신규

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Printed in the Republic of Korea

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신규 합성 당지질 함유 리포솜의 In Vitro 안정성

송충길·정순화·성하수·조선행·신병철*

한국화학연구원생체분자전달제어연구팀

(2006. 11. 13 접수)

In Vitro Stability of Liposomes Containing Newly Synthesized Glycolipid

Chung Kil Song, Soon Hwa Jung, Hasoo Seong, Sun Hang Cho, and Byung Cheol Shin*

Bioactive Molecules Delivery & Control Research Team, Korea Research Institute of Chemical Technology, P.O. box 107, 100 Jang Dong, Yuseong, Daejeon 305-343, Korea

(Received November 13, 2006)

요 약. 리포솜은수십~수백나노미터크기의소포체(small vesicle)로서약물전달에유용한구조체이나체

내 혈류 순환계(blood circulatory system)에서 구조적 불안정성에 의해 체내 순환시간이 짧고 세망내피계

(reticuloendothelial system)에의해소실되어이를개선하기위한다양한연구가시도되고있다. 본연구에서는

이당류(disaccharide)로서락토오스와슈크로스가 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-

sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE)과공유결합된새로운당-DSPE 유도체를합성하고이를리포솜의구

성성분으로하는리포솜을제조함으로써리포솜의표면이이당으로수식된리포솜을제조하였다. 제조된리포 솜의입자크기는대략 100 nm였으며, 표면전하값은당이수식되지않은대조군리포솜이 -10 mV를나타내

었으나당-DSPE 유도체를함유한리포솜의경우리포솜표면에존재하는당의수산화기에의하여표면전하

의값은 -25 mV를나타내었다. 리포솜내부에모델약물인독소루비신(doxorubicin)의로딩효율은약 90%를나

타내었다. 당-DSPE 유도체함유리포솜의 in vitro 안정성은혈청내에서단백흡착량의변화및리포솜의입

자크기를관찰하여평가하였다. 당-인지질유도체를함유한리포솜은당-인지질유도체를함유하지않은리포 솜또는폴리에틸렌글리콜(PEG) 수식리포솜에비해단백흡착의양과혈청내입자크기의변화가적은것으 로관찰되었다. 이당이결합된 DSPE와이를함유한리포솜은혈액내안정성이향상되어체순환계내에서장 시간순환이가능한약물전달체로서유용할것이라사료된다.

주제어: 리포솜, 이당, 안정성

ABSTRACT. Liposomes having particle size from several tens to hundreds nanometers are efficient carriers for inject- able drug delivery. Enhancement of liposome stability in bloodstream has been studied because of its relatively short cir- culation time and fast clearance from human body by reticuloendothelial system (RES) in blood vessel. In this study, new disaccharide-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE) derivatives in which lactose or sucrose as the disaccharide molecule was conjugated covalently to DSPE were synthesized. Liposomes of which surface had disaccharide molecules were prepared by incorporating the disaccharide-DSPE into liposomes as one of their lipid com- ponents. Particle size of the prepared liposomes was approximately 100 nm. The liposomes of which surface were modified with the disaccharide-DSPE showed -25 mV of zeta potential value due to the presence of hydroxyl groups on their surface, while the unmodified control liposomes showed -10 mV of zeta potential value. Loading efficiency of model drug, doxorubicin, into liposomes was about 90%. Stability of the disaccharide-modified liposomes in vitro was evaluated by monitoring the amount of protein adsorption and particle size of the liposomes in serum. Disaccharide-modified liposomes were more stable in serum than unmodified control liposomes or polyethyleneglycol (PEG)-modified

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liposomes due to less adsorption of serum protein and hence less increase of their particle size. The liposomes of which surface was modified with disaccharide-DSPE conjugate can be used as long-circulating carriers for drugs having high toxicity or short half-life time due to their enhanced stability in blood circulatory system.

