유전자 재조합 기술의 최근 동향: Recombineering을 통한 타깃 벡터 제작
경북대학교 의학전문대학원 생화학-세포생물학 교실, WCU 프로젝트
임 경 은․최 제 용
Recent Advances in DNA Recombination Technology; Construction of Gene Targeting Vector Through Recombineering Technology
Kyung-Eun Lim, Je-Yong Choi
Department of Biochemistry and Cell Biology, WCU project, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Korea
One of the key technologies in gene targeting is to construct the correct target vector. Recently, target vector construction has been possible without introduction of restriction enzymes and DNA ligases. The underlying principle is to use virus-derived proteins which are involved in the increase of homologous recombination in bacteria. Recombineering is based on the function of bacteriophage proteins exo, bet, and gam, which increase the homologous recombination between template DNA and exogenous DNA in bacteria. This technology will be useful not only in target vector construction, but also in various genome manipulation experiments.
Key Words: Gene targeting, Target vector, Homologous recombination, Recombineering
논문접수일: 2009년 10월 15일, 심사일: 2009년 10월 26일, 게재확정일: 2009년 11월 10일
책임저자: 최제용, 경북대학교 의과대학 생화학․세포생물학교실 Tel: 053)420-4823, Fax: 053)422-1466
E-mail: [email protected]
* 본 연구는 보건복지가족부 Korea Heath 21 R&D Project (Project No. A010252, A030003), 2009년도 두뇌 한국 21 사업에 의해 지 원되었음.
유전자 적중 (gene targeting)은 특정 유전자의 구조 를 변형하여 쥐를 만든 후 그 유전자의 기능을 알아 보는 기술이다. 이 기술은 일반적으로 두 부분으로 나눌 수 있는데 배아 줄기 세포와 타깃 벡터 제작 부 분이다. 배아줄기 세포 분야는 1980년대 초 처음으 로 생쥐로부터 만들어진 후, 몇 개의 특정 유전자들 을 체세포에 과발현시켜 배아 줄기세포를 만드는 iPS 방법에 이르기까지 비약적인 발전이 있었다1-3. 타깃 벡터 제작은 제한효소 (restriction enzyme)와 결 합효소 (DNA ligase)를 사용하지 않아도 가능한 방법
이 개발되었다.
벡터 클로닝은 외부 DNA 조각을 적당한 벡터에 결합시킨 후 박테리아에 넣어 대량으로 증폭하는 것 을 말한다4. 외부 DNA 조각을 플라스미드 벡터에 삽 입하는데 제한효소와 결합효소를 사용하는 클로닝 기술을 통칭하여 DNA 재조합 기술이라 한다. 그러 나 이러한 전통적인 방법은 벡터나 DNA 조각내 제 한효소 자리의 특이성 때문에 실제 유전자 적중 벡 터를 제작하는데 어려움이 많다.
최근 제한효소를 쓰지 않고 제작이 가능한데, 주 된 이유는 상동 재조합 (homologous recombination) 원 리를 이용하기 때문이다. 여기서는 상동 재조합을 이용한 유전자 클로닝 방법의 하나인 재조합 매개 유전자 조작 (recombination mediated genetic engineer- ing)법, 즉 recombineering에 대하여 간략히 알아보고 자 한다5.
상동 재조합과 Recombineering
원핵세포나 진핵세포는 외부로부터 세포 자체의 유전체와 동일한 상동 DNA 조각이 세포내로 들어오 면 재조합이 일어나는데 이것을 상동 재조합이라 한 다. 상동 재조합의 효율은 원핵세포 또는 진핵세포 마다 다르다. 비교적 재조합이 잘 일어나는 세포는 진핵세포 중 효모로 알려져 있다. 효모에서 유전자 적중 벡터를 만들 수는 있으나 여러 가지 불편한 점 이 많다. 예로, genetic instability 문제, DNA 정제의 어려움 등 전 과정에서의 집중적인 노력이 필요하 다. 더 불편한 점은 효모에서 적당한 DNA 벡터를 확 보하였다 해도 그 다음 단계에서 편리하게 쓰기 위 해서는 세균에 다시 넣어야 하는 점이다. 따라서 흔 히 쓰는 세균과 플라스미드로 유전자 적중 벡터를 간편하게 만들 수 있으면 가장 바람직하다.
