Journal of Sasang Constitutional Medicine

(1)

사상체질학회지

J^.of ^Sasang ^Canst. ^Moo

Vol. 14. No 3. 2002

淸^1[; 、運子邊水抽出物이 XO/HX 에 의해 揚陽된 培養

海廳輔織뼈에

^{미치는 影響}

황승연.

이째흥.

김형순 . ^배영춘.

김경요.

원경숙..

I Abstract I

Effects of Cheongsimyeonja-tang water extract on the Cultured

Primary Hippocampal Cell Damaged by XO/HX

뼈^I^{뱅 않 Ung-YI} ^없

"

. _Lee _Jae _{뻐j 때}_'. _Kim _바뼈 _Soon' . ^Bae ^{YI뻐때 αlun'} . ^Kim ^Kyung ^Yo' .^WI^α¹ ^KY1^에때 ^Soot

.

^Dept. ^of ^Sasang Constitutional Medicine, College of Oriental Medicine, Wonkwang Univ.

.. Dept. of Nuclear Medicine, Colleoe ^이 Medicine, Keimyuno Univ.

The ^pur _π^)Sf ô.f ^this ^study îs ^to êxamine ^the ^toxic êffects ^ca ^파ed ^by ^xanthine o.xidase/hypoxanthine(XO/HX)

and the effects o.f herbal extracts such as Cheongsimyeonjatang(CYT) an the treatment o.f the to.xic

effects. Far this p따pose, experiments with the cultured hip π>campal cells fro.m new born mice were

do.ne.

The results o.f these experiments were as fo.lIo.ws.

1. XO/HX, a o.xygen radical-generating system, decreased the survival rates o.f the cultured cells an M1T

assay and NR assay, pro.tein synthesis, and amo.unts o.f neurofLIaments.

2. CYT have the efficacy o.f increasing protein synthesis decreased by XO/HX.

3. CYT have the efficacy o.f increasing the amount o.f neurofUaments decreased by XO/HX.

From the above results, it is suggested that Cheongsimyeonjatang (CYT) have marked efficacy as a

protectio.n far the damages caused by the XO/HX-mediated 0.잉dative sπess.

Key wards: Cheongsimyeonjatang, xanthine o.xidase. 뻐ypoxanthine, pro.tein synthesis, neuroftlaments

1. 훌훌 훌홉 며, 이에 대한 새로운 치료방법을 모색하는 시 도가 다양하게 이루어 지고 있다. 四象醫學 또 한 기존의 보편적 병리와는 달리 각 體質을 구 분하고, 체질별 특수성에 따른 접근올 시도하 現代醫쩔의 발전에도 불구하고 , 여전히 해

결되지 못하고 있는 많은 난치병들이 존재하 .

* 원광대학교 한의과대학 사상체질의학과 n 계명대학교 의과대학 핵의학과

교신저자 횡송연 주소)

전북 전주시 완산구 태평l 동:rn ^{세동한의원} 전화없-:i5.'3-<J.5'3 e-rmil: 00 때lere3@ 이-eamWiZ ∞m

- 132 -

(2)

m子쩌 Semen Nelumbinis 8.0

山藥 Rhizoma Dioscoreae 8.0

石홉i짧 Rhizoma Acori Graminei 4.0

黃좌 Radix Scutellariae 4.0

쫓門 Radix OphioPol!onis 4.0

@찾찢仁 Semen Zizyphi Spinosae 4.0

Ÿ•Il&€‰ Arillus Lonl!an 4.0

Y)F'JÊ½ Radix ASIJQral!i 4.0

*ro¬[P ^Semen ^Raphni ^4.0

遠志 Radix PolVl!alae 4.0

拍子仁 Semen Biotae 4.0

itÌ"5 Semen Nelumbinis 2.0

,홈心훌子껴 水뼈出物이 XQ'HX 에 의해 챔힘된 i 용홈 ; 흩馬m^{짚어뼈에 미치는} ^影활

고 있어, 이를 이용한 연구가 진행되고 있다.

東醫흡따保元에서 太陰人은 IJf 大^IJrp 小한 특징 을 가지고 있고n, 뼈之했에 속하는 없腦 역시 따大뼈小한 영향을 받는다고 하였다

2)

더욱이 최근 金3-4)

등이 임상 연구 보고에서 太陰人의 중풍 발병율이 가장 높다고 지적한 것처럼 太陰

A은 타 체질에 비해 頭腦의 질병에 걸리기 쉬 운 체질적 소인을 가지고 있다고 볼 수 있다.

