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2016 년 2 월 석사학위 논문
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 효능 연구
조선대학교 대학원
약 학 과
서 수 호
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 효능 연구
Inhibitory effect of isorhamnetin on HIF-1a protein accumulation
2016 년 2 월 25 일
조선대학교 대학원
약 학 과
서 수 호
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 효능 연구
지도교수 신 상 미
이 논문을 약학 석사학위신청 논문으로 제출함
2015 년 10 월
조선대학교 대학원
약 학 과
서 수 호
i
CONTENTS
CONTENTS---i
LIST OF FIGURES---iii
ABBREVIATIONS---iv
ABSTRACT---v
1. 서론---1
2. 실험재료 및 방법---3
1. 시약 및 재료---3
2. 세포배양---3
3. SDS-Polyacrylamide 젤 전기영동방법 및 면역화학적 분석----4
4. HRE 리포터 유전자 분석---4
5. RNA 분리 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응법 (Real- Time RT-PCR)---4
6. 형질전환법---5
7. 면역침강법---5
8. 활성산소 측정법---6
ii
9. 세포 이동 및 침윤 분석---6
10. 통계처리---7
3. 실험결과---8
1. 이소람네틴의 HIF-1a 억제 효과---8
2. 이소람네틴의 HIF-1a 타겟 유전자 전사 억제 효과---11
3. 이소람네틴에 의한 HIF-1a 단백질 분해조절 관찰---13
4. 이소람네틴의 항산화 작용으로 인한 HIF-1a 억제 효과---16
5. 이소람네틴의 암세포 이동 및 침윤성 억제---19
4. 결론 및 고찰---22
5. 참고문헌---26
국문초록---31
iii
LIST OF FIGURES
Figure 1. Inhibition of HIF-1a accumulation by isorhamnetin---10
Figure 2. Repression of HIF-1a target gene expression by isorhamnetin---12
Figure 3. The effect of isorhamnetin on HIF-1a protein degradation---15
Figure 4. Antioxidant effect of isorhamnetin on HIF-1a accumulation---18
Figure 5. Inhibition of cancer cell migration and invasion by isorhamnetin---21
iv
ABBREVIATIONS
AMPK AMP-activated protein kinase CA-IX Carbonic anhydrase-IX CHX Cycloheximide
CoCl2 Cobalt(II) chloride
DCFH-DA 2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate ERK Extracellular signal-regulated kinase 4E-BP1 elF4E binding protein-1
5-FU 5-Fluorouracil GLUT1 Glucose transporter1 H2O2 Hydrogen peroxide
HIF-1a Hypoxia inducible factor-1a HRE Hypoxia response element LDH A Lactate dehydrogenase A mTOR Mammalian target of rapamycin MG132 Z-Leu-Leu-Leu-al
NAC N-acetyl-1-cysteine
Nrf2 NF-E2-related factor2 NF-kB Nuclear factor-kappaB PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PHD Prolyl hydroxylase
PDK1 Pyruvate dehydrogenase kinase1 ROS Reactive oxygen species
v
ABSTRACT
Inhibitory effect of isorhamnetin on HIF-1a protein accumulation
Suho Seo
Advisor : Prof. Sang Mi Shin, Ph.D.
College of Pharmacy,
Graduate School of Chosun University
Isorhamnetin is a type of flavonoid that is isolated from water dropwort (Oenanthe javanica, Umbelliferae). The beneficial effects including anti-oxidant, anti-inflammatory, and anti-
proliferative activity of isorhamnetin have been reported. This study further investigated that antioxidant effect of isorhamnetin could contribute to its anti-cancer efficacy in colon cancer cells. Isorhamnetin inhibited hypoxia or CoCl2-induced hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) accumulation in HCT116 and HT29 cells. Moreover, it also repressed CoCl2-induced hypoxia response element (HRE) reporter gene activity. Inhibition of HIF-1a level by isorhamnetin under hypoxia led to decrease of HIF-1a target gene expression such as glucose transporter1 (GLUT1), lactate dehydrogenase A (LDH A), carbonic anhydrase-IX (CA-IX) and pyruvate dehydrogenase kinase1 (PDK1). Isorhamnetin exerted a negative effect on HIF-1a protein stability, but ubiquitination of HIF-1a was not changed by isothanmetin. Isorhamnetin blocked efficiently CoCl2 or H2O2-induced ROS production, and H2O2-mediated HIF-1a accumulation.
vi
In addition, isorhamnetin or N-acetyl-1-cysteine (NAC) inhibited over-expressed HIF-1a in HEK293 cells, which implied anti-oxidant activity of isorhamnetin contributed HIF-1a regulation. Finally, anti-metastasis efficacy of isorhamnetin was examined by observation of migration and invasion in cancer cells. Treatment of isorhamnetin or NAC inhibited serum- induced cancer cells migration and invasion. Collectively, the present study demonstrates that isorhamnetin negatively regulate ROS-mediated HIF-1a accumulation and these effects lead to inhibition of cancer cell migration and invasion.
