Protective Effect of Jujube Water Extract against UVB-Induced Skin Photoaging in Human Skin Fibroblasts

UVB로 손상된 인간 피부 섬유아세포에서 대추 물 추출물의 피부 보호 효과

⁃ 연구노트 ⁃

홍성화¹․이하나¹․정택영¹․김영화²․정헌상¹․이준수¹

1충북대학교 식품생명축산과학부

2경성대학교 식품응용공학부

Protective Effect of Jujube Water Extract against UVB-Induced Skin Photoaging in Human Skin Fibroblasts

Seonghwa Hong

, Hana Lee

, Taekyoung Jeong

, Younghwa Kim

, Heon Sang Jeong

, and Junsoo Lee

1Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University

2School of Food Biotechnology and Nutrition, Kyungsung University

ABSTRACT Skin is damaged by intrinsic and extrinsic factors, such as aging, ultraviolet (UV) light, and pollutants.

UV irradiation induces the synthesis of matrix metalloproteinases (MMPs) and collagen degradation, which in turn causes skin photoaging and photocarcinogenesis. This study examined the anti-photoaging activity of jujube water extract (JWE) against UVB-induced damage in human fibroblast (Hs68 cells). The JWE did not show any cytotoxicity up to 50 µg/mL. Treatment with JWE prevented UVB-induced cytotoxicity in Hs68 cells. The protective effect of JWE appeared to be mediated by inhibiting intracellular reactive oxygen species by 21, 25, and 27% at a concentration of 12.5, 25.0, and 50.0 µg/mL, respectively. UVB increased the production of MMP-1/3 and decreased collagen synthesis.

On the other hand, treatment of JWE attenuated the UVB-induced production of MMP-1/3 and prevented the reduction of collagen. These results suggest that JWE has a considerable inhibitory effect on the photoaging induced by UVB irradiation. This study showed that JWE could be used as a photo protective agent in cosmetic products.

Key words: jujube, photoaging, collagen, fibroblast

Received 15 July 2019; Accepted 18 September 2019

Corresponding author: Junsoo Lee, Department of Food Science and Biotechnolgy, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-43-261-2566 Author information: Seonghwa Hong (Graduate student), Hana Lee (Graduate student), Taekyoung Jeong (Graduate student), Young- hwa Kim (Professor), Heon Sang Jeong (Professor), Junsoo Lee (Professor)

서 론

피부는 미생물의 침입, 독성 물질 및 자외선과 같은 외부 환경적인 손상으로부터 신체를 보호하는 주요 방어막이다 (Sun 등, 2015). 피부 노화는 외인성 및 내인성 요인에 기인 하여 나타날 수 있는데, 이는 주로 주름, 처짐, 이완을 일으킨 다(Jenkins, 2002; Takema 등, 1994). 환경오염으로 인해 지표면에 도달하는 자외선의 양은 해마다 증가하고 있으나 현대인의 취미생활을 위한 야외활동 및 여행인구는 증가하 고 있고 각종 스트레스와 서구화된 생활습관 또한 피부건강 을 위해하는 요소들로 작용하고 있다(Gies 등, 1998). 그중 에서도 피부 건강을 해치는 주요 원인인 자외선은 피부에 직접적으로 노출되므로 이에 대한 관심이 급증하고 있다.

자외선A와 자외선B의 경우 피부의 탄력 저하, 주름 형성, 홍반과 같은 노화현상과 관련된 증상을 유발하며, 자외선C 는 피부암과 같은 병변을 유발한다고 알려져 있다(Treme- zaygues 등, 2006). 햇빛으로부터의 자외선, 특히 파장이 280~320 nm인 ultraviolet B(UVB)는 세포외 기질(extra- cellular matrix, ECM)의 주요 구성 요소인 콜라겐을 파괴 함으로써 피부 조직에 뚜렷한 변화를 일으킨다(Gancevi- ciene 등, 2012). UVB는 또한 활성산소종(reactive oxy- gen species, ROS)의 생성을 촉진시킨다. 이러한 비정상적 인 활성산소종의 증가는 체내 항산화 방어체계가 손상되어 산화적 스트레스를 일으키며, 표피의 각질 형성세포에서 염 증성 사이토카인 분비를 촉진시켜 진피 섬유아세포에서 matrix metalloproteinases(MMPs)를 유도하여 피부 노화 를 촉진한다고 알려져 있다(Fisher 등, 1998; Oh 등, 2004).