대표적 太陰A 처방 중의 하나인 淸心造子陽은 李濟馬의 『핏醫등찮世保元5)J

에 나오는 太陰人￥rr 定方으로서 l훤勞, 땅;

뺀無l표, 食辦, ff힘

8흉痛 , t빠웹, 中風, 펀卷 등을 치료하며, 開짧醒

I짧,'f;i. ^’神情志, 補뼈i뼈氣, 安神安훤; 등의 효능으

로 보아 쳤i果를 비롯한 여러가지 두뇌와 관련 된 질환이나, 신경손상질환에 웅용될 수 있음 을 알 수 있다

I)

산소자유기는 최외각 전자궤도에 쌍을 이 루고 있지 않는 혼수개의 전자가 존재하는 원 자나 분자를 지칭하는 것인데, 그 특수구조 때 문에 대단히 큰 반응성을 보여 생체내의 여러 가지 병태생리학적인 반웅에 관여하고 있으며 생체막의 불포화지방산을 과산화시키거나 단 백질, DNA 를 변성시킨다 ^6-7) 특히 산소자유기 는 중추나 말초신경계를 구성하고 있는 신경 세포에 산화적 손상을 유발함으로써 노인성 치떼나 파킨슨씨병을 비롯하여8-1 n,

뇌허혈이나 뇌졸중 동과 같은 신경질환의 병인으로 밝혀 지 고 있다 12-14)

이에 저자는 淸心運子陽도 뇌신경조직에 대한 산소자유기의 산화적 손상기전을 벙어하는 작용 즉 항산화작용이 있는지 일아보기로 하였다.

본 실험에서는 산소자유기를 유발하기 위

하여 XO/HX 를 웹養한 海馬神經염nH 힘에 처 리

한 후 세포독성을 MTT 정량,NR 정량 측면 에서 조사하였으며, 淸心運子楊의 방어효과를 관찰하기 위하여 淸心運子1易 뺀揚被을 培養海

원l빼經細!泡에 전처 리 한 후 SRB(sulforh 여amin B)

정 량 , Neurofilament 정 량을 동하여 총단백 질 량 의 변화와 신경세사량의 변화측면에서 측정을 하였는 바, 유의한 결과를 관찰하였기에 보고 하는 바이다.

II. 實훌材혐 및 方法

1. 재 료

1) 동 물

본 실험에 사용한 동물은 임신 14-16 일의

250 - ^3C^뼈의 ^Sprague- ^{Da wley} ^{종의 건강상태}

가 양호한 생쥐를 사용하였다 .

2) 약 찌

본 실험에 사용된 淸心않子i^{易은 李}⁵⁾ ^의 ^束醫

땀世保元에 의거하였으며 약재는 圖光大學校韓醫科大젤 歸方病院에서 !햄入한 후 磁選하여 사용하였으며 처방내용은 다음과 같다 .

Prescriotion of Cheongsimyeonjatang{ ζYT)

Herbal Name

Weight Scientific Name (g)

Total amount 54.0

-133-

(3)

- 사상체질의학회지 제 14 권 지13호 2002 -

2. 방 법

1) 檢被의 調製

情心運子場 3 첩 반 분량인 189g 을 증류수 와 함께 환저플라스크에 넣고 냉각기를 부착 하여 2시간동안 전탕한 후 3, ^αX)rpm 에서 20 분 간 원심분리하고 회전진공 농축기로 감압농축 한 후 동결건조기에서 동결 건조하여 45.57g 의 분말 시료를 얻었다 .

2) 쫓협 製造

본 실험에 사용한 시약으로는 xanthine

O잉dase(XO, Sigma) 와 hYJX>xanthine(HX, Sigma)

으로 xo 의 경우 1아nlJ/m£, lOrnlJ/m£, 1mlJ/m£

의 저장액을 , HX 의 경우 1M, 100mM, 10mM 의 저장액을 만들어 냉암소에 보관한 후 실험 당일 적당한 양으로 희석 사용하거나 필요한 OJ:- 을 직 접 배양액에 첨가하여 사용하였다 .