Key words: Isorhamnetin, Reactive oxygen species, Hypoxia-inducible factor-1a, Antioxidant, Cancer
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1. 서론
이소람네틴 (isorhamnetin)은 아시아와 호주의 습지에서 재배되어 식용으로 널리 사용되고 있는 미나리 (Oenanthe javanica, Umbelliferae)에서 추출한 플라보노이드 (flavonoids)계 물질이다 [1]. 다양한 조직에서 항염증, 항산화, 항암 효과 등 이소람네틴의 유용한 효능이 보고되고 있다 [2-4]. 이소람네틴은 랫트에서 염증유발물질인 carrageenan 에 의한 부종을 경감시켰고, 대식세포에서 nuclear factor- kappaB (NF-kB) 의존적인 염증 유전자의 발현을 억제하여 유의적인 항염 효능을 나타냈다 [2]. 또한 간세포에서는 NF-E2-related factor2 (Nrf2) 의존적인 항산화 유전자의 발현을 증가시켜, 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)에 의한 산화적인 스트레스를 방어하는 효능을 보였다 [3]. 뿐만 아니라, 폐암 세포주에서 Bax, Caspase-3 및 p53 신호를 포함하는 세포사멸 신호를 활성화하여 암세포의 성장을 억제하였다 [4]. 이소람네틴의 항염증 및 항산화 효능은 세포사멸을 유도하는 기전과 별도로 암의 성장 및 전이를 억제할 수 있는 또 다른 가능성을 제시한다.
그러나, 현재까지 이소람네틴의 항암 효능에 관한 연구는 암세포의 증식을 억제하는 기전에 국한되어 있으며, 암세포 특이적인 분자조절 기전 연구는 미흡하다.
암화된 세포의 성장과 전이를 조절하는 가장 중요한 단백질은 hypoxia inducible factor-1 (HIF-1)으로 인식된다 [5]. HIF-1a는 저산소 환경 시 축적되어, 암의 증식과 전이에 중요한 역할을 하는 다양한 유전자의 전사인자로 작용한다 [6]. 정상적인 산소 농도에서 HIF-1a는 prolyl hydroxylase (PHD)에 의해 수산화된 후, 유비퀴틴화가
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되어 프로테아좀에서 분해된다 [7]. 그러나 저산소 농도에 노출 시, HIF-1a의
단백질 안정성은 증가되어 HIF-1b와 결합한 후 핵 안으로 이동하여 전사인자로 작용하게 된다 [8]. HIF-1a의 전사조절을 받는 단백질은 세포증식, 세포생존,
세포사멸, 신생혈관형성, pH 조절, 포도당 대사 등에 관여하여, 암의 증식과 전이를 촉진한다 [9-11]. 따라서 HIF-1a는 암을 억제하기 위한 주요 분자 타겟으로
인식되고 있다.
다양한 천연물에서 HIF-1a를 억제하는 효능이 보고되고 있다. 플라보노이드계
물질인 히스피두린은 담낭암에서 AMP-activated protein kinase (AMPK) 활성화를 통해 HIF-1a를 억제하며 [12], 루테올린은 기관지 상피세포에서 활성산소를 억제하여 HIF-1a를 감소시킨다 [13]. 또한, 퀘세틴은 대장암 세포에서 AMPK 활성을
억제하여 저산소증으로 유도된 HIF-1a 전사 활성을 억제할 수 있다 [14].
이소람네틴은 퀘세틴의 대사체로 밝혀졌지만 [15], 현재까지 직접적인 HIF-1a 조절 기전에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
현재까지 이소람네틴의 항암 작용은 폐암, 간암, 위암 등에서 규명되었다 [4,16,17]. 세포사멸을 유도하고, DNA 절단 및 염색체 응축, NF-kB 신호 억제가 이소람네틴의 항암 기전으로 제시된다 [4,16,17]. 본 연구는 이소람네틴의 항암 효능을 대장암 세포를 활용하여 검증하고자 했으며, 암을 억제하는 타겟으로 이소람네틴이 HIF-1a의 단백질을 직접 조절할 수 있는지 검증하고자 하였다. 또한 이소람네틴의 항산화 효능이 암을 억제하는데 기여할 수 있는지 관찰하고자 하였다. 궁극적으로 이소람네틴이 암의 성장 뿐만 아니라 암의 이동과 침윤을 억제하는 효능을 갖는지 관찰하고자 하였다.
- 3 -
2. 실험재료 및 방법
1. 시약 및 재료
이소람네틴은 O. javanica 에서 추출하고 순도를 검증하였다 [2]. HIF-1a 항체는 BD Biosciences (San Josa, CA)에서, HIF-1b 항체는 Proteintech (Chicago, IL)에서, ubiquitin 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하였다. Actinomycin D, cobalt(II) chloride (CoCl2), 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCHF-DA), hydrogen peroxide (H2O2), N-acetyl-l-cysteine (NAC), quercetin, b-actin 항체는 Sigma Chemicals (St.