극히 낮은 양의 UVB 조사일지라도 사람의 피부에서 MMP 를 활성화할 수 있으며, 이는 피부의 주요 구조 성분인 콜라 겐과 엘라스틴의 합성을 억제하여 주름을 형성한다고 보고 되어 있다(Chatterjee 등, 1990; Kähäri와 Saarialho-Kere, 1997).

대추는 페놀성 물질이 풍부한 식품이며 옛날부터 이용하 여온 식품이다(Gao 등, 2013). 대추의 효능에 대한 연구 보

고는 항산화 작용(Park과 Kim, 2016), 항염증 작용(Park 등, 2014), 혈당조절 작용(Park 등, 2017), 파골세포의 분화 억제 작용(Yoon 등, 2014) 등이 있다. 대추열매에는 당질과 비타민 C가 다량 함유되어 있으며, 스테롤이나 알칼로이드 와 사포닌 등이 풍부하다(Jung과 Cho, 2014). 또한 트리테 르페노이드 성분이 함유되어 있어 항균과 항염 등의 생리활 성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다(Lee 등, 2004). 최 근 부작용이 적은 식물 추출물에서 피부 노화를 억제하는 기능성 소재를 탐색하는 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이들은 대부분 식물의 2차 대사산물로서 폴리페놀 및 플라 보노이드 등과 같은 생리활성 물질을 다량 함유하고 있어, 복합적인 생물학적 효과를 가진다고 보고되어 왔다(Mas- teikova 등, 2008). 이러한 연구에 근거하여 본 연구에서 사용한 대추의 광노화 억제 효능에 대해 기대할 수 있으며, 추출물의 보호 효과 입증으로 천연 기능성 소재로의 활용을 증가시킬 수 있다. Choi와 Kim(2009)은 대추의 열수 추출 물이 피부 내 염증 및 장벽 손상을 완화한다고 보고하였다.

하지만 대추 물 추출물의 UVB로 유도된 피부손상 완화에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 대추 물 추출물을 제조하여 UVB를 조사한 인간의 피부 섬유아세 포의 광노화에 미치는 보호 효과를 검증하고 화장품 소재로 서의 가능성을 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

대추 물 추출물 제조

본 연구에 사용한 대추는 보은군에서 구입하여 대추 과육 과 씨를 분리하였다. 그리고 껍질을 포함한 대추 과육을 증 류수로 수세하여 동결건조 하였다. 분말 형태로 분쇄한 후 20 g을 취하여 물 500 mL를 넣고 24시간 동안 실온에서 shaker를 이용하여 추출하였다. Advantech No. 2 filter paper(Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 이용하여 필터한 후 동결건조 하였다. 동결건조 된 추출물을 증류수에 재용해한 후 0.22 μm 멸균 필터로 여과하고 분석 전까지 -20°C에서 보관하였다.

세포 배양 및 세포독성 실험

본 실험에 사용된 인간 피부 섬유아세포주인 Hs68 세포 는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 10% fetal bovine serum(FBS)과 penicillin(100 unit/mL), streptomycin(50 μg/mL)이 함유 된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂, 95% humid air로 조절된 배양기 (Thermo Scientific, Tewksbury, MA, USA)에서 배양하 였다. Hs68 세포는 96-well plate에 1.0×10⁴ cells/well의 농도로 분주하였다. 24시간 배양 후 FBS가 함유되지 않은 DMEM에 대추 물 추출물을 12.5, 25.0, 50.0 μg/mL로 희석 하여 처리하였다. 24시간 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, 5 mg/mL) 용액 20 μL를 각 well에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다.

