000µg/ml의 Pine Needles(PN)과 Pine Twigs(PT) essential oil, 또 DMSO에 녹인 0.1, 1, 10, 100, 1000 µM의 소나무 essential oil의 구성성분들을 각각 20 µl씩 가하고 차광 상태에서 37oC에서 30분간 배양하였다. 배양 후 FL 600 spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다.20)
NBT/XO(superoxide 소거) 정량
0.6 mM hypoxanthine, 1 mM EDTA, 0.2 mM NBT를 함유하 는 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4) 400 µl에
DMSO에 희석시킨 0.1, 1, 10, 100 µg/ml의 Pine Needles(PN) 과 Pine Twigs(PT) essential oil, 또 DMSO에 녹인 0.1, 1, 10, 100µM의 소나무 essential oil의 구성성분들을 5 µl를 가하여 잘 혼합하였다. 반응은 xanthine oxidase(1 U/ml) 100 µl를 가하면서 시작하였다. 반응 혼합액을 37oC에서 20분간 배양한 후 96 well plate에 200 µl씩 소분하고 FL 600 spectrofluorometer를 이용하 여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.20)
Hyaluronidase 활성 측정
96-well microplate에 55oC로 가온된 hyaluronic acid-agarose mixture를 100 µl씩 분주한 후 실온에 방치하여 gel화시켰다.
100µl hyaluronidase(100 unit)를 가하고 37oC에서 배양한 후 상층액을 버리고, 10%(w/v) cetylpyridinium chloride를 100 µl 가하여 실온에서 30분 방치하고 595 nm에서 흡광도를 측정하 였다.21,22)
Elastase 활성 측정
Human leukocyte elastase를 50mM sodium acetate buffer (pH 5.3)에 녹여 1 unit/ml 용액을 만들었다. Elastase 기질 용액 은 MeO-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-pNa(p-nitroanilide)를 DMSO 에 녹여 20 mM stock solution을 만들었다. Pine Needles(PN) 과 Pine Twigs(PT) essential oil, 또 oil 구성성분들이 elastase 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 elastase를 이들과 혼합 한 후 10 µl를 96 well plate에 분주하고 10 mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 200 µM p-nitroanilide를 200µl를 첨가하였다. 반응액은 37oC에서 20분간 배양하고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.23)
Fig. 1 − Gaschromatograms (A), and Retention time and relative area (B) of essential oil of Pine twigs (PT) in GC/MS.
AutoSpec EBE mass spectrometer, and gaschromatography (Micromass, Manchester, UK) HP 6890 Series, Columm:
DB-5 MS.
Fig. 2 − Gaschromatograms (A), and Retention time and relative area (B) of essential oil of Pine twigs (PT) in GC/MS.
AutoSpec EBE mass spectrometer, and gaschromatography (Micromass, Manchester, UK) HP 6890 Series, Columm:
DB-5 MS.
세포내 H2O2 생성 측정
Raw 264.7 세포를 10 ml의 Krebs buffer 용액에 suspend 시 킨 후 20 µM DCF-DA를 가하고 1시간 빛을 차단한 곳에서 배 양하였다. DCF-DA가 없는 Krebs 용액으로 한번 세척한 후 105 cells/ml로 분주하고 Pine Needles(PN)과 Pine Twigs(PT) essential oil, 또 oil의 구성성분들을 전처치 한 후 silica 1 mg/ml 을 가하여 30분간 H2O2 생성을 유도하였다. 원심분리 후 cell pellet을 200 µl의 Krebs 용액에 분산시킨 후 형광(Ex: 485 nm;
Em: 535 nm)을 측정하였다.24)
세포내 hydroxyl radical 생성 측정
Raw 264.7 세포를 10 ml의 Krebs buffer 용액에 suspend 시 킨 후 10 µM DHR를 가하고 30분간 빛을 차단한 곳에서 배양 하였다. DHR이 없는 Krebs 용액으로 한번 세척한 후 105cells/
ml로 분주하고 여러 농도의 Pine Needles(PN)과 Pine Twigs (PT) essential oil, 또 oil의 구성성분들을 전처치 한 후 silica 1 mg/ml을 가하여 30분간 hydroxyl radical 생성을 유도하였다.