3) 細D성협훨

임신 14-16 일의 Sprague- Dawley 종 흰쥐의 복강을 70% 알콜로 소독, 절개한 뒤 자궁올 적출하여 태아의 두경부를 절단하여 피부와 두개골올 제거한 뒤 후뇌에서 연수까지의 뇌

를 꺼내어서 HBSS(Hank ^‘s balanced salt

solution) 에 모은 다음 현미경하에서 뇌조직

주위의 뇌막을 제거 후 해마부위를 분리하였

다. 분리 된 조직 에 0.25% ^σypsm 과 0.01%

DNase 를 첨가하여 3TC 수조에서 20 분간 배

양한 다음 HBSS 로 3-4 회 씻어내어 trypsin 올 완전히 제거하고 조직 덩어리를 작은 입자 덩어리로 만든 후 상층액올 취하여 HBSS 를 첨가 후 세포를 분리하였다 . 수차례 반복 후 상층액올 버리고 배지에 부유시켰다. 부유시킨 일부 세포를 취하여 σypan blue 로 염색한 후

현미경하에서 hemacytometer 를 이용하여 세 포의 수를 측정한 다음 104 - ^WC; 개의 세포수를

B-Zl, 0.5mM L-glutamine, 25uM glutamine,

25uM 2-mercaptoethanol 이 첨가된

Neurobasal media (Boehringer Mannheim,

Germany) 에 4 일간 배양 후 glutamate 가 없는

배지로 1/2 교환하고 2주간 배양하여 신경세 포가 성숙한 다음 실험에 사용하였다.

4) XO/HX 의 처 리

산소자유기가 생쥐의 海馬神經細 8힘에 미치 는 영향을 조사하기 위하여 일정시간 배양한 海馬神經細脫를 0.6%-0 glucose 가 함유된

MEM(m 여ified essential m 어ium) 으로 3 회 세

척 한 후 xanthine oxidase(XO) 에 다양한 농도

의 hypoxanthine(HX) 을 여 러 농도로 조합하

여 혼합한 다음 이들 각각의 배양액에서 처리 한 후 분석하였다.

5) 세포독성 및 방어효과 검정 (1) 세포생존율 분석

φ MTT 정량

MTT - 3- (4,5-dimethy lthiaz 이 -2-yI)-2,5-

diphenyltetrazolium bromideCSigma) 정 량은

Mosmann15) 의 방법에 의하였다 . 산소자유기를

처리한 t 흠養海馬神經細뼈를 PBS(phosphate

buffered s때 ne) 로 3회 세척한 후 전날 제조한

5Omg/ml 의 MTT 를 well 당 최 종농도로 희석

하여 넣어 3TC, 5% ^CO2 로 조절된 정온기에 서 培養하였다. 배양 완료후 마없 hylsuIfo 잉cE(DMSO,

Merk) 를 처 리 한 다음 S야ctrophotometer 로

570nm 에서 흡광도를 측정 후 대조군과 비교

조사하였다 .

(2:)NR 정량

-134 -

(4)

- 융心훌子;_{易水抽出物이} _X어-IX_어^| _{의해 껴}I 된 inc 훌%흥馬. 經細8생에 미치는 影훌 -

Neutral red(NR, Sinma) 의 정 량은

Borenfreud 와 Puemerl6) 의 방볍 에 따랐다 . 즉

여 러 농도의 XO 를 처 리 한 培養海馬神經細 I뼈

를 phosphate buffered saline(PBS) 으로 3회

세척 후 전날 제조한 5mg/ml 의 NR 을 well 당

최종농도로 희석하여 넣은 다음 3시간 동안

3TC, 5% CO2 로 조절된 정온기에서 배양하 였다. 배양 완료 후 PBS 로 3회 세척 후 1%

formalin 으로 고정 하고 1% glacial acetic acid

로 처리한 다음 s^κtrophotometer 로 없Onm 에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다 .

Q)SRB 정 량

산소자유기 나 淸心違子 1易으-로 일정시간 동 안 처 리한 海馬神經細抱에 0.4% sulforhodamine B릎 200 μ 씩 첨가하여 1 시간 동안 실온에 방 치한 다음 1.0% acetic acid 로 3회 세척하였다 .

세척 완료 후 lOr 마tl Tris base 를 이용하여

SRB- bound protein 을 녹인 후 ELISA reader

로 딩 Onm 에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비 교 조사하였다 .