이때 생성된 청색 formazan 결정을 DMSO로 용해시켜 mi- croplate reader(BioTek, Inc., Winooski, VT, USA)를 사 용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

UVB 조사

Hs68 세포를 96-well plate에 1.0×10⁴ cells/well의 농 도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 각 well에 FBS가 없 는 배지로 시료를 희석한 다음 처리하여 24시간 동안 배양 하였다. 그 후 UVB lamp(Sankyo Denki Lamps, GL20SE, Marine, Tokyo, Japan)를 이용하여 UVB(30 mJ/cm²)를 조 사하였고, UV light meter(LT Lutron, UV-340A, Taipei, Taiwan)를 사용하여 자외선 강도를 모니터링 하였다. 모든 UVB 조사는 96-well plate에 부착된 세포에 phosphate buffered saline(PBS)을 얇게 도포한 후 수행하였다. 조사 후 FBS가 없는 배지로 시료를 희석하여 24시간 동안 세포 에 처리하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 동일한 조건으로 진행되었다.

활성산소종 측정

Hs68 세포에 대추 물 추출물을 농도별로 전처리하였다.

24시간 후 PBS로 세척한 다음 UVB(30 mJ/cm²) 조사하였 다. UVB 조사 후 30분간 대추 물 추출물을 농도별로 처리한 다음 25 μM의 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate(DCFH- DA)로 염색하였다. ROS 생성을 나타내는 형광 강도를 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서 2시간 동안 fluorescent spectrophotometer(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)로 측정하였다(Jeon 등, 2017).

MMP-1, MMP-3 및 수용성 콜라겐 측정

MMP-1과 MMP-3의 생성량을 측정하기 위하여 human MMP-1 ELISA kit, human MMP-3 ELISA kit(Merck &

Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)을 이용하여 배지 중의 MMP-1과 MMP-3 생성량을 측정하였다. UVB 조사 후 콜라겐 생성량은 Sircol^TM soluble collagen assay kit (Biocolor, Carrickfergus, UK)을 이용하여 측정하였다.

통계처리

통계처리는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(Graphpad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 실시하였다.

데이터 간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA를 이용하 였고, Tukey’s post hoc test를 통해

P

결과 및 고찰

세포독성 및 UVB 자극에 대한 대추 물 추출물의 피부 보호 효과

CON 12.5 25 50 100 0

50 100 150

JWE (μ g/mL) AA (μM)

Cell viability (% of control)

0 50 100 150

JWE (μg/mL)

###

*** *** *** ***

UVB

- + + + + +

12.5 25 50 100 AA (μM)

Protective effect (% of control)

A B

Fig. 1. Cytotoxicity (A) and protective effect (B) of the jujube water extract in Hs68 cells. Each value is expressed as a mean±standard deviation (n=3). CON, untreated cells; JWE, jujube water extract; AA, ascorbic acid (positive control). ^###P<0.001 versus control group and ^***P<0.001 versus UVB group by ANOVA and the Tukey-Kramer method.

0 20 40 60 80 100

###

*** *** *** ***

JWE (μg/mL)

UVB

- + + + + +

AA (μM) Fluorescence intensity at 60 min (arbitrary unit)

0mi n

20min

40min 60m

in 0

20 40 60 80 100

CON UVB

UVB + JWE(12.5μg/mL) UVB + JWE(25μg/mL) UVB + JWE(50μg/mL) UVB + ASA(100μM)

Time A

Fluorescence intensity (arbitrary unit)

A B

Fig. 2. Effects of the jujube water extract on time course of ROS generation (A) and ROS production at 60 min (B) in UVB-induced Hs68 cells. Each value is expressed as a mean±standard deviation (n=3). CON, untreated cells; JWE, jujube water extract; AA, ascorbic acid (positive control). ^###P<0.001 versus control and ^***P<0.001 versus UVB group by ANOVA and the Tukey-Kramer method.