Louis, MO)에서 구입하였다. Cycloheximide (CHX), chloroquine, 5-fluorouracil (5-FU), leupeptin 은 Calbiochem (San Diego, CA)에서 구입하였다.
2. 세포배양
HCT116, HT29 및 HEK293 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였다. HCT116 와 HT29 세포는 10% 우태혈청 (fetal bovine serum, FBS), 50 units/mL 페니실린 및 50 mg/mL 스트랩토마이신이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)으로, HEK293 세포는 추가로 비필수아미노산 (nonessential amino acids, NEAA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포는 6 well plate 에 well 당 1×105 으로 배양하고, 2-3 일 뒤 (i.e. 80% 포화도) 실험하였다. 세포의 저산소상태는 저산소 배양기 (Galaxy 48 R, Eppendorf Company, Hamburg, Germany)에서 37℃, 1% O2, 5% CO2로 배양하였다.
- 4 -
3. SDS-Polyacrylammide 젤 전기영동법 및 면역화학적 분석
획득한 세포의 단백질 추출물은 이전에 확립된 절차에 따라 분리하고, 6% 및 7.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분석하였다 [18].
단백질은 전기영동장치를 이용하여 nitrocellulose 막으로 전이하였다. 단백질이 전이된 막을 1 차 항체와 반응시키고, 4℃에서 하룻밤을 보낸 후 1 시간 동안 2 차 항체와 반응하였다. 단백질 밴드는 ECL chemiluminescence system (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 분석하였으며, 동일한 양의 단백질로 분석하였음을 b-actin 으로 확인하였다.
4. HRE 리포터 유전자 분석
HIF-1a promoter 영역인 저산소 반응 요소 (hypoxia response element, HRE)를 인간 폐암세포인 A549 에 형질전환 하였다 [19]. HRE-A549 세포주를 12 well plate 에 well 당 1×104으로 배양하고, 2-3 일 뒤 (i.e. 80% 포화도) 실험하였다. 발광효소활성 (Luciferase activity)은 dual-luciferase reporter assay system (Promega, Madison, WI)을 첨가하여 측정하였다.
5. RNA 분리 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응법 (Real-Time RT- PCR)
RNA 분리는 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. RNA 역전사는 Oligo(dT)16 를 프라이머로 사용하여 cDNA 를 얻었다.
획득한 cDNA 는 PCR 프리믹스 (Bioneer, Daejeon, Korea)와 thermal cycler (Bio-Rad,
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Hercules, CA)를 사용하여 증폭시켰다. RNA 역전사 과정을 통해 획득한 cDNA 를 5 배 희석하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응분석은 Fast SYBR green master (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하였으며, 분석값의 대조군으로 GAPDH 를 사용하였다. 프라이머는 Bioneer 사에서 합성 제작되었으며, 서열은 다음과 같다;
human glucose transporter1 (GLUT1) 5’-CGGGCCAAGAGTGTGCTAAA-3’ (forward) and 5’-TGACGATACCGGAGCCAATG-3’ (reverse); human Lactate dehydrogenase A (LDH A) 5’- AGCCCGATTCCGTTACCT-3’ (forward) and 5’-CACCAGCAACATTCATTCCA-3’
(reverse); human carbonic anhydrase-IX (CA-IX) 5’-CTTGGAAGAAATCGCTGAGG-3’
(forward) and 5’-TGGAAGTAGCGGCTGAAGTC-3’ (reverse); human pyruvate dehydrogenase kinase1 (PDK1) 5’-ACAAGGAGAGCTTCGGGGTGGATC-3’ (forward) and 5’-CCACGTCGCAGTTTGGATTTATGC-3’ (reverse); human GAPDH 5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (forward) and 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’
(reverse).
6. 형질전환법
세포를 6 well plate 에 배양하여 하룻밤을 보낸 뒤, 3 시간 동안 혈청 고갈을 하였다. FuGENE HD reagent (Promega, Madison, WI)를 이용하여 HIF-1a 플라스미드를 넣고 6 시간을 보낸 뒤, 1% FBS 가 포함된 Eagle’s minimum essential medium (MEM)을 넣고 하룻밤 동안 배양하였다.
7. 면역침강법
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HIF-1a의 유비퀴틴화를 확인하기 위해 세포에 유비퀴틴 플라스미드를 형질전환 시켰다. 세포의 단백질 추출물 (1.5 mg)은 HIF-1a 항체를 반응시키고, 4℃에서 하룻밤을 보냈다. 이후 protein G-agarose 를 넣고 2 시간을 보낸 후, 항원-항체 복합체를 2×Laemmli 버퍼에 녹이고 5 분간 끓여주었다. 시료의 상층액을 6% 겔 전기영동법으로 분석하였으며, 유비퀴틴 항체로 immunobloting 하였다.