@ Neurofilament enzymeimmuno assay(EIA)

배양중인 海馬神經細뼈를 PBS 로 3회 세척 하여 알콜로 고정 시 킨 다음 0.2% Triton

X-loo 이 포함된 PBS 로 3회 세척하였다 . 세척

완료후 NE14( 1:100, Sigma) 로 1시간 동안 반

웅시킨 후 0.( μ% O-phenylenediamine(OPD,

Sigma) 과 0.02% hydrogen peroxide 로 처 리 한

다음 ELISA Reader 로 490nm 에서 흡광도를

측정하여 대조군과 비교 조사하였다 . EIA 는

490nm 에서 빛의 흡수량에 의해 신경세사의

양을 측정하는 효소연역 분석법이다 .

6) 통계 처 리

실험 결과에 대한 유의성의 검정은 ANOVA

한 후에 T^버‘ey-Kr 킹ner multiple comparison

test 에 의하였으며 p 값이 0.05 이하인 것만 유 의한 것으로 하였다

ffi. 寶 훌 成 빼 1. 산소자유기의 독성효과

1) 세포생존융 분석

(l)MTT 정량

XO 가 培훨 海딴l폐l 經 ij 힘에 미치 는 영 향을

조사하기 위하여 xanthine oxidase(XO) 가

5mU/mQ 에서 6OmU/mQ 까지의 각각의 농도로

포함된 배양액에서 5시간 동안 배양한 후 XO

의 독성을 MTT assay 법에 의하여 조사한 결 과 5mU/mQ XO 처리에서는 세포의 생존율이

대조군000%) 에 비하여 76.2% 로 나타났으며

15mU/mQ 의 처 리 에서 는 62.6% ^로 ^나타났다 ^그

러 나 3OrnU/mQ 와 6OmU/mQ XO 를 처 리한 경우

세포 생존율은 각각 51.0%(p<0.05) 와

25.9%(p<0.01) 로 대조군에 비하여 유의하게

낮게 나타났다 (Table I, Fig. 1).

XO/HX 가 배양시간에 따라 海, 띤神經細뼈

에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3OmU/mQ

XO/O.lrnM HX 가 포함된 배양액에서 海馬^l뼈

經쩌HI.泡를 각각 1-7 시간 동안 배양한 후 세포 의 생존율을 MTT assay 법에 의하여 대조군 과 비교 조사한 결과 처리한 시간에 의존적으 로 세포 생존율이 감소하는 경향이 있었으며 특히 5시간과 7 시간에서는 각각 밍.5%(p<0.05),

27.7%(p<o.OD 으로 나타나 풍계 적으로 유의 한

감소를 나타냈다 (Table 2, Fig. 2).

-135-

(5)

Table. Dose-dependency of xanthine

oxidase (XO) _In the cultured

hipº>campa} cells

XO (mU/mI) MIT absorbance Decrease rate of

(570 nm) cell viability (%)

0 1.47:t0.19

5 1.12:t0.17 23.8

IS O.Çƒto'<¯ 37.4

30 O.75tO.<Xi* 49.0

00 0.38:t0.02** ^74.1

- 사상체질의학회지 제 14 권 제3 호 2002

The cultured hip α:>campal cells were

σeated with various concen σations of

xanthine oxidase (XO) for 5 hours. The

values are the mean:tSE for 6 experiments.

The significant differences from the control

are marked with the asterisks. *p<O.05;

**p<O.01

120 100

mgmW

쩌

종

)”

-3잉〉그

20

0

Control 5 15 30

Concentration of XO (mU/ 떼)

%

Fig. 1. Dose-dependency of xanthine oxidase

(XO) in the ωl 따어 hippoc 킹npal

cells. Other legends are the same as

Table 1. *p<O.05; **p<O.01

-'136 -

Table 2. Time-response relationships of

xanthine oxidase (XO) in the

C띠tured hi ppocampa} cell s

XQ!뻐

( 며써/ 메1) Ohr

MITaI: 없삶oce ⁽⁵⁷⁰ run)

3hr 5hr 7 바

1 hr 0

1)

1있to.l8 1.51tO.17 I쟁:to.l3 1.46tO.15 1갱:to.l4 l.34tO.ll l.l0:t0.rn 0.fE--t{).U7 O.ηto.ffi* 0쩌to.a2**

The cultured hippocampal cells were

σeated with various time intervals at a the

cone εntra 삽on of 3앉nUl 패 XO in O.ln1J."v1 많T\..