Keywords: Liposome, Disaccharide, Stability

서 론

리포솜은인지질로구성되어이중막을형성하는소 포체로서사용되는지질의구성에따라표면전하, 이 중막의유동성그리고크기등을쉽게조절할수있 으며리포솜내부에친수성약물을봉입하거나이중 막사이에소수성약물을봉입할수있는장점을가 지고있다. 또한리포솜의구조는세포막의구조와비 슷하여독성이적고 세포와의융합이나 세포내이입

(endocytosis)을통한약물전달이 손쉬운약물전달체

로연구가활발히진행되고있다.^1-5하지만리포솜은 체내투여시간이나 비장의세망내피계와대식세포 에의하여쉽게흡수되어혈류 내반감기가급격히 떨어지게되는단점을가지고있다. 또한혈중단백 질의흡착및리포솜간의응집현상에의하여구조적 으로불안정하게되어봉입된약물이누출되어정상 세포에독성을끼치는문제를가지고있다.^6-7이러한 짧은체내순환시간을 극복하기 위하여생체 적합성 고분자및당류를리포솜의표면에결합시켜리포솜 의구조를안정화시키는방법이활발히연구되고있 다.^8-9예를들어 생체적합성고분자인 폴리에틸렌글 리콜을인지질과 결합하여 리포솜을제조하거나 폴 리에틸렌글리콜을함유한빗모양 고분자를 리포솜 의표면에수식하여친수성고분자에의한입체적인 장벽을만들어리포솜의구조적인 안정성을 증가하 는방법이사용되고있다.^또한^{세포표면에}^존재하는

당질층에과량으로존재하는당은 세포를보호하고 세포간의대사과정에 영향을끼치는것으로 알려져 있다.¹⁰^이를^모델로^하여^당을^리포솜의^표면에^수식

하여리포솜표면에당에의한친수성장벽을만들어 혈류내존재하는비특이적인단백흡착을방지하고 특정세포로향하게하는목적으로많은연구가되고

있다.^11-14^예를 ^들어 ^단당인^{갈락토오스와} ^만노오스,

이당인말토오스그리고다당인덱스트란, ^풀루란^같

이당을리포솜표면에 수식하거나모노시알로갱글 리오사이드(GM¹) ^같은 ^당지질을^사용하여^리포솜을

제조시혈류내안정성이증가되고단백질의흡착이 방지된다고보고되고있다.

본연구에서는리포솜의안정성향상및단백흡착 방지 목적으로올리고당이나 다당에비해구조적으 로간단하고친수성이좋은이당인락토오스와슈크 로스를인지질과 공유결합하여이당이표면에 수식 된리포솜을제조하여리포솜의구조적인안정성및 단백흡착등에미치는영향을살펴보았다. 이당과지 질을 결합하기위하여 락토오스와슈크로스를 카르 복시메틸화(carboxymethylation) 과정을통해 이당에 카르복시기를도입하였고카르복시기가도입된이당 을인지질과공유결합하여제조한이당-인지질유도 체를리포솜에사용하였다. 제조된리포솜의단백흡 착방지효과및안정성을평가하기위하여혈청단 백질에서의흡착량과소혈청내에서시간에따른리 포솜입자크기변화를측정하였다.

실험 방법

시약 및 기기

시약.이당인락토오스와슈크로스그리고이당의 카르복시메틸화를 위해 사용된 수산화나트륨과

chloroacetic acid를 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)에서구입하여사용하였다. 리포솜제조에사용 된지질인 L-^α-Phosphatidylcholine(soy- hydrogenated) (HSPC), Cholesterol(CHOL), 1,2-Distearoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine(DSPE) 및 1,2-Distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000)^는 Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster, AL, USA)에서구입하여사용하였다.