세균 내에서는 상동 재조합이 잘 일어나지 않는 이유
외부 DNA 조각을 흔히 쓰는 E. Coli에 넣어주면 실제 상동 재조합이 잘 일어나지 않는다. 왜냐하 면 linear double strand DNA (dsDNA)는 세균에 들 어가면 ATP 의존적인 linear-dsDNA exonuclearse인 RecBCD에 의해 분해되기 때문이다6. 그래서 RecBCD 기능을 제거한 E. coli strains에 linear dsDNA를 도입 한다면 상동 재조합을 유도할 수 있다. 하지만 이러 한 세균들은 잘 자라지 않고, 낮은 재조합 능력과 플 라스미드 복제에서도 문제가 생긴다. 또한 재조합 기능이 지속적으로 존재하게 되어 원하지 않는 부위 의 재조합이 일어날 수도 있다. 또 다른 문제는 BAC 또는 PAC을 유지할 수 있는 세균은 주로 RecBC+ strain이 많다는 점이다. 이러한 단점들은 세 균 자체 유전자를 조절하기보다는 외부 phage 유래 의 유전자들을 이용하여 극복하는 편이 훨씬 효율 적이라는 것이 밝혀졌다. 상동 재조합이 잘 일어나 게 하는 방법 중 하나는 세균 내에서 바이러스 유 래 특정 유전자들의 발현을 열충격 방법으로 조절 하는 것이다.
세균 내에서 상동 재조합이 잘 일어나는 조건
세균에서 효율적인 상동 재조합이 일어나기 위해 서는 상동 재조합을 촉진하는 바이러스 유래 특정 단백질들이 필요하다. 1998년 두 종류의 서로 다른 바이러스 유래 상동 재조합 단백질들이 발견되었다.
그 첫째는 Rac prophage 유래 RecET 시스템이다7. RecET 시스템은 상동 재조합이 잘 일어나는 세균들 을 조사하는 과정에서 밝혀졌다. 상동 재조합이 유 독 sbcA strain에서 잘 일어났는데, 그 이유는 E. Coli K12 strains에 박혀 있는 Rac prophage의 recE/recT operon 발현이 활성화 되는 돌연변이 때문인 것으로 밝혀졌다. Rac 바이러스 유전자인 recE와 recT를 플 라스미드에 넣어 발현 벡터로 만든 것을 pBAD-ETr 라 한다.
둘째는 defective λ prophage에서 유래한 RED 시스 템으로 Red 유전자로부터 유래한 Red 단백질들이 상동 재조합을 증진시키는 것으로 밝혀졌다8. 즉, 박 테리오파지 λ의 Redα/Redβ 단백질들을 박테리아 내에 발현시킴으로써 linear dsDNA 조각 (loxP site나 selective marker 유전자 포함)을 여러 가지 플라스미 드, BAC, PAC 벡터 등에 효율적으로 삽입할 수 있 게 된 것이다5. 요약하면 둘 다 세균 속에서 존재하 는 단백질들이 아니라 바이러스에서 유래한 단백질 들이 상동 재조합을 일으키는데 중요한 도구로 사용 된다는 것이다. 여기서는 λ Red 시스템을 중심으로 좀 더 상세히 알아보고자 한다.
Recombineering 도구
상동 재조합은 박테리오파지 λ의 두 유전자 exo 와 bet만 있으면 가능하다. Exo는 single strand DNA 에 결합하는 5’-3’ exonuclease 이고, bet은 annealing 단백질이다. 여기에 상동 재조합에 꼭 필요한 것은 아니지만 또 다른 박테리오파지 λ 유래 단백질인 gam은 외부 DNA 조각을 파괴하는 RecBCD 효소를 억제하여 상동 재조합을 더욱 견고하게 한다. 따라 서 세균에서 상동 재조합은 박테리오파지 λ로부터 유래된 exo, bet, 그리고 gam이 발현되는 플라스미드 나 아예 세균 유전체에 넣어 발현이 조절되게 하면
Fig. 1. BAC 백터에서 원하는 DNA 부위를 얻는 과정. 제거하고자 하는 DNA 조각이 포함된 특정 유전자의 genomic DNA를 포함하는 BAC 벡터를 취하기 위해서는 pBluscript 기저의 PL253 retrieving vector를 이 용하여 DNA 조각을 얻는다. 미리 목표 BAC 백터가 포함된 세균 (SW102)에 linear PL253 벡터를 electrophoration한다. 전기 충격으로 genomic DNA가 포함된 PL253 retrieving vector를 얻을 수 있다.