원심분리 후 cell pellet을 200 µl의 Krebs 용액에 분산시킨 후 형광(Ex: 488 nm; Em: 515 nm)을 측정하였다.25)
통계처리
실험 결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였으며, 실험 성적은 non-paired Student's t test로 검정하였고 P 값이 5% 미만일 때 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
실험결과 및 고찰
Pinus densiflora essential oil의 구성 성분
분획한 pine essential oil과 표준정유성분의 GC/MS를 실시한 결과, needles oil에서 retention time이 4.09, 4.18, 4.32. 4.43, 4.57, 5.24, 6.17, 6.55, 7.41, 7.57, 8.10분의 각 peak가 mass
Fig. 3 − EI Mass spectrum of Pine essential oils at 4:10 (A), 4:34 (B). AutoSpec EBE mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) HP 6890 Series, Columm: DB-5 MS.
Fig. 4 − Anti-oxidant Activity of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) in the DPPH Assay. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
peak(m/z)와 상대면적비(relative area)로 보아 각각 α-pinene이 21.55%, camphene이 6.36%, β-pinene이 9.32 %, myrcene이 0.46%, limonene이 13.05%, terpinolene이 8.39%, α-terpineol 이 1.07%, bornyl acetate이 5.01%, α-copaene이 2.05%, caryophellene이 11.43%, humulene이 4.35%로 주요 구성성분 이라고 추정되었다(Fig. 1A and 1B). 또한 twigs oil에서 retention time이 4.09, 4.18, 4.34, 4.50, 4.59, 5.24, 6.16, 6.57, 7.41, 7.57, 8.10분의 각 peak가 mass peak(m/z)와 상대면적비 (relative area)로 보아 α-pinene이 17.25%, camphene이 4.29%, β-pinene이 22.36%, phellandrene이 1.03%, limonene이 14.99%, terpinolene이 2.92%, α-terpineol이 2.44%, bornyl acetate이 7.38%, α-copaene이 2.04%, caryophellene이 6.97%, humulene 이 1.95%로 주요 구성성분이라고 추정되었다(Fig. 2A and 2B).
이 결과는 E.J. Hong(2004) 등이 보고한 결과와 거의 동일하였다.
소나무 잎과 가지의 정유성분은 유사하지만, 특히 잎에는 α- pinene이, 줄기에서는 β-pinene이 가장 많이 함유되어 있었다.
DPPH 항산화 작용
소나무 잎과 가지 정유와 그의 구성성분들의 항산화 작용을 확인하기 위하여 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다.
양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 잘 알려진 Vitamin C를 이용하였다.
DPPH를 이용하여 essential oil의 항산화작용을 DPPH 라디 칼 변화율을 측정한 결과, 소나무 잎과 가지 정유는 1000 µg/ml 농도에서 대조군에 비교하여 각각 71.1±4.36(p<0.01) 및 67.6±4.95%(p<0.01)를 보여 유의성있는 DPPH 라디칼 소거작
Fig. 5 − Anti-oxidant activity of α-Pinene, Camphene, β-Pinene, Myrcene, Phellandrene, Terpinolene in the DPPH Assay. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
용이 있음을 나타내었다(Fig. 4). 그러나 이들의 DPPH 라디칼 소거율은 대조약물인 Vitamin C의 100 µM(35.9±1.66%, p<
0.01) 보다는 미약하였다. 또한 그의 성분들 12종류 중 phellandrene, terpinolene 및 myrcene이 1000 µM에서 각각 84.1±1.54(p<0.01), 87.5±0.99 및 95.6±2.56%로 유의성있는 항산화작용이 있었을 뿐 나머지 9종의 정유들은 1000 µM에서도 유의성있는 변화가 없었다(Fig. 5).
NBT/XO 항산화 작용
소나무 잎과 가지 정유와 그의 구성성분들의 항산화 작용을 확인하기 위하여 xanthine oxidase에 의한 superoxide의 소거반 응을 관찰하였다. Superoxide radical의 소거활성은 nitroblue tetrazolium(NBT)의 환원과 coupling한 hypoxanthine-xanthine oxidase system을 이용하여 측정하였다.
소나무 가지 정유는 1, 10, 100 µg/ml에서 superoxide radical 의 소거율이 각각 91.2±2.05, 91.3±3.41, 87.9±1.97%로서 유의 성있는 농도의존적 항산화작용이 있었다(Fig. 6). 또한 소나무 잎 정유는 100 µg/ml에서 superoxide radical의 소거율이 91.9±3.56%
(p<0.05)로서 유의성있는 항산화작용이 있었다(Fig. 6). 그러나 xanthine oxidase 억제제로 알려진 allopurinol 10 µM에서 대조 군에 비해 57.0±1.74%(p<0.01)의 라디칼 소거활성을 보인 것 에 비하면 이들의 효능은 아주 미약하였다. 이들의 정유성분중 α-pinene, myrcene은 100 µM에서 각각 89.7±3.44, 90.6±5.06%
로서 유의성있는 항산화작용이 있었다. 그러나 그 외의 정유성 분들은 별다른 영향을 주지 않았다(Fig. 7).