8. 활성산소 측정법
세포를 12 well plate 에 배양 한 후, DCFH-DA 를 활성산소 생성량을 측정하기 1 시간 전에 염색한 뒤 트립신 처리를 통해 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 PBS 로 세척한 뒤 485-525 nm 파장에서 형광 리더기 (Gemini XPS, Molecular Device, Sunnyvale, CA)를 이용하여 활성산소 생성량을 측정하였다. 활성산소 생성량은 각각의 단백질 농도로 보정하였다. [i.e. 활성산소 생성량 = {(실험군의 형광세기 – 바탕값의 형광세기) / 실험군의 단백질 농도} / {(대조군의 형광세기 – 바탕값의 형광세기) / 대조군의 단백질 농도}]
9. 세포 이동 및 침윤 분석
세포 이동 분석은 8 mm transwell 을, 세포 침윤 분석은 matrigel 이 도포된 8 mm transwell 을 사용하였다. 필터 아랫면에 1 형 콜라겐을 도포하고 하룻밤 동안 건조시킨 후, 준비된 필터를 24 well plate 에 삽입하였다. 필터의 아래칸에는 1%
소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 배지를 채우고, 필터의 윗칸에는 HCT116 세포를 배양하였다. 양성 대조군으로 5-FU 를 처리하였다 [20,21]. 필터의
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멤브레인을 분리한 뒤, 차가운 메탄올로 고정시켜준다. 고정된 메탄올에 0.5%
크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 100× 현미경을 이용하여 사진을 찍고, 세포의 수를 정량하였다.
10. 통계처리
각각의 그룹에 대해 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하여 유의성 여부를 평가하였다. 데이터는 평균±S.E 로 표기하였으며 통계적 기준은 p < 0.05, p
< 0.01 일 때 유의성 있는 차이가 있는 것으로 분석하였다.
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3. 실험결과
1. 이소람네틴의 HIF-1a 억제 효과
이소람네틴의 HIF-1a 억제 효능을 확인하기 위해 인간 대장암 세포인 HCT116 과 HT29 에 HIF-1a 를 유도하는 CoCl2 (100 mM)를 도입하여 효과를 관찰하였다. HCT116
세포에 CoCl2 를 처리하였을 때 HIF-1a의 축적이 증가하였으며, 이소람네틴 (30 mM)은 증가된 HIF-1a를 감소시켰다 (Fig 1A, 왼쪽). 그러나 이소람네틴의 대사 전구체인 퀘세틴 (30 mM)에 의한 HIF-1a 억제 효능을 관찰할 수 없었다 (Fig 1A, 왼쪽). 다른 대장암 세포인 HT29 에서는 이소람네틴과 퀘세틴 모두 CoCl2 에 의한 HIF-1a의 축적을 감소시켰다 (Fig 1A, 오른쪽). 이소람네틴이 HIF-1a의 축적을 억제하는 현상은 용량 의존적으로 관찰되었다 (Fig 1B). HCT116 세포에서는 이소람네틴 10 mM 부터 (Fig 1B 왼쪽), HT29 세포에서는 이소람네틴 30 mM 부터 (Fig 1B, 오른쪽) 각각 유의성 있는 HIF-1a 억제 효과를 보였다. 다음으로, 저산소 상태에 의한 HIF-1a 유도를 위해 세포를 1% O2 에 노출시켰다. HCT116 세포에 저산소 상태를 3 시간 주었을 때 HIF-1a의 축적이 증가되었으나, 이소람네틴은 이를 감소시켰다 (Fig 1C, 왼쪽). 퀘세틴을 처리하였을 때에도 유의성 있는 HIF-1a
억제 효과가 관찰되었다 (Fig 1C, 왼쪽). 저산소 상태에 노출시킨 HT29 세포에서도 이소람네틴과 퀘세틴은 HIF-1a를 통계적으로 유의성 있게 감소시켰다 (Fig 1C, 오른쪽). 종합하여, 이소람네틴은 두 가지 대장암 세포주에서 CoCl2 혹은 저산소 유도성 HIF-1a를 억제함을 확인할 수 있었다.
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Figure 1. Inhibition of HIF-1a accumulation by isorhamnetin
(A) HCT116 (left) and HT29 (right) cells were treated isorhamnetin (30 mM) or quercetin (30 mM) for 1 h and continuously incubated with CoCl2 (100 mM) for 6 h (HCT116) and 3 h (HT29). Data represent the mean ± S.E of 4 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or CoCl2 alone, ## p < 0.01).
(B) HCT116 (left) and HT29 (right) cells were treated isorhamnetin (3-60 mM) for 1 h and continuously incubated with CoCl2 (100 mM) for 6 h (HCT116) and 3 h (HT29). Data represent the mean ± S.E of 5 (HCT116) and 4 (HT29) replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or CoCl2 alone, # p < 0.05, ## p < 0.01).