효율적으로 구현될 수 있다. Defective prophage 발현 시스템은 위의 바이러스 유래 세 유전자들을 세균 유전체에 삽입하여 온도에 따라 발현이 조절되게 한 것이다. 이 시스템은 세 유전자들이 32oC에서는 발현 되지 않다가 42oC에서 10～15분 있게 되면 λ CI857 repressor에 의하여 조절되는 λ PL promoter에 의하 여 강력하게 발현된다9. Rac의 RecET 재조합 시스템 도 이와 기능적으로 유사하다. 아래의 순차적인 그 림은 특정 유전자 X를 conditional knock-out 하기 위 한 벡터 제작 순서이다.
Recombineering 순서
1. 원하는 genomic DNA 부위를 BAC clone으 로부터 플라스미드 벡터로 옮기기
먼저 유전자 적중 벡터를 만드는 첫 단계는 원하 는 유전자 (여기서는 gene X)의 부위가 포함된 BAC 클론을 확보하는 것이다. BAC 클론은 몇몇 기관으 로부터 인터넷을 통하여 저렴한 값으로 살 수 있다 (http://bacpac.chori.org/). 확보된 BAC 클론으로 대량 DNA를 얻은 후 원하는 DNA 부위가 포함된 것인지
확인한다. 주로 제한 효소를 이용하여 알고 있는 유 전자 지도와 비교하거나 끝 부위를 염기서열 분석으 로 확인할 수 있다. 확인된 BAC 클론은 그 다음 단 계인 유전자 적중 벡터를 만들 수 있게 일부분을 취 해야 한다. 왜냐하면 BAC 클론은 보통 100～200 kb 의 genomic DNA 조각이 포함되어 있어서 BAC 벡터 에서 직접 다루기는 불편하기 때문이다. 따라서 10～
15 kb 정도 되게 중요 부위를 잘라내어 플라스미드 벡터 (PL253)에 옮겨놓을 필요가 있다. 이 과정에서 도 제한효소나 결합효소 없이 세균 내에서 일어나도 록 할 수 있다. 먼저 원하는 DNA 부위의 양쪽 끝 염 기서열과 같은 상동 부위를 지닌 플라스미드 벡터를 준비한다. 이 플라스미드를 BAC 클론이 들어있는 특수 recombineering 세균에 transformation한 후 열충 격을 가한다. 열충격으로 위에서 설명한 exo, bet, gam 단백질들이 발현되어 순조롭게 상동 재조합이 일어나게 된다 (Fig. 1).
2. 옮긴 플라스미드 DNA 부위 수정하기 (첫 loxP 부위 삽입)
어떤 경우에는 conditional knock-out (CKO) 시킬 필 PL253
BAC clone
Recombineering
Homologous region 1 Homologous region 2
Fig. 2. Retrieving vector에서 첫 loxP 부위 삽입. PL452벡터로부터 PCR을 통해 얻어진 loxP 카세트를 PL253 retrieving vector를 가지고 있는 SW102 세포에 열충격을 준 후, electrophoration하여 배양하면, 첫번째 loxP 부위가 PL253 retrieving vector 내에 삽입된다. 이렇게 얻은 플라스미드 유전자를 Cre recombinase가 발현되는 SW106에 다시 electrophoration하여 하나의 loxP 부위만 남게 한다.
Fig. 3. Retrieving vector에서 두 번째 loxP 부위 삽입. PL451벡터로부터 PCR을 통해 얻어진 loxP 카세트를 그림 2와 동일한 방법으로 PL253 retrieving vector에 삽입시킨다.
요가 있다. 이 경우 loxP 부위를 제거하고자 하는 DNA 조각 양쪽에 두게 되는데 같은 방법으로 recombineering 시스템을 사용하면 쉽다. 먼저 제거하 고자 하는 DNA 조각의 일부와 상동성을 가지는 부 위와 loxP 부위로 floxed 되어진 neomycin cassette를
가지고 Fig. 1에서 마련한 유전자 X genomic DNA가 포함된 플라스미드를 대상으로 상동 재조합을 유도 한다. 삽입된 floxed-neo는 cre가 발현되는 세균 (SW106)에 넣어 loxP한 부위만 남게 한다 (Fig. 2).