The values are the mean ^土SE for 6

experiments. The significant

between groups are marked

asterisks. *p<O.05; **p<O.Ol

differences

with the

140

ε αntrol C그 30 mU/m1/1T 뼈 XOlJ-lX 120

100

m@mwm%

’똥

)”뀔〕잉〉그

m

0

Control 135

XO'lIX incu 뼈tion time (hou 끼

7

Fig. 2. Time-response relationship of xanthine

0잉dase (XO) in hy φxanthine (HX) on

the cultured hi 야X 킹1뼈1 cells. Other

legends are the 잃me as Table 2

*p<O.05; **p<O.Ol

(6)

XO (mU/m]) NR absor¼¼nce Decrease rate of

(µ)O¾|) cell viability (%)

0 1.ffi:1:0.17

10 1.44:1:0.15 14.3

J) 1.(·!0.13 36.3

50 OÅÆ:1:0.<& 51.2

70 0.6ltO.lliu 63.7

- ,홈心훌주훌 水抽出物이 X아-IX에 의해 jll 핑된 inc 훌 %훌馬 ij$¥ 공細뼈에 미치는 影훌 -

(2) NR 정량

배양중인 海p_탐神經쐐H힘릅 ci ^‘^2,Mg^‘ free

Hank ^’s balanced salt solution(HBSS, Gibeo)

으로 3회 세척한 후 xo 가 1아nU/m.e 에서

7이nU/m.e 까지의 농도로 포항된 배양액에서 5

시간 배양한 다음 이의 영향을 조사한 결과

1OmU/m.e 의 처리에서 세포의 생존율은 대조군

000%) 에 비하여 85.7% 로 나타났으며 떼mU/

m.e 에서는 63.7% 로 나타났다 . 또한 밍 mU/m.e

과 7OmU/m.e 에 서 는 각각 48.8%(p<O.05),

36.3%(p<O.Ol )_{로 나타났다} (Table 3, Fig. 3).

xo 가 배양시간에 따라 海馬神經細뼈에 미치

는 영향을 조사하기 위하여 MCV(midpoint

cytotoxicity value) 값인 밍 mU/m.e XO 농도에서

1-7 시간 동안 배양한 후 각 시간별로 세포의 생존율을 조사한 결과 1시간, 3 시간 배양에서 는 대조군000%) 에 비하여 각각 72.7%, 61.3% 로 나타났으며 5시간과 7시간 각각 53.5%(p<O'(),

.4%(p<O.Ol) 로 나타났다 (Table 4, Fig. 4)

Table. 3. Absorbance (% of contro)) at

540nm wavelength for the NR assay

on xanthine oxidase (XO) in the

cultured hippocampal cells

grown in the media containing various

concentrations of xanthine oxidase (XO) for

5 hours. The values represent the mean:tSE

for 6 experiments. The significant

differences from the control are marked with

the asterisks. *p<O.05; **p<O.01

120,-- 100

80

mW

째

($)”

-g_잉〉

---

20

0

αntroJ 10 30 so

Controtration of XO (mUI 빼)

70

Fig. 3. llise-response relationships of xanthine

0잉dase (XO) in the cultured hip _αx:arr 뼈l

cells. Other legends are the same as table

3. *p<O.ffi; **p<O.01

Table 4. Tirr ^ε-response relationships of

xanthine oxidase (XO) in

hypoxanthine (HX) by NR assay in

the cultur, 어 hip αx:amp 외 cells.

x^α^HX

(mUh ν매’) 0 hr

o ^L79tO.l6

fD I때to. 13

NR absorbaoce 때o run)

Ihr 3hr 5hr 7hr

L76:tO.l8 L73:tO.l7 L70:tO.l5 L62:tO.14

UMII Wj:tO.OJ O.91:tO.a7* O.46:tO 여

"

incubated with 5OmU/m.e xanthine oxidase

(XO) in O.1mM hyp α<anthine (HX) for

various time intervals. The values represent

the mean:tSE for 6 experiments. Significant

differences between groups are marked with

the asterisks. *p<O.05; **p<O.Ol

” 7

(7)

- 사상체질의학회지 제 14 권 제3 호 2002 -

나타났으며, MCV 값은 4OmU/m£ 에서 나타났다

(Table 5, Fig. 5).

140

Table 5. Dose-response relationship of

xanthine oxidase(XO) on total protein

synthesis in the cultured hip _α:>campal cells.