(C) HCT116 (left) and HT29 (right) cells were treated isorhamnetin (30 mM) or quercetin (30 mM) for 1 h and continuously incubated in hypoxic conditions (1% O2) for 3 h. Data represent the mean ± S.E of 3 (left) and 4 (right) replicates (significant compared to 21% O2-exposed control, ** p < 0.01 or hypoxia alone, # p < 0.05, ## p < 0.01).
- 11 -
2. 이소람네틴의 HIF-1a 타겟 유전자 전사 억제 효과
이소람네틴의 HIF-1a 전사활성 억제를 확인하기 위해 HIF-1a 프로모터 영역인 HRE 가 형질전환 되어있는 A549 세포를 사용하였다 [19]. CoCl2 (100 mM)는 HRE 리포터 유전자 활성을 유의적으로 증가시켰으며, 이소람네틴 (30 mM)은 이러한 증가를 억제시켰다 (Fig 2A). 더 나아가 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 이소람네틴이 HIF-1a 타겟 유전자의 발현을 조절하는지 검증하였다. 저산소 상태를 3 시간 유지 하였을 때 HIF-1a 타겟 유전자인 GLUT1, LDH A, CA-IX 및 PDK1 이
증가하였으나, 이소람네틴 (30 mM)은 이러한 변화를 유의성 있게 억제하였다 (Fig 2B). 이러한 결과는 이소람네틴이 HIF-1a의 전사활성을 억제하고, HIF-1a 타겟 유전자의 전사발현을 억제할 수 있음을 의미한다.
- 12 -
Figure 2. Repression of HIF-1a target gene expression by isorhamnetin
(A) HRE-A549 cells that had been stably transfected with the HRE-luciferase construct were incubated with isorhamnetin (30 mM) and CoCl2 (100 mM) for 24 h. Data represent the mean ± S.E from at least 3 times (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or CoCl2
alone, # p < 0.05).
(B) HCT116 cells were treated with isorhamnetin (IsoR, 30 mM) for 1 h and continuously incubated in hypoxic conditions (1% O2) for 3 h. Data represent the mean ± S.E of 4 replicates (significant compared to 21% O2-treated control, ** p < 0.01 or hypoxia alone, # p < 0.05, ## p <
0.01).
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3. 이소람네틴에 의한 HIF-1a 단백질 분해에 미치는 효과
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 경로를 확인하기 위해 HIF-1a 단백질 안정성을 관찰하였다. CHX 는 단백질 합성을 억제하는 화합물로 CoCl2 로 HIF-1a를 누적시킨 이후 추가적인 HIF-1a 단백질 합성을 억제하기 위해 사용되었다. CoCl2 (100 mM)를 처리하여 HIF-1a를 유도한 후 CHX (0.5 mg/mL)를 처리하여, 축적된 HIF- 1a의 분해가 일어나는 것을 확인하였다. 모든 관찰 시간에서 이소람네틴 (30 mM)을 같이 처리하였을 때 HIF-1a의 단백질 양이 감소되어 관찰되었다 (Fig 3A). 이러한 변화가 대표적인 HIF-1a 조절기전인 유비퀴틴화에서 비롯되는지 관찰하고자, 유비퀴틴을 과발현한 세포에서 MG132 (10 mM)를 사용하여, 프로테아좀의 분해 기능을 억제시키고 HIF-1a를 관찰하였다. 면역침강법을 통해 유비퀴틴화된 HIF- 1a를 관찰한 결과, 이소람네틴의 영향은 관찰할 수 없었다. 그러나, HIF-1a 의
단백질 양은 여전히 이소람네틴에 의해 감소되는 결과를 보였다 (Fig 3B). 다른 HIF-1a 분해 경로가 관여하는지 관찰하고자, 라이소좀 억제제인 클로로퀸 (50 mM)과 류펩틴 (50 mg/mL)을 처리하여 HIF-1a를 누적시켜 이소람네틴의 효과를
관찰하였다 [22-23]. 이소람네틴 (30 mM)은 라이소좀 억제제에 의해 축적된 HIF- 1a도 감소시켰다 (Fig 3C). 이러한 결과는 이소람네틴에 의한 HIF-1a의 감소 경로에 단백질의 분해를 촉진하는 과정이 관여하는 것은 아니라는 사실을 지지한다.
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Figure 3. The effect of isorhamnetin on HIF-1a protein degradation
(A) HCT116 cells that had been incubated with CoCl2 (100 mM) or CoCl2 with isorhamnetin (30 mM) were treated with cycloheximide (CHX, 0.5 mg/mL) for the indicated time periods and subjected to immunoblotting for HIF-1a.
(B) HCT116 cells that had been transfected with the plasmid ubiquitin were incubated with MG132 (10 mM) for 3 h and treated with vehicle or isorhamnetin (30 mM) for 1 h and continuously exposed to CoCl2 (100 mM) for 6 h. HIF-1a was immunoblotting in the cell lysates.
(C) HCT116 cells were treated with chloroquine (50 mM) or leupeptin (50 mg/mL) for 6 h and continuously incubated with isorhamnetin (30 mM) for 6 h. Data represent the mean ± S.E of 3 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or chloroquine or leupeptin alone, # p < 0.05, ## p < 0.01).