카르복시메틸화이당과 DSPE^를^{공유결합하기}^위

하여사용되는 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcar- bodiimide hydrochloride(EDC)^와 N-Hydroxysuccinimide (NHS)^는 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)^에서^구

입하여 사용하였다. ^모델 ^약물로는 ^{독소루비신} (doxorubicin, DOX)^을^보령제약(^주)^에서^구입하여^사

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용하였고, 그밖에실험에사용한클로로포름과메탄 올등은일급및특급시약을그대로사용하였다.

기기. 락토오스가결합된 DSPE(lactosyl-DSPE)와슈 크로스가결합된 DSPE(sucrosyl-DSPE)의구조는¹H- NMR(500MHz, Auto Sampler-HRMAS-FT-NMR, Bruker, Switzerland)과 FT-IR(Bomen 102 FT-IR spectroscopy)

을이용하여분석하였다. 리포솜제조시인지질필름 형성을 위하여 회전증발기(Buchi Rotavapor R-200,

Switzerland)를사용하였고, 리포솜의입자크기조절과

단일이중막제조를위하여가압압출기(Lipex extruders, Northern Lipid Ins, Canada)를사용하였다. 리포솜의 크기및표면전하는입도분석기(ELS-Z, Otuska, Japan)

를사용하여측정하였다. 리포솜내의약물봉입률은 자외선분광기(UV mini 1240, Shimadzu, Japan)를사 용하여측정하였다. 리포솜에대한 단백질의흡착량 측정은 ELISA reader(EL808, Bio-Tek Ins, USA)를사 용하여측정하였다.

이당의카르복시메틸화. 이당의일차알콜을카르 복시메틸화하기위해 3 mmol의락토오스와슈크로스를 물에용해시킨후수산화나트륨을 3.24 mol/anhydroglucose unit(AGU) ^첨가하여 25^oC^에서 1^시간^반응하여^일차

알콜을활성시킨후 2 mol/AGU의 chloroacetic acid를 첨가하여 50^oC에서 6시간동안용액의상태를확인하 면서반응하였다.^15-16

카르복시메틸화이당과DSPE의결합. DSPE^에^카

르복시메틸화이당을결합시키기 위하여 1 mmol의 카르복시메틸화이당, 2 mmol^의 EDC ^그리고 NHS^를

1 ml^의^물에^넣고^상온에서 2^시간^반응하여^카르복시

기를 활성화시킨후 50 µmol^의 DSPE^가^녹아 ^있는

20 ml ^{클로로포름과}^메탄올^{혼합용액을}^첨가하여 20

시간상온에서반응하였다. ^반응이^종결된^후^회전증

발기를사용하여클로로포름과메탄올혼합용매를제 거한후미반응카르복시메틸화이당, EDC ^및 NHS

를제거하기위하여 4^에서 48^시간^동안^막투석(MWCO

13,000, Viskase Co. Illinois, USA)^을^실시하여^제거하

였다. ^{카르복시메틸화}^이당과 DSPE^가^결합된 lactosyl- DSPE^와 sucrosyl-DSPE^는¹H-NMR^과 FT-IR ^분광분석

을통하여확인하였다.

리포솜의 제조및약물봉입.각리포솜제조에사 용된지질의종류와몰비율은대조군리포솜의경우

HSPC, CHOL, DSPE(12.6:8.2:1.1)^를^{사용하였고}^스텔스

리포솜은 HSPC, CHOL, DSPE-mPEG2000(12.6:8.2:1.1)

를사용하여리포솜을제조하였다. 그리고이당이결 합된 DSPE 함유 리포솜은 HSPC, CHOL, lactosyl- DSPE 또는 sucrosyl-DSPE(12.6 : 8.2 : 1.1)를사용하 여제조하였다리포솜의제조는각각의지질을클로