Total protein (% of αntroI)

100:1::9.6

XO/HX (mU/mVmM)

0

c:::: 그 50 mUlml/mM XO 깨-IX

Control 120

100 80

($)킹

3잉〉그 % 40

m

82.7:1::7.4

73.5:1::6.8

10

7 135

xαHX illwbat.iulllj (hut띠 Control

0

52.6:1::4.2*

34.7:1::5.3**

hippocampal cells were exposed

40 없d 8OmU! 찌 xanthine

40

10, 20,

oxidase(XO) 00 C 버tured to the

Fig. 4. TilT ^ξ-d 맡£ndancy of xanthine oxidase

(XO) in hypoxanthine (HX)

C버tured hippocam 맹1 cells. Other legends

Table 4. *p<O.CE;

In

respectively.

hours, 5 for

by

% of

measured was

proteIn

assay( 딩Onm),

The results indicate

Amount of total

as sarre the

**p<0.01 are

as shown SRB and

the meaniSE

differences Significant

expenments.

from the contrl are marked

control.

6 for

with asterisks.

2. 한약추출물의 효과

*p<O.05; **p<O.Ol

l)SRB 정량

산소자유기가 培養海馬神經細뼈에 미치는 영향을 총단백질양의 측연에서 조사하기 위하

여 O.1mM Hypoxanthine(HX) 에 Xanthine

Oxidase (XO) 가 lOmU/ 뼈에서 8OmU/m£ 까지의

농도로 포함된 배양액에서 5시간 동안 배양한 후 XO 에 의한 단백질 합성의 변화에 대해

사한 결과 1 Omu/m£xo 처리에서는 단백질의

합성이 대조군(100%) 에 비하여 82.7% 로 나타

났다. 또한 2OmU/ 뼈의 처리에서는 대조군에

비 하여 73.5% 로 다소 낮게 나타났다 . 또한

4OmU/m£ 과 없nU/m£ XO 를 처리한 경우 단백질

합성은 각각 52.6%(p<o.CE) 과 34.7%(p<0.01) 로

나타나 대조군에 비하여 모두 유의하게 낮게

120,- 100

mwmW

쩌

($)Z깅홉

a_갱。←

; ζ m

'-'-

(1) XO!HX 의 영 향

Control 10 20 40 80

Concentration of XαHX(mLV 매1mM)

xanthine proteIn

hippocampal

synthesis cells.

I»s 똥e-dej: 야!en떠dency of

oxidase(XO) on total

mouse cultured

In 0

Fig .5.

-138 -

(8)

; 홉心훌子껴 水抽出物이 XO'HX 에 의해 껴傷된 inc 훌 흉馬神經細R힘에 미치는 影휠 -

Other legends are the same as the

Table 5. *p<O.05; **p<O.Ol

(2) 淸心述子傷의 효과

培養海馬神經細뻔에 대한 XO 의 산화적 손상에 있어서 情心遊子陽의 효과를 총단백질 의 양적변화 측면에서 조사하기 위하여 XO 의

MCV 값 (midcyto- toxicity value) 인 4αnU/m.e

XO 농도에서 5시간 동안 노출시키기 3시간 전

에 15g/ml 에서 l00p.g/ml 淸心造子끊이 각각

포함된 배양액에서 전처리한 후 이의 방어효 과를 조사하였다 . 그 결과 15g/ml XO 만을 처 리한 경우 총단백질의 양적변화는 대조군

000%) 에 비하여 56.4% 로 나타났으며, 또한

껑g/ml 淸心述子場의 처리에서는 대조군에

비하여 75.4% 로 나타났다. 그리고 5O)J.g/ml,

1뻐19/ml 처 리 에 서 는 각각 83.6%(p<O.05) ,

87.9%(p<O.OI )_로 XO 만의 처리에 비하여 높게

나타났다 (Table 6, Fig.6).

Table 6. Dose-response relationship of CYT

for its neuroprote 다ive effect on XO

in total protein synthesis.