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4. 이소람네틴의 항산화 작용으로 인한 HIF-1a 억제 효과
이소람네틴의 많은 효능들은 항산화 효과를 매개로 하며 [3], HIF-1a는 항산화 효과에 의해 감소될 수 있음이 보고되었다 [24-27]. 이를 토대로 이소람네틴의 항산화 효능이 축적된 HIF-1a를 감소시킬 수 있는지 관찰하였다. 이소람네틴의 항산화 효능은 활성산소를 직접 측정하여 확인하였다. CoCl2 (100 mM)를 30 분 처리했을 때 활성산소가 증가하였으며, 증가된 활성산소는 이소람네틴 (30 mM)에 의해 감소하였다 (Fig 4A). 이소람네틴의 활성산소 억제효과는 H2O2 (500 mM) 노출에서도 관찰되었다 (Fig 4B). 이어서 활성산소를 통한 HIF-1a의 축적 및 이에 대한 이소람네틴의 효과를 확인하였다. H2O2 (500 mM)를 1 시간 처리했을 때 HIF- 1a가 축적되었으며, 이소람네틴 (30 mM)은 축적된 HIF-1a를 감소시켰다 (Fig 4C).
또한, HEK293 세포에 HIF-1a 를 과발현 한 후, 이소람네틴 및 항산화제인 NAC 이 직접 HIF-1a를 감소시키는지 확인하였다. 이소람네틴과 NAC 는 과발현에 의해 축적된 HIF-1a를 유의성 있게 감소시켰다 (Fig 4D). 이러한 결과들은 이소람네틴에 의한 HIF-1a 의 감소가 항산화 효과에서 비롯될 수 있다는 가능성을 의미한다.
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Figure 4. Antioxidant effect of isorhamnetin on HIF-1a accumulation
(A) HCT116 cells were treated with isorhamnetin (30 mM) for 1 h and continuously incubated with CoCl2 (100 mM) for 30 min. ROS were determined by flow cytometry using DCFH-DA staining. Data represent the mean ± S.E of 9 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or CoCl2 alone, ## p < 0.01).
(B) HCT116 cells were treated with isorhamnetin (30 mM) for 1 h and continuously incubated with H2O2 (500 mM) for 10 min. ROS were determined by flow cytometry using DCFH-DA staining. Data represent the mean ± S.E of 9 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or H2O2 alone, ## p < 0.01).
(C) HCT116 cells were treated with isorhamnetin (30 mM) for 1 h and continuously incubated with H2O2 (500 mM) for 1 h. Data represent the mean ± S.E of 6 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or H2O2 alone, # p < 0.05, ## p < 0.01).
(D) HEK293 cells that had been transfected with the plasmid pCDNA or HIF-1a (3 mg) were treated with isorhamnetin (30 mM) and NAC (5 or 10 mM) for 6 h. Data represent the mean ± S.E of 3 replicates (significant compared to pCDNA-transfected control, ** p < 0.01 or HIF-1a overexpressed cells, # p < 0.05, ## p < 0.01).
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5. 이소람네틴에 의한 암세포 이동 및 침윤성 억제
이소람네틴에 의한 항암 효능을 in vitro 세포 이동성 및 침윤성 평가를 통해 확인하였다. HCT116 세포를 10% FBS 에 노출하여 이동을 유도한 후 살아있는 세포를 염색하여 관찰하였다. 이소람네틴 (30 mM)과 NAC (10 mM)을 처리하였을 때 transwell 을 통해 이동한 세포의 수가 감소함을 확인하였다 (Fig 5A). 다음으로 matrigel 을 도포한 transwell 을 활용하여 침윤성을 관찰하였다. 세포에 10%
FBS 자극을 주었을 때 HCT116 세포의 침윤성이 증가하였으나, 이소람네틴 (30 mM)과 NAC (10 mM)은 이러한 침윤성을 억제하였다 (Fig 5B). 대장암에서 사용되는 항암제인 5-FU 는 암의 이동 및 침윤을 억제할 수 있는 양성 대조군으로 사용하였다 [20,21]. 이러한 결과는 암세포의 이동과 침윤이 항산화 효능을 통해 억제될 수 있으며, 이소람네틴은 암의 전이를 억제할 수 있는 효능을 갖추고 있음을 시사한다.
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Figure 5. Inhibition of cancer cell migration and invasion by isorhamnetin
(A) HCT116 cells were treated with isorhamnetin (IsoR, 30 mM), NAC (10 mM) and 5- fluorouracil (5-FU, 50 mM) continuously incubated with serum (10% FBS) for 24 h. Migrated cells were examined with light microscopy (magnification, 100×, upper). Numbers of migrated cells per field were counted under 100× light microscopy and quantified (lower).