로포름과메탄올 2 : 1(v/v)로혼합한용매에용해시

킨후, 회전증발기를사용하여 50에서감압증류하여 둥근플라스크벽에얇은지질막을형성시켰다. 지질 막이형성된둥근플라스크는 12시간진공하에서잔

류용매를완전히제거시킨후형성된지질막을 250 mM

의암모늄설페이트 용액으로지질막이완전히 분산 될때까지수화하며리포솜을제조하였다. 리포솜입 자의크기를조절하기위하여가압압출기로 200 nm

그리고 100 nm의공극을갖는폴리카보네이트분리

막(Whatman, USA)을이용하여각각 5번씩가압압출

하였다. 리포솜내부에봉입되지않은암모늄설페이 트는 리포솜 용액을 4^oC에서 48시간동안 막투석

(MWCO 13,000)을실시하여제거하였다. 각리포솜

에독소루비신의봉입은리포솜내부와외부의암모 늄설페이트의농도편차를이용한리모트로딩방법을 사용하였고자외선분광장치를이용하여 490 nm에서 독소루비신의봉입률을측정하였다.¹⁷

리포솜의안정성평가. 제조된리포솜의 단백흡착 방지효과를평가하기위하여리포솜의단백흡착의양

을 bradford ^단백질^정량법을^사용하여^{측정하였다}.¹⁸

1 mg/ml ^소^혈청^단백질(Bovine Serum Albumin, BSA)

용액과제조된리포솜용액을 1 : 1(v/v)로혼합하여

37^에서 48^시간 ^동안^{교반하면서} ^{일정시간마다}^샘플

을 1 ml^씩^{채취하였다}. ^채취한^샘플은 13,200 rpm^에

서 10^분^동안^원심분리^한^후^상등액을^제거하고 PBS

1 ml^을^추가하여 ^리포솜에^흡착되지 ^않은 ^단백질을

원심분리하여제거하는과정을 2^회^반복하여^단백질

이흡착된리포솜만을얻었다. 96 well plate^에^단백질

이흡착된리포솜, 0.1 ml PBS ^그리고^단백질 ^측정

용액 0.1 ml^를^가한^후 ELISA reader^를^사용하여 590

nm^에서^흡광도를^측정하여^리포솜에 ^흡착된^단백질

의양을결정하였다. ^{단백질양의}^{검정곡선은} 1 mg/ml BSA ^용액을^사용하여^{작성하였다}. ^또한^리포솜의^입

자안정성을평가하기위하여소혈청내에서의입자 크기의 변화를관찰하였다. ^리포솜 ^용액과^소^혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)^을 1 : 1(v/v)^로^혼합하여 37^oC

에서 48^시간^동안^{교반하면서}^입자의^{크기변화를}^광

산란장치를이용하여측정하였다. ^리포솜의^단백흡

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착방지효과와입자안정성은 student’s t-test를통하여

P < 0.05에서통계적유의성이있다고확인하였다.

결과 및 고찰

이당과 인지질이결합된 당지질의합성. Fig. 1은

이당인락토오스와슈크로스를카르복시메틸화한후

인지질인 DSPE와합성하는경로를나타내었다. 이당

의카르복시메틸화는락토오스와슈크로스의일차알 콜을 수산화나트륨으로 1시간 동안 활성한 후

chloroacetic acid를통하여Fig. 1에서나타낸 R¹과같 이수소또는아세트산으로치환되었다. 카르복시메

Fig. 1. Synthetic scheme of lactosyl-DSPE (a) and sucrosyl-DSPE (b).

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틸화된이당이결합된인지질의구조는Fig. 2와Fig. 3

에서¹H-NMR과 FT-IR 분광분석을통하여확인하였

다. Fig. 2의 (a)에제시한 lactosyl-DSPE와 (b)에제시 한 sucrosyl-DSPE의구조는¹H-NMR 스펙트럼으로부

터 1.2 ppm에서 DSPE의알킬체인의 수소의 피크,

3.4~4.9 ppm에서락토오스와슈크로스에존재하는알

콜의수소의피크를확인함으로써 DSPE의말단에이 당의 결합된인지질의 구조를 확인하였다. 이당과

DSPE의결합이공유결합으로합성된것은 FT-IR 분 광분석을통하여확인하였고그결과를Fig. 3에나 Fig. 2. ¹H-NMR spectra of lactosyl-DSPE (a) and sucrosyl-DSPE (b). Disaccharides (3.4~4.9 ppm) were found in the lactosyl- DSPE and sucrosyl-DSPE.