Fig. 7 − Anti-oxidant activity of α-Pinene, Myrcene, Phellandrene, Terpinolene in the NBT/Xanthine Oxidase Assay. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
Fig. 6 − Anti-oxidant Activity of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) in the NBT/Xanthine Oxidase Assay.
Results are means±SD from 6 separate experiments.
Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
Hyaluronidase 활성에 미치는 영향
Hyaluronidase는 hyaluronic acid(an unbranched polys- accharide consisting of repeated β-D-glucuronic acid/β-N- acetyl-D-glucosamine disaccharide units)를 가수분해하는 효소 이다. Hyaluronic acid는 피부의 보습 기능에 있어서 중요한 작 용을 하는 물질로 자기보다 200배에 해당하는 수분을 함유할 수
Table I − Effect of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) on Hyaluronidase activity
Treatments Concentrations
(µg/ml) Hyaluronidase activity (% inhibition)1 Blank -
Vit C (µM) 001 17.7±10.7*
010 25.9±15.3*
100 31.7±11.0**
PN 001 27.0±10.2**
010 29.4±18.7**
100 17.2±11.9*
PT 001 35.3±9.8**
010 43.0±7.2**
100 31.4±11.1**
1
Blank OD595 is the absorbance of medium with hyaluronic acid.
Control OD595 is the absorbance after incubation of blank medium with hyaluronic acid and 100 units/ml of hyaluronidase.
Results are means±SD from 6 separate experiments.
Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
Inhibition %( )=100- Blank OD595-Sample OD595 Blank OD595-Control OD595 --- 100×
Table II − Effect of α-Pinene, β-Pinene, Myrcene, Phellandrene, Terpineolene on Hyaluronidase activity
Treatments Concentrations
(µM) Hyaluronidase activity (% inhibition)1
Blank -
α-Pinene 001 36.4±4.1**
010 40.2±9.2**
100 32.5±8.4**
β-Pinene 001 39.2±6.7**
010 36.9±1.8**
100 32.9±12.7**
Myrcene 001 39.4±12.3**
010 36.4±4.0**
100 32.4±5.9**
Phellandrene 001 37.7±9.5*
010 36.5±11.3*
100 45.4±7.9*
Terpinolene 001 26.8±11.1
010 39.0±10.9**
100 40.3±7.7**
1
Blank OD595 is the absorbance of medium with hyaluronic acid.
Control OD595 is the absorbance after incubation of blank medium with hyaluronic acid and 100 units/ml of hyaluronidase.
Results are means±SD from 6 separate experiments.
Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
Inhibition %( )=100- Blank OD595-Sample OD595 Blank OD595-Control OD595 --- 100×
Fig. 8 − Effect of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) on Elastase activity. Results are means±SD from 6 separate experiments. C: control, E: Elastase. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
있는 능력을 가진 물질로서 피부에서 이 물질의 감소는 피부가 건조되는 원인이 되기도 한다. 따라서 haluronidase activity를 측 정하여 정유가 그 활성에 미치는 영향을 실험한 결과, 다음과 같 이 억제하였다.
소나무 잎과 줄기 정유와 그의 구성정유성분들의 hyaluronidase 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 잎과 가지는 10 µg/ml에서 29.4±18.7, 43.0±7.2%(p<0.01)로 유의성있게 강한 hyaluronidase 활성억제 작용을 보였다. 구성성분들 중 α-pinene은 10 µM에서 40.2±9.2%(p<0.01), β-pinene과 myrcene은 1 µM에서 각각 39.2±6.7(p<0.01), 39.4±12.3%(p<0.01), phellandrene과 ter- pinolene은 100 µM에서 각각 45.4±7.9(p<0.05), 40.3±7.7%
(p<0.01)로 유의성있는 억제효과를 나타냈다. Pine twigs(PT)와 위 5성분들은 대조약물인 Vitamin C가 100 µM에서 31.7±11.0%
(p<0.01)의 억제작용을 보이는 것보다 hyaluronic acid가 가수분 해되는 것을 더 강하게 억제하였다(Table I, II).