본 연구에서 사용한 대추 물 추출물의 수율은 44.6%였다.

대추 물 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. UVB 비조사군에 추출 물을 12.5, 25.0, 50.0 μg/mL 농도로 처리했을 때 모든 농도 에서 세포독성이 보이지 않았다(Fig. 1A). 그 후 Hs68 인간 피부 섬유아세포에 30 mJ/cm²의 UVB를 조사한 결과 세포 생존율이 약 62% 수준으로 감소하였으며 대추 물 추출물을 처리하였을 때 UVB 조사군에 비해 세포 생존율이 약 100%

까지 증가하는 결과를 보였다(Fig. 1B). Kim(2017)은 익모 초 추출물이 Hs68 세포를 대상으로 UVB를 조사하였을 때 세포 생존율을 증가시켜 광노화에 대한 세포 보호 효과가 있다고 보고하였다. 이 결과를 통해 대추 물 추출물이 UVB 에 의해 유도된 피부 세포 손상을 보호하는 효과가 있다는 것을 확인하였다.

UVB 자극에 따른 ROS 생성에 대한 대추 물 추출물의 효과

유기 유도체(non-radical oxygen derivatives)를 총칭하 며 정상 산소성 개체(aerobic organism)는 ROS 발생과 항 산화 방어제가 서로 균형을 이루고 있다. 그러나 superoxide, hydrogen peroxide 및 lipid peroxyl radical 등을 포함한 ROS는 피부세포의 염증반응을 야기시키며 직접적으로 세 포 신호전달 과정을 매개하고 조직 손상을 유발한다(Halli- day, 2005). 따라서 본 연구에서는 대추 물 추출물이 자외선 조사에 의해 일어나는 피부 섬유아세포 내의 활성산소 생성 억제 효과를 알아보기 위해, 세포에 UVB 조사 후 DCFH- DA를 이용하여 평가하였다. UVB 조사는 세포 내 ROS 생성 을 크게 증가시켰지만, UVB 조사 전 대추 물 추출물을 12.5

~50.0 µg/mL 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 유의적 으로 ROS의 생성을 억제하는 결과가 나타났다(Fig. 2). Lee 등(2019)은 오가피 순 메탄올 추출물을 처리하였을 때 UVB 조사로 인한 ROS 생성을 감소시킨다고 보고하였다. 본 연구 에서도 대추 물 추출물이 UVB에 의한 산화적 손상을 억제 하는 소재로서의 가능성을 확인할 수 있는 결과로 사료된다.

0 500 1000 1500

### ** *** *** ***

UVB - + + + + +

12.5 25 50 100

JWE (μg/mL) AA (μM)

30 mJ/cm² Collagen (μg/mL)

Fig. 4. Effect of the jujube water extract on soluble collagen content in UVB-induced Hs68 cells. Each value is expressed as a mean±standard deviation (n=3). JWE, jujube water extract;

AA, ascorbic acid (positive control). ^###P<0.001 versus control group and ^***P<0.001, ^**P<0.01 versus UVB group by ANOVA and the Tukey-Kramer method.

0 1 2 3

###

* ** ** *

- + + + + +

12.5 25 50 100 JWE (μg/mL) AA (μM)

UVB 30 mJ/cm²

MMP-1 production in the culture medium (ng/mL)

0 5 10

15 ###

* * **

- + + + + +

12.5 25 50 100

UVB 30 mJ/cm²

JWE (μg/mL) AA (μM) MMP-3 production in the culture medium (ng/mL)

A B

Fig. 3. Effect of the jujube water extract on MMP-1 (A) and MMP-3 (B) production in UVB-induced Hs68 cells. Each value is expressed as a mean±standard deviation (n=3). JWE, jujube water extract; AA, ascorbic acid (positive control). ^###P<0.001 versus control group and ^**P<0.05, ^*P<0.1 versus UVB group by ANOVA and the Tukey-Kramer method.