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타내었다. Fig. 3의 (a)는 DSPE, (b)는 latosyl-DSPE 그 리고 (c)는 sucrosyl-DSPE의스펙트럼을나타내었다.

Fig. 3의 (b)와 (c)에서 3400 cm⁻¹에서이당인락토오 스와슈크로스의수산화기그룹의특성피크, 1565 cm⁻¹

및 1650 cm⁻¹에서아미드 결합의특성피크 그리고

1180 cm⁻¹에서에테르결합의특성피크를확인하였다.

Fig. 3의 (b)와 (c)에서에테르결합특성피크가나타 난것으로부터카르복시메틸화를확인할수있었고,

아미드결합특성피크로부터카르복시메틸화락토오 스와슈크로스가 DSPE와공유결합됨을확인하였다.

리포솜의물리적특성.본연구에사용된리포솜의 입자크기, 표면전하그리고약물의봉입률을Table 1. 에나타내었다. 대조군리포솜, 스텔스리포솜그리고 이당이결합된인지질을함유하는 리포솜의 크기는

100±15 nm 내외에서관찰되었으며, 이당이결합된인

지질을함유하는리포솜의크기증가는관찰되지않 았다. 리포솜표면전하를측정한결과, 대조군리포솜

은 -10 mV 정도의값을나타내었고, 스텔스리포솜

은 -20 mV 그리고이당이결합된인지질을함유하는

리포솜의경우는 -25 mV 정도의값을나타내었다. 대

조군리포솜에비하여스텔스리포솜과이당이결합 된인지질을함유하는리포솜의표면전하가낮은이 유는 스텔스리포솜의 경우폴리에틸렌 옥사이드의 영향으로 표면전하가대조군 리포솜에비해 낮아졌 으며, 이당이결합된인지질을함유하는리포솜의경 우이당의있는수산기에의하여낮아진것을확인할 수있었다. 이당이결합된인지질을함유하는리포솜 은리모트로딩방법에의한모델약물인독소루비신 의봉입률을측정한결과리포솜내의독소루비신의

봉입률은 90% 내외로측정되었다. 이당이결합됨으

로인하여표면전하의값은낮아졌으나리포솜의크 기나봉입률의영향은보이지않은것으로관찰되었 다. 이당이결합된인지질을함유하는리포솜은약물 전달체로사용시크기나봉입률에서의문제를보이 지않았다.

이당에의한리포솜의혈청안정성. 리포솜의단백 흡착방지에의한혈류내안정성을확인하기위하여

소혈청알부민(BSA) 용액을사용하여각리포솜들

의혈청단백흡착의양을측정하였다. ^Fig. 4^는^시간

에따른리포솜의단백흡착량을관찰한결과로서대 조군리포솜의경우단백흡착량은 3시간이내에 10µg

이상크게증가하였으며이후 48^시간^까지^큰^변화를

보이지않았다. ^스텔스^리포솜과^이당이^결합된^인지

질을함유하는리포솜의단백흡착량은 3시간이내에

3^µg ^이내이고 48^시간까지 6^µg ^이내로^관찰^되었다.

리포솜중 lactosyl-DSPE ^함유^리포솜의 ^{단백흡착량}

은 4^µg ^이내로^가장^뛰어난^단백흡착^방지^효과를^확

인하였다(p < 0.04). ^이러한^단백흡착^방지^효과는^리

포솜표면에당에의한친수성장벽을통하여비특 이적인단백질의흡착을방지한것으로보인다.