Data represent the mean ± S.E of 3 replicates (significant compared to vehicle-treated control,
** p < 0.01 or 10% FBS alone, ## p < 0.01).
(B) HCT116 cells were treated with IsoR (30 mM), NAC (10 mM) and 5-FU (50 mM) continuously incubated with serum (10% FBS) for 24 h. Invaded cells were examined with light microscopy (magnification, 100×, upper). Numbers of invaded cells per field were counted under 100× light microscopy and quantified (lower). Data represent the mean ± S.E of 3 replicates (significant compared to vehicle-treated control, ** p < 0.01 or 10% FBS alone, # p < 0.05, ## p < 0.01).
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4. 결론 및 고찰
본 연구는 인간 대장암 세포에서 이소람네틴이 HIF-1a를 억제하는 현상과 그 기전을 규명하였다. 이소람네틴은 HIF-1a의 단백질 양을 감소시켰고, HIF- 1a의존적인 프로모터 영역을 포함하는 리포터 유전자 활성 및 HIF-1a 타겟 유전자의 전사발현을 억제하였다. 또한 이소람네틴의 항산화 활성이 HIF-1a 억제에 기여할 수 있음을 입증하였다. 아울러 이소람네틴이 암세포의 이동 및 침윤 억제 효과를 보임으로써 암 치료제로서의 가능성을 제시하였다.
플라보노이드계 물질인 히스피두린, 루테올린, 및 퀘세틴 등은 다양한 암세포에서 HIF-1a를 억제함이 보고되었다 [12-14]. 이소람네틴도 항암 효능에 대한 연구결과는 보고되었지만 [4,16,17], 직접적인 HIF-1a 조절에 대한 연구는 규명된 바 없었다. 본 연구에서는 인간 대장암 세포인 HCT116 세포와 HT29 세포에서 저산소 상태 또는 CoCl2 를 이용하여 HIF-1a의 축적을 유도한 후 이소람네틴의 HIF-1a 억제 하는 것을 확인하였다 (Fig 1). 뿐만 아니라, 이소람네틴은 HEK293 세포에서 HIF-1a 과발현에 의해 축적된 HIF-1a 단백질도 뚜렷하게 감소시켰다 (Fig 4D).
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 효과는 HIF-1a 타겟 유전자인 GLUT1, LDH A, CA- IX 및 PDK1 의 mRNA 를 통해서 재확인하였다. (Fig 2B). 저산소 상태에서 HIF-1a는 세포 외 당수송체인 GLUT1 을 전사적으로 유도해 포도당 흡수를 증가시키고, 해당과정을 항진시킨다 [28,29]. 또한, HIF-1a는 저산소 상태에서 LDH A 의 발현을 증가시켜 피루브산 (pyruvate)에서 젖산으로의 전환을 촉진하고, 이를 세포 외 공간으로 유출시킴으로 암세포의 산성혈증을 일으킨다 [30]. CA-IX 은 암세포의
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성장과 전이가 원활하게 이루어질 수 있도록 세포 내 산도를 유지시킨다 [11].
뿐만 아니라, HIF-1a는 PDK1 의 전사발현을 유도해 미토콘드리아의 산화적 인산화 (oxidative phosphorylation)를 억제시킨다 [31,32]. 따라서, 이소람네틴의 HIF-1a 억제는 암세포의 전이에 관여하는 단백질의 발현을 전사단계에서 억제하는 데 기여함을 확인할 수 있었다.
HIF-1a는 정상 산소 상태에서 불안정하여, 단백질 분해 과정이 HIF-1a 단백질의
양을 결정하는 주요 조절단계로 인식된다 [33]. 정상 산소 상태에서, HIF-1a의 두 프롤린 잔기 (402 와 506)는 PHDs 에 의해 수산화된다 [33]. 수산화된 프롤린은 von Hippel-Lindau (VHL)에 의해 인식되고, 유비퀴틴화된다 [33]. 이후 유비퀴틴화된 HIF-1a는 프로테아좀에서 빠르게 분해된다 [7]. 이러한 사실에 기초하여
이소람네틴의 HIF-1a 억제 효과가 가속화된 단백질 분해에서 비롯되는지 확인하였으나, 이소람네틴은 HIF-1a 유비퀴틴화에 영향을 주지 않았다 (Fig 3B).
더욱이 MG132 로 프로테아좀 분해를 억제한 경우에도 이소람네틴은 HIF-1a를 감소시켰다 (Fig 3B). 뿐만 아니라, 라이소좀 억제에 의해 누적된 HIF-1a도 유의적 감소시켜 (Fig 3C), 이소람네틴이 단백질 분해과정을 촉진하여 HIF-1a를 억제시킬 가능성은 배제될 수 있다.
Li et al.의 연구에 따르면 dihydrotanshinone I (DHTS)은 분해 과정이 아닌 단백질 합성을 억제하여 HIF-1a를 감소시킨다 [34]. DHTS 는 mammalian target of rapamycin (mTOR)/p70S6K/elF4E binding protein-1 (4E-BP1) 및 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 신호를 억제하여 HIF-1a 단백질 합성을 억제할 수 있음이 확인되었다 [34].