PL452
Electrophoration into SW102 containing retrieved gene X
Electrophoration into SW106 expressing Cre recombinase
Neomycin gene loxP site
Homologous region 3 Homologous region 4
Neomycin gene FRT site
Homologous region 5 Homologous region 6 PCR from PL451
Electrophoration into
SW102 containing first loxP site
Fig. 4. Target vector 검증. (A) 제작된 conditional knock-out 벡터를 Flpe가 발현되는 SW105에 electrophoration하 여 배양하면 FRT franked-neo cassette가 제거된다(pX-ΔFRT). 이것을 다시 Cre recombinase가 발현되는 SW106에 electrophoration하여 배양하면 원하는 유전자가 제거된다(pX-Δexon). (B) 각 단계의 벡터 DNA 를 제한 효소 EcoRI으로 처리하여 전기영동 한 결과. 각각의 loxP 카세트가 도입 될 때마다 size가 증가 하였다가 Cre (pX-Δneo) 또는 Flpe (pX-ΔFRT) recombinase를 발현시켰을 때 원래의 크기로 돌아가는 것을 확인할 수 있다. 최종적으로 Cre recombinase에 의해 원하는 유전자가 제거된다 (pX-Δexon).
3. 두 번째 loxP 부위 삽입
두 번째 loxP 부위는 하나의 loxP 부위를 가지고 있는 FRT franked-neo DNA 조각을 지닌 플라스미드 (PL451)를 이용한다 (Fig. 3). 같은 방법으로 상동 재 조합이 일어나도록 Fig. 2에서 얻은 플라스미드를 대 상으로 새로운 PL451을 준비하여 세균에 넣는다 (Fig. 3). 이때 상동 재조합으로 PL451 유래 neo cassette가 들어가면 두 loxP 부위 내에 두 FRT 부위 가 놓이게 된다. 두 FRT 부위 사이의 neo cassette는 FLP recombinase로 잘라낼 수 있다10.
4. 검증하기
제작된 CKO 벡터를 검증하기 위해서는 Flpe가 발 현되는 세균 (SW105)에 넣어 FRT franked-neo cassette 를 제거한다. 제거된 CKO 벡터는 두 loxP 부위가 제 거하고자 하는 exon을 둘러싸면서 남게 된다. 다시
Cre가 발현되는 세균 (SW106)에 넣으면 원하는 exon 이 사라지게 된다 (Fig. 4). 이렇게 확인된 벡터는 Flpe가 작용하기 전 상태로 배아 줄기 세포에 넣어 유전자 적중에 쓰게 된다.
결 론
유전체 기능 연구는 유전자 적중 기술을 잘 이용 하면 가장 효율적인 방법으로 평가할 수 있다. 제대 로 된 유전자 적중 벡터를 효율적으로 만드는 것이 유전자 적중 기술에 핵심이다. Recombineering은 바 이러스에서 얻은 exo, bet, gam 유전자들을 이용하여 세균 내에서 외부 DNA 조각들 사이에 상동 재조합 이 잘 일어나게 하는 새로운 기술이다. Recombi- neering은 제한효소나 결합효소 없이 클로닝을 할 수 있는 획기적인 방법으로서 비단 유전자 적중 벡터 제작뿐 아니라 다양한 방면에 사용할 수 있는 강력
EcoRI EcoRI EcoRI pX-FRT
pX-ΔFRT
pX-Δexon
pX-ret : PL253 retrieved vector
pX-neo : PL253 retrieved vector containing 1st neo cassette floxed loxP site pX-Δneo : PL253 retrieved vector containing 1st loxP site
pX-FRT : PL253 retrieved vector containing 2nd neo cassette franked FRT site pX-ΔFRT : PL253 retrieved vector deleted 2nd neo cassette
pX-Δexon : PL253 retrieved vector deleted exon of gene X
A.
B.
한 도구로 많은 분야에 응용 가능할 것이다.
참 고 문 헌
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10. Buchhotz F, Angrand PO, Stewart AF. Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 1998;16(7):657-62.
￭ 국문초록 ￭
유전자 적중 기술에서 핵심은 타깃 벡터를 잘 만드는 것이다. 최근 제한효소나 결합효소 없이 타깃 벡터를 제작할 수 있게 되었다. 제한효소와 결합효소들 없이 벡터 제작이 가능한 것은 바이러스 유래 단백질들이 세균 내에서 상동 재조합의 기능을 향상 시킬 수 있기 때문이다. Recombineering은 박테리오파지 λ에서 얻은 exo, bet, gam 유전자들을 이용하여 세균 내에서 외부 DNA 조각들 사이에 상동 재조합이 잘 일어나게 하는 기술이 다. 이것은 타깃 벡터 제작뿐 아니라 여러 가지 용도로 응용 가능한 새로운 기술이다.
중심단어: 유전자 적중, 타깃 벡터, 상동 재조합, Recombineering