리포솜의혈류내입자안정성을 평가하기위하여 소혈청수용액에서리포솜의입자크기의변화를관 찰하였다. ^Fig. 5^는^시간에^따른^리포솜의^입자의^크

Fig. 3. FT-IR spectra of DSPE (a), lactosyl-DSPE (b) and sucrosyl-DSPE (c). Characteristic peaks from ether peak (1180 cm^-1) and amide peak (1565, 1650 cm^-1)was found in the disaccharide-modified DSPE spectra.

Table 1. Compositions and physical properties of liposomes

Name Composition Size(nm) Zeta Potential

(mV) Dox loading efficiency

Control liposome HSPC:CHOL:DSPE 96.5 ± 1.4 -10.4 ± 1.5 93.1(%)

Stealth liposome HSPC:CHOL:DSPE-mPEG2000 112.7 ± 1.2 -19.9 ± 3.0 90.9

Lactose-modified liposome HSPC:CHOL:lactosyl-DSPE 101.1 ± 0.1 -25.6 ± 6.5 88.3 Sucrose-modified liposome HSPC:CHOL:sucrosyl-DSPE 98.7 ± 1.9 -24.1 ± 6.2 91.9

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기를측정한결과로서대조군리포솜의크기는 1시간

째초기에비해 70 nm 이상증가하였으며측정이끝

나는 48시간까지 120 nm이상증가를관찰하였다. 스

텔스리포솜의경우 폴리에틸렌옥사이드의 영향으

로초기증가는적었으며 24시간이후 70 nm이상증

가를관찰하였다. 이당이결합된인지질을함유한리

포솜의경우는 24시간이후 50~60 nm의입자크기의

증가가관찰되었고 48시간까지 lactosyl-DSPE 함유리

포솜의 경우 60 nm내의 입자크기 변화를 보였고

sucrosyl-DSPE 함유리포솜의 경우 80 nm내의입자

크기 변화를확인하였으나통계적인차이를보이지

는않았다(p>0.4). 12시간이후의입자크기가급격히

증가하는 현상은리포솜입자표면에 흡착된단백질 에의한입자크기증가외에도리포솜의구조적인불 안정에의한 리포솜간의응집현상과 시간경과에따 른혈청의오염에의해발생되는단백질간의응집현 상에의해서입자크기가급격이증가한것으로사료 된다. 결과와같이이당이결합된인지질을함유한리 포솜의혈청내입자크기변화는대조군리포솜과스 텔스리포솜의경우보다작은것을확인할수있었 으며 리포솜표면에존재하는 락토오스와슈크로스 에의하여혈류내안정성이증가되는것을확인할 수있었다.

혈류내리포솜의입자크기와단백흡착의증가는 혈관을막거나간이나비장의세망내피계에의한소 실을유도한다. 그러므로이당이결합된인지질을함 유한리포솜의경우입자크기증가와단백흡착을방 지하는좋은 약물전달체로서 사용이용이할것으로 사료된다.

결 론

본연구에서는혈류내안정성증가를위하여이당 인락토오스와슈크로스를카르복시메틸화하여지질

인 DSPE^와^{공유결합을}^통하여^합성한^후^이를^이용

하여리포솜을제조하였고, 리포솜의안정성은 혈청 단백흡착의양과혈청내크기변화를측정하여평가

하였다. ^이당이 ^결합된 ^인지질인 lactosyl-DSPE^와

sucrosyl-DSPE^의^결합은¹H-NMR^을^통하여 DSPE^에

결합된이당을확인하였고 FT-IR ^{분광분석을}^통하여

카르복시메틸화에의하여 생긴에테르결합과 공유 결합인아미드결합을확인할수있었다. ^이당이^결

합된인지질이함유된리포솜의혈류내안정성을확 인한결과대조군그리고스텔스리포솜에비하여혈 청단백질의흡착량과소혈청내크기의변화가적 은것을관찰할수있었다. ^그중 lactosyl-DSPE ^함유