Elastase 활성에 미치는 영향
피부 노화에 있어서 항산화 활성과 연관성이 있는 활성산소로 인한 결합조직 섬유의 손상을 볼 수 있다. Elastin은 피부 조직 의 탄력성을 나타내는 결합 조직 섬유로 관여하고 elastin을 가 수분해하는 elastase는 피부 주름과 연관성이 있는 효소이다. 따 라서 소나무 잎과 가지 정유와 그의 구성정유성분들의 활성에 미 치는 영향을 관찰하였다.
Elastase는 control에 비하여 112.3%의 변화율을 보였고 소나
무 잎과 가지는 100 µg/ml에서 각각 106.1±4.6(p<0.01), 101.3
±1.0(p<0.01)%의 변화율로 억제하는 경향을 보였다(Fig. 8). 구 성성분 중에서는 phellandrene은 10 µM에서 104.6±9.2(p<
0.05), β-pinene이 100 µM에서 105.4±7.3(p<0.05)%로 유의성 있게 elastase 활성을 억제하였다. Terpinolene은 10 µM에서 104.2±7.5%의 변화율을 보였으나 유의성은 없었다(Fig. 9). 대 조약물인 Vitamin C 100 µM에서 103.4±1.9(p<0.05)%의 변화 율과 비교하였을 때 거의 유사하게 elastase 활성을 억제하였다 (Fig. 8).
Silica에 의한 세포내 H2O2생성에 미치는 영향
소나무 잎과 가지 정유와 그의 구성성분들의 silica에 의한 세 포내 H2O2생성을 관찰한 결과, silica 1 mg/ml과 RAW 264.7 세
Fig. 10 − Effects of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) on silica-induced intracellular H2O2 generation in RAW 264.7 cells. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control,
* P<0.05.
Fig. 9 − Effect of β-Pinene, Phellandrene, Terpinolene on Elastase activity. Results are means±SD from 6 separate experiments. C: control, E: Elastase. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
포를 배양하면 H2O2생성을 121.4% 증가시켰으나, 소나무 잎과 가지 정유는 10 µg/ml에서 각각 84.1±6.1, 83.2±5.9%의 H2O2 생성을 보여주어 미약한 항산화작용이 있었다(Fig. 10). 구성성 분 중 terpinolene은 10 µM에서 83.7±4.5%, α-pinene, myrcene, phellandrene은 100 µM에서 각각 92.5±6.9, 80.1±2.2, 76.6±
7.9%로서 유의성있는 억제작용이 있었다(Fig. 11). α-Pinene과 phellandrene은 silica에 의한 세포내 H2O2 생성을 농도의존적으 로 억제하였다. 다른 성분들은 H2O2생성에 별다른 영향을 미치 지 못하였다.
Silica에 의한 세포내 hydroxyl radical 생성에 미치는 영향 소나무 잎과 가지 정유와 그의 구성성분들의 silica에 의한 세 포내 Hydroxyl radical 생성을 관찰한 결과, silica 1 mg/ml은 RAW 264.7 세포에서 hydroxyl radical 생성을 539.3% 증가시켰 으나, 소나무 잎과 줄기 정유는 10 µg/ml에서 hydroxyl radical 생성이 각각 89.8±1.7, 88.0±5.7%로서 유의성있는 억제효과가 있었다(Fig. 12). 구성성분 중 myrcene과 phellandrene은 100 µM 에서 hydroxyl radical 생성이 각각 76.1±11.1, 74.2±7.5%로 억 제되었고, silica에 의한 세포내 hydroxyl radical 생성을 농도의 존적으로 억제하였다. Hydroxyl radical 생성이 β-pinene 1 µM 에서 88.3±7.8%, terpinolene 10 µM에서 92.7±7.1%로서 억제 작용이 있었으나, 다른 정유성분들은 별다른 영향을 미치지 못 하였다(Fig. 13).
결 론
우리나라에 자원이 풍부한 소나무 자원을 활용하기 위한 목적
Fig. 11 − Effects of essential oils of α-Pinene, β-Pinene, Myrcene, Phellandrene, Terpineolene on silica-induced intracellular H2O2 generation in RAW 264.7 cells. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05.
Fig. 12 − Effects of essential oils of Pine Needles (PN) and Pine Twigs (PT) on silica-induced intracellular hydroxyl radical generation in RAW 264.7 cells. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05, ** P<0.01.