UVB 자극에 따른 MMP-1, MMP-3 및 수용성 콜라겐 생성 에 대한 대추 물 추출물의 효과

콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부 의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피 층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부의 노화와 매우 밀접한 관계를 가지고 있다(Huang 등, 1997). MMP는 활성중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내 에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비된다. 효소 활성 을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화되며 활성화된 MMP는 α2-macroglobulin이 나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 keratinocyte, fi- broblast를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한 다(Fisher 등, 1999). 한 번의 UV 조사에도 피부 내의 MMP 활성이 증가하여 피부 내 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로 써 광노화에 매우 중요한 역할을 한다고 보고된 바 있다(Lee 등, 1998). UVB 조사 후 증가한 MMPs에 대한 대추 물 추출 물의 억제 효과를 확인하기 위해 MMP-1과 MMP-3의 생성 량을 측정하였다. 대추 물 추출물은 UVB 조사로 증가한 MMP-1의 생성량을 12,5, 25.0, 50.0 µg/mL의 농도에서 각각 37, 39, 57%로 억제하였고, 50 µg/mL의 농도에서는 ascorbic acid와 유사한 수준의 억제 효과를 보였다(Fig.

3A). MMP-3의 생성량 또한 대추 물 추출물이 각각 UVB 조사군 대비 4, 25, 30%로 감소시켰다(Fig. 3B). 수용성 콜 라겐 생성을 측정한 결과 MMPs의 억제 효과와 같은 경향으 로 나타났다. UVB에 의해 감소한 콜라겐의 함량을 대추 물 추출물을 처리하였을 때 각각 24, 36, 45%로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 특히 MMPs의 억제 효과가 가장 좋았 던 50.0 µg/mL의 농도에서 콜라겐의 함량도 가장 높게 측정 되었다. 대추에는

p

놀성분들 중

p

Balupillai 등, 2018), ferulic acid는 UVB로 유도된 MMPs 의 억제 효과가 있다고 보고되어 있다(Staniforth 등, 2012). 플라보노이드들 중 quercetin과 catechin 또한 UVB 에 대한 피부 보호가 보고되어 있다(Vicentini 등, 2008; Wu 등, 2006). 따라서 본 연구에서는 대추 물 추출물의 페놀산 성분 및 플라보노이드가 UVB 조사에 의한 MMPs의 생성량 을 감소시키고, 콜라겐의 생성량을 증가시켜 피부 광노화로 부터 보호 효과가 있다고 사료된다.

요 약

피부 노화는 시간의 흐름에 따른 생리적 노화과정과 외인적 요인에 의한 노화과정으로 나누어진다. 피부 노화에 영향을 미치는 외부인자들 중 자외선에 의한 노화를 광노화라고 한 다. 본 연구는 Hs68 세포를 이용하여 대추 물 추출의 피부

광노화에 대한 보호 효과를 평가하였다. 대추 물 추출물은 50.0 µg/mL까지 세포독성을 보이지 않았고, UVB 자극에 대한 보호 효과는 모든 농도에서 유의적으로 증가하였으며, 특히 25.0, 50.0 µg/mL 농도에서는 ascorbic acid 100 µM 과 비슷한 수준의 광노화 보호 효과가 나타났다. 대추 물 추출물은 UVB 조사로 유도된 ROS의 생성량을 60분대에 12.5, 25.0, 50.0 µg/mL 농도에서 각각 21, 25, 27% 감소시 켜 피부의 산화적 손상을 억제하였다. 또한 대추 물 추출물 이 UVB에 의한 MMP-1과 MMP-3의 생성량 증가를 유의 적으로 억제하였으며, UVB에 의해 감소한 콜라겐 생성량을 유의적으로 증가시켰다. 본 연구를 통해 대추의 물 추출물이 UVB로부터 인간 피부 섬유아세포에서 보호 효과를 나타냄 을 확인하였다. 따라서 대추 물 추출물이 광노화에 보호 작 용을 갖는 기능성 화장품 소재로 활용될 수 있을 것으로 기 대된다.

감사의 글

본 연구는 보은군 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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