리포솜의경우 sucrosyl-DSPE ^함유^리포솜의^경우보

다도 단백흡착량의변화가적은 것으로관찰되었으 나혈청내입자크기의변화는통계적인차이를보이 지않았다. ^이당이^{결합함으로}^인하여^혈류^내^안정

성의증가하는 이유는 DSPE^의^말단에^결합된^락토

오스와슈크로스가리포솜의표면에당에의한친수 Fig. 4. Protein adsorption of various liposomes after incu-

bation in bovine serum albumin solution at 37^oC. control liposome (■), sucrose-modified liposome ( ), lactose- modified liposome ( ) and stealth liposome (▼).

Fig. 5. Particle size of various liposomes after incubation in fetal bovine serum at 37^oC. control liposome (■), sucrose- modified liposome ( ), lactose-modified liposome ( ) and stealth liposome (▼).

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성장벽을구성함으로서혈청내존재하는단백질들 의흡착을막아주어리포솜의안정성증가에사용되 는폴리에틸렌글리콜과같은역할을하는것으로확 인되었다. 따라서이당이결합된인지질을사용한리 포솜은단백흡착방지및안정성을증가시키는물질 로혈류내순환시간을 증가시키는약물전달체로서 유용할것으로보인다.

본연구는산업자원부차세대성장동력개발사업 중방출조절형약물전달체계개발사업으로이루어진 것으로이에감사드립니다.

인 용 문 헌

1. Bangham, A. D.; Standish, M. M.; Watkis, J. C. J. Mol.

Biol. 1965, 13, 238.

2. Allen, T. M.; Moase E. H. Adv. Drug Delivery. Rev.

1996, 21, 117.

3. Sharma, A.; Sharma, U. S. Int. J. Pharm. Biopharm.

1997, 154, 123.

4. Van Slooten, M. L.; Boerman O.; Romøren, K.; Kedar, E.; Crommelin, D. J. A.; Storm, G. Biochim. Biophys.

Acta2001, 1530, 134.

5. Torchilin, V. P. Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4, 145.

6. Moghimi, S. M.; Szebeni, J. Prog. Lipid Res.2003, 42, 7. Liu, D. 463. Adv. Drug Delivery. Rev.1997, 24, 201.

8. Vertut-Doï, A.; Ishiwata, H.; Miyajima, K. Biochim.

Biophys. Acta1996, 1278, 19.

9. Song, C. K.; Hwang, T.; Seong, H.; Park, E. S.; Shin B.

C. J. Kor. Pharm. Sci.2006, 50, 216.

10. Albert, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.

Walter, P. Molecular Biology of the Cell, fourth ed., Garland Science, New York, 2002, p 612.

11. Medda, S.; Mukherjee, S.; Das, N.; Naskar, K.; Mahato, S.

B.; Basu, M. K. Biotechnol. Appl. Biochem.1993, 17, 37.

12. Xu, Z.; Jayaseharan, J.; Marchant, R. E. J. Colloid Inter- face Sci.1996, 118, 6101.

13. Cansell, M.; Parisel, C.; Jozefonvicz, J.; Letourneur, D.

J. Biomed. Mater. Res.1999, ⁴⁴, 140.

14. Allen, T. M.; Hansen, C.; Rutledge, J. Biochim. Bio- phys. Acta1989, 981, 27.

15. Varshney, V. K.; Gupta, P. K; Naithani, S.; Khullar, R.;

Bhatt, A.; Soni, P. L. Carbohyd. Polym. 2006, 63, 40.

16. Heinze, T.; Pfeiffer, K. Macromol. Mater. Eng.1999, 266, 37.

17. Haran, G.; Cohen, R.; Bar, L. K.; Barenholz, Y. Bio- chim. Biophys. Acta1993, 1151, 201.

18. Baumgarten, H. J. Immunol. Methods1985, 82(1), 25.