으로 소나무 잎과 가지의 정유와 그의 정유성분의 항산화 및 항 노화 작용에 관하여 실험하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 소나 무 잎과 그 가지는 수증기증류를 통하여 정유의 수득율은 각각 0.225 및 0.176%였으며, 이들 정유를 GC/MS와 TLC를 통하여 분석한 결과, 소나무 잎과 가지에는 각각 30종과 40종의 정유성 분이 함유되어 있었다. 이들 정유와 표품을 비교분석한 결과, 잎 에는 α-pinene(21.5%), 가지에는 β-Pinene(22.4%)이 가장 많이 함유되어 있었다. 그 외 소나무 잎에는 camphene, myrcene, limonene, terpinolene, α-terpineol, bornyl acetate, α-copaene, caryophellene, humulene, 가지에는 camphene, phellandrene, limonene, terpinolene, α-terpineol, bornyl acetate, α-copaene, caryophellene, humulene 등의 정유가 다량으로 함유되어 있었 다. 소나무 잎과 가지에서 분리한 정유혼합물과 정유표품의 항 산화 및 항노화 작용을 측정한 결과, 소나무 잎과 가지의 정유는 DPPH 라디칼 소거작용과 xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide 소거작용에서 유의성있는 항산화작용을 나타내었고, phellandrene, myrcene 및 α-pinene 등이 그 효능성분이었다. 또, 소나무 잎과 가지의 정유는 RAW 264.7 세포에서 silica 자극에 의해 증가된 세포내 H2O2생성과 hydroxyl radical 생성을 유의 성있게 억제하였고, 그 약효성분은 β-pinene과 terpinolene, myrcene, phellandrene 등이었다. 소나무 잎과 가지의 정유는 피 부보습과 탄력에 관련된 효소인 hyaluronidase와 elastase의 활 성을 유의성있게 억제하는 작용을 보였고 그 구성성분들 중 phellandrene과 β-pinene이 약효성분이었다.
따라서 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 소나무 잎과 가지의 정
유는 항산화 작용이 있고, 특히 피부 주름 방지제 등과 같은 기 능성 화장품의 원료로 개발에 효과적이라고 사료된다.
참고문헌
1) Li, Q., Kobayashi, M., Inagaki, H., Hirata, Y., Li, Y. J., Hirata, K., Shimizu, T., Suzuki, H., Katsumata, M., Wakayama, Y., Kawada, T., Ohira, T., Matsui, N. and Kagawa, T. : A day trip to a forest park increases human natural killer activity and the expression of anti-cancer proteins in male subjects. J. Biol.
Regul. Homeost Agents 24, 157 (2010).
2) Burits, M. and Bucar, F. : Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil. Phytother. Res. 14, 323 (2000).
3) Grassmann, J., Hippeli, S., Dornisch, K., Rohnert, U., Beuscher, N. and Elstner, E. F. : Antioxidant properties of essential oils. Possible explanations for their anti-inflammatory effects. Arzneimittelforschung 50, 135 (2000).
4) Hong, E. J., Na, K. J., Choi, I. G., Choi, K. C. and Jeung, E. B. : Antibacterial and antifungal effects of essential oils from coniferous trees. Biol. Pharm. Bull. 27, 863 (2004).
5) Koukos, P. K., Papadopoulou, K. I., Patiaka, D. T. and Papagiannopoulos, A. D. : Chemical composition of essential oils from needles and twigs of balkan pine (Pinus peuce grisebach) grown in Northern Greece. J. Agric. Food Chem. 48, 1266 (2000).
6) Jung, M. J., Chung, H. Y., Choi, J. H. and Choi, J. S. : Antioxidant principles from the needles of red pine, Pinus densiflora. Phytother. Res. 17, 1064 (2003).
Fig. 13 − Effects of essential oils of α-Pinene, β-Pinene, Myrcene, Phellandrene, Terpineolene on silica-induced intracellular hydroxyl radical generation in RAW 264.7 cells. Results are means±SD from 6 separate experiments. Significantly different from control, * P<0.05,
** P<0.01.
7) Jang, M. J., An, B. J., Lee, C. E., Lee, B. G. and Lee, D. H. : Study on the anti-oxidant effect of Pinus rigida Mill. inner bark extracts. J. Kor. For. Soc. 97, 88 (2008).
8) Kim, S. M., Cho, Y. S., Sung, S. K., Lee, I. G., Lee, S. H. and Kim, D. G. : Antioxidative and nitrite scavenging activity of pine needle and green tea extracts. Kor. J. Food Sci. Anim.
Resour. 22, 13 (2002).
9) Yoo, J. H., Cha, J. Y., Jeong, Y. K., Chung, K. T. and Cho, Y. S. : Antioxidative effects of pine (Pinus densflora) needle extracts.