뼈뻐때빼

-o

Tα외 protein (% 이control) cαlcentration of CYT (Jlg!ml)

2) fi)

15 100

0

100:1:8.8 loo:!:7.9 loo:!:9.l loo:!:6.4 loo:!:7.6

때 .4:!:6.7 없.9:1:8.2 75.4:!:5.9 83.6:!:7.4* 87.9:!:8 하

*

Cultured mouse hippocampal cells were

treated with CYT Cultures were

preincubated ^.with 15, 25, 50 and lOOp.g/ml

CYT for 3 hours, res 야ctively. After then,

cultures were exposed to 4OmU/m.e XO for 5

hours.' Amount of total protein was

measured at wavelength of 540nrn. The

results indicate the rnean:tSE for 6

ex 야riments. Asterisks indicate the

significant differences from the control

group. *p<O.05; **p<O.Ol

140 ←---

120 100

킹’a^、 '11'C' 흘ω

갱 얻 40

m

0

Contr 에 15 25 50

ronl:mtration of CYf (I_μg_빼)

100

Fig. 6. Dose-dependency of CYT for is

neuroprotective effect on XO in total

protein synthesis. Other legends are

the same as the Table 6 *p<O.05;

**p<O.Ol

2) Neurofilament 정 량

(1) XO/HX 의 영향

XO/HX 가 培찮 海, 떤^j뼈經細 n 힘에 미 치는 영

향을 神經細絲뭘 :을 이용하여 조사하기 위하여

XO/HX 가 5mU/m.e-5OmU/m.e 의 농도까지 5시

간 동안 처리한 후 神經細絲 f륜을 조사하였다 . 그 결과 처리한 농도에 비례하여 세포의 神經細絲量이 감소하였으며 특히 25mU/m.e, 5OmU/

m.e 의 농도에서는 대조군에 비하여 각각

47.3%(p<O.05) 와 22.6%(p<O.OI ) 로 유의하게 감

소하였 다(Table 7, Fig. 7),

-139 -

(9)

XO/HX EI absorbance Decrease of

(mU/mJ/mM) (4SKJ nm) neurofilament(%)

0 l.ffi:tO.17

5 1.fB:t0.15 14.5

15 1.79:t0.12 30.6

:xJ 0.42iO.CD** π4

concentration of 티 absor¼¼nee (400 run)

CYT (¼g!ml) XO/H)( XO/H)(

0. mU/mVmM 25 mU/mVmM

0 L58:tO.16 o..81:!:o..00

00 L!:o..14 Offifore

00 L53fo..l5 Ll ho..10

1:1; Lt'i):!:o..l3 L25fo..l3>

1:'iJ L48:!:o..12 L36:!:o..I

5**

- 사상체질의학회지 제 14 권 세3 호 2002 -

Table 7. Dose-responce relationships of

XO/HX on neurofilament in the

cuI tured hi ppocampal cell s

treated with various concentrations of XO

in O.lmM HX for 5 hours. Neurofilament

were measured as ^“material method". The

values are the meanISE for 6

ex 야riments. The significant differences

from the control are marked with. the

asterisks *p<O.05; **p<O.OI

120

100

mgaW

째

($)Eι얻에

-zp임一

aZ 20

0

Con 뼈 5 15 2S

Concentration of XO'HX (mU/mIIm 씨

50

Fig. 7. Dose-response relationships of

XO/HX on neurofilament in the

cultured hippocampal cells. Other

legends are the same as Table 7.

*p<O.05; **p<O.OI

(2) 情心運子楊의 효과

培養悔馬I神經細H힘에 대한 XO/HX 의 산화

적 손상에 있어서 淸心運子陽의 효과를 神經細絲뭘의 변화 측면에서 조사하기 위하여

O.lmM HX 안에 XO 의 MCV 값 (rnidcyto-

to 잉 city value) 인 25mU/m XO 농도가 포함된 배양액에서 5시간 동안 노출시키기 3시간 전 에 뻐 19/ml 에서 lfi)jlg/ml 淸心述子굉이 각각 포함된 배양액에서 전처리한 후 이의 방어효 과를 조사하였다. 그 결과 25mU/ XO 만을 처리한 경우 神經細絲量의 양적변화는 대조군

000%) 에 비 하여 51.3% 로 나타났으며, 또한

야19/mJ, 00 μg; 때 情心jili 子揚의 처리에서는 대조군에 비하여 각각 63.7%, 72.5% 로 나타났 다. 그리고 12QJ.g/ml, 1댔19/ml 처리에서는 각 각 83.6%(p<O.05), 91.9%(p<O.Ol) 로 XO 만의 처 리에 비 하여 높게 나타났다 (Table 8, Fig.S).