또 다른 보고에 따르면, HIF-1a 합성 경로 중 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT
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가 제시되며, 이를 억제하였을 때 HIF-1a의 합성이 억제할 수 있음을 보였다
[11,35]. 이러한 기존 연구결과를 반영하면, 이소람네틴이 단백질 합성 억제를 통해 HIF-1a를 억제할 가능성이 제시된다. 따라서 PI3K/mTOR/ERK 등의 단백질 합성을
조절하는 신호전달경로가 이소람네틴에 의해 조절될 수 있는지 후속 연구가 필요하며, 이러한 연구결과는 보다 구체적인 HIF-1a 억제 기전을 설명할 수 있을 것으로 보여진다.
이소람네틴은 Nrf2 의 활성화를 유도하여 항산화 유전자의 프로모터 영역 중 antioxidant response element (ARE)에 결합을 증가시킨다 [3]. 이를 통해 g- glutamylcysteine synthetase 과 Sestrin2 등 다양한 항산화 단백질을 유도하여 세포보호효과를 보인다 [3]. 또한 이소람네틴은 heme oxygenase-1 (HO-1)을 유도하여 활성산소를 감소시키고, cyclooxygenase-2 (COX-2)를 억제하여 염증반응을 억제하였다 [36]. 본 실험에서도 이소람네틴이 대장암 세포에서 활성산소를 억제하는 결과를 관찰하였으며, 활성산소에 의한 HIF-1a 축적을 억제할 수 있음을 보여주었다 (Fig 4A-C). 또한 항산화제인 NAC 을 통해서 간접적으로 이소람네틴의 암세포 이동 및 침윤 억제가 항산화 효과로 인한 것임을 확인하였다 (Fig 5).
따라서, 암세포가 쉽게 노출될 수 있는 저산소 환경에서 증가된 활성산소를 이소람네틴이 억제하여 HIF-1a를 감소시킬 수 있으며, 이것이 암의 전이를 증가시킬 수 있는 유전자의 발현을 억제하는데 기여하는 것으로 생각된다.
종합하면, 본 연구는 이소람네틴의 항산화 효능이 HIF-1a를 억제하며 암전이 억제 효능에 기여함을 보여준다. 이는 이소람네틴이 항암제로 활용될 수 있는
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가능성을 시사하며, 항산화 효능을 갖는 다양한 천연물 유래의 화합물의 항암 효능을 설명할 수 있는 기전으로 제시될 수 있음을 의미한다.
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국 문 초 록
이소람네틴에 의한 HIF-1a 억제 효능 연구
서 수 호
지 도 교 수 : 신 상 미 약학과
조선대학교 대학원
이소람네틴은 미나리에서 추출한 플라보노이드 구조를 갖는 성분이다. 기존 연구를 통해 이소람네틴의 항산화, 항염증 및 항암 활성 등의 긍정적인 효능이 보고되었다. 본 연구에서는 대장암 세포에서 이소람네틴의 항산화 효과가 암을 억제하는데 기여할 수 있는지 조사하였다. 이소람네틴은 HCT116 과 HT29 세포에서 저산소증 또는 CoCl2 로 유도한 hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a)의 축적을 억제하였다. 또한, CoCl2로 유도한 hypoxia response element (HRE) 리포터 유전자의 활성을 억제하였다. 저산소상태에서 이소람네틴의 HIF-1a 억제는 glucose transporter1 (GLUT1), lactate dehydrogenase A (LDH A), carbonic anhydrase-IX (CA-IX) 및 pyruvate dehydrogenase kinase1 (PDK1) 와 같은 HIF-1a 타겟 유전자 억제로 이어졌다.
이소람네틴은 HIF-1a 단백질 안정성을 감소시키는 것으로 관찰되었으나, HIF-1a 유비퀴틴화는 변화시키지 않았다. 이에 다음으로 HIF-1a의 억제에 이소람네틴의 항산화 효과가 연관성이 있는지 평가하였다. 이소람네틴은 CoCl2 또는 H2O2 로
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생성된 활성산소를 효과적으로 억제하였으며, H2O2 를 통해 축적된 HIF-1a를 감소시켰다. 또한, 이소람네틴과 N-acetyl-l-cysteine (NAC)은 HEK293 세포에서 과발현된 HIF-1a를 억제하였다. 이는 이소람네틴의 항산화 활성을 통해 HIF-1a의 조절이 가능함을 보여준다. 마지막으로 암세포의 이동 및 침윤성에 대해 관찰하여 이소람네틴의 항암효과를 평가하였다. 이소람네틴과 NAC 을 처리했을 때, 혈청 자극으로 유도된 암세포의 이동 및 침윤성은 억제되었다. 종합하면, 본 연구는 이소람네틴이 활성산소를 억제하여 축적된 HIF-1a을 감소시키며, 그 효과로 암세포의 이동 및 침윤성을 억제할 수 있음을 규명하였다.