J. Life Sci. 14, 863 (2004).
10) Choi, E. M. : Antinociceptive and antiinflammatory activity of pine (Pinus densflora) pollen extract. Phytother. Res. 21, 471 (2007).
11) Choi, H. S., Hang, D., Kang, S. C., Sohn, E. S., Lee, S. P., Pyo, S. K. and Son, E. W. : Immunomodulatory activity of pine needle (Pinus densflora) extracts in macrophages. J. Food Sci.
Nutr. 11, 105 (2006).
12) Jeon, J. R., Kim, J. Y., Lee, K. M. and Cho, D. H. : Anti-obese effects of mixture contained pine needle, black tea, and green tea extracts. J. Kor. Soc. Appl. Biol. Chem. 48, 375 (2005).
13) Choi, J. H., Kim, D. I., Park, S. H., Back, S. J., Kim, N. J., Cho, W. K., Kim, K. J. and Kim, H. S. : Effects of pine needle ethyl acetate fraction on acetylcholine (ACh) and its related enzymes in brain of rats. Kor. J. Nutr. 37, 95 (2004).
14) Mumm, R., Tiemann, T., Schulz, S. and Hilker, M. : Analysis of volatiles from black pine (Pinus nigra): significance of wounding and egg deposition by a herbivorous sawfly.
Phytochem. 65, 3221 (2004).
15) Lazutka, J. R., Mierauskiene, J., Slapsyte, G. and Dedonyte, V. : Genotoxicity of dill (Anethum graveolens L.), peppermint (Menthaxpiperita L.) and pine (Pinus sylvestris L.) essential oils in human lymphocytes and Drosophila melanogaster. Food Chem. Toxicol. 39, 485 (2001).
16) Muhlbauer, R. C., Lozano, A., Palacio, S., Reinli, A. and Felix, R. : Common herbs, essential oils, and monoterpenes potently modulate bone metabolism. Bone 32, 372 (2003).
17) Macchioni, F., Cioni, P. L., Flamini, G., Morelli, I., Perrucci, S.,
Franceschi, A., Macchioni, G. and Ceccarini, L. : Acaricidal activity of pine essential oils and their main components against Tyrophagus putrescentiae, a stored food mite. J. Agric.
Food Chem. 50, 4586 (2002).
18) Ando, Y. : Breeding control and immobilizing effects of wood microingredients on house dust mites. Nippon Koshu Eisei Zasshi. 41, 741 (1994).
19) Berrabah, M., Andre, D., Verite, P., Zahidi, A. and Lafont, O. : Aminoglutethimide included in nanocapsules suspension:
comparison of GC-MS and HPLC methods for control. J.
Pharm. Biomed Anal. 35, 761 (2004).
20) McCune, L. M. and Johns, T. : Antioxidant activity in medicinal plants associated with the symptoms of diabetes mellitus used by the Indigenous Peoples of the North American boreal forest. J. Ethanopharmacol. 82, 197 (2002).
21) Mariencheck, M. C., Davis, E. C., Zhang, H., Ramirez, F., Rosenbloom, J., Gibson, M., Parks, W. C. and Mecham, R. P. : Fibrillin-1 and fibrillin-2 show temporal and tissue-specific regulation of expression in developing elastic tissues. Connect Tissue Res. 31, 87 (1995).
22) Yoshihiro, O., Shingo, T., Minoru, A., Akira, I., Ryoji, K. and Izumi, H. : Expression of elastin-related proteins and matrix metalloproteinases in actinic elastosis of sun-damaged skin.
Arch. Dermatol. Res. 292, 27 (2000).
23) Ciesla, D. J., Moore, E. E., Biffl, W. L., Gonzalez, R. J. and Silliman, C. C. : Hypertonic saline attenuation of the neutrophil cytotoxic response is reversed upon restoration of normotonicity and reestablished by repeated hypertonic challenge. Surgery 129, 567 (2001).
24) Huang, H. M., Zhang, H., Ou, H. C., Chen, H. L., Gibson, G. E. : alpha-Keto-beta-methyl-n-valeric acid diminishes reactive oxygen species and alters endoplasmic reticulum Ca(2+) stores. Free Radic. Biol. Med. 37, 17 (2004).
25) Jacob, C., Arteel, G. E., Kanda, T., Engman, L. and Sies, H. : Water-soluble organotellurium compounds: catalytic protection against peroxynitrite and release of zinc from metallothionein.
Chem. Res. Toxicol. 13, 3 (2000).
