피부 섬유아세포에서 광노화에 대한 오가피순 메탄올 추출물의 피부 보호 효과
⁃ 연구노트 ⁃
이하나․홍성화․허희진․최현정․정헌상․이준수 충북대학교 식품생명·축산과학부
Protective Effects of Methanol Extract from Acanthopanacis cortex Shoots against Photoaging in Human Skin Fibroblast
Hana Lee, Seonghwa Hong, Huijin Heo, Hyeonjeong Choe, Heon Sang Jeong, and Junsoo Lee Division of Food and Animal Sciences, Chungbuk National University
ABSTRACT Exposure to ultraviolet (UV) light can cause skin photoaging, which is characterized by thickening, wrinkling, pigmentation, and dryness. Ultraviolet exposure is also closely associated with down-regulation of collagen synthesis and up-regulation of matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we investigated the protective effects of methanol extract from Acanthopanacis cortex shoots (ACS) against UVB-induced photoaging in human skin fibro- blasts (Hs68 cells). The ACS extract did not show any cytotoxicity at levels up to 50 µg/mL. The extract showed protective effects against UVB-induced (30 mJ/cm2) cell damage in a dose dependent manner. In addition, the extract significantly reduced UVB-induced generation of reactive oxygen species by 11, 18.2, and 31.6% at concentrations of 12.5, 25, and 50 µg/mL, respectively, when compared to UVB-irradiation alone. The extract prevented decreases in collagen levels by inhibiting the increases in MMP-1 and MMP-3 levels caused by exposure to UVB-irradiation in Hs68 cells. Taken together, these data indicate that methanol extract from ACS exerts anti-photoaging activities and therefore has the potential for use in cosmeceutical preparations.
Key words: photoaging, fibroblast, collagen, Acanthopanax cortex shoots
Received 31 December 2018; Accepted 22 January 2019 Corresponding author: Junsoo Lee, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-43-261-2566 Author information: Hana Lee (Graduate student), Seonghwa Hong (Graduate student), Huijin Heo (Graduate student), Hyeonjeong Choe (Graduate student), Heon Sang Jeong (Professor), Junsoo Lee (Professor)
서 론
최근 현대인들의 경제 수준이 향상되고 사회생활의 참여 도가 높아지면서 피부 미용에 대한 관심이 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부 노화 과정을 지연시키고 방지하여 건강 한 피부를 유지하고자 미용 관련 기능성 화장품 및 식품이 개발되고 있고, 특히 피부 주름 완화와 개선을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Yaar와 Gilchrest, 1998). 인간의 피 부는 시간이 지남에 따라 유발되는 내인성 노화와 오염된 공기나 약물, 온도, 자외선 등에 의한 외인성 노화로 나뉜다.
특히 자외선에 의한 광노화는 피부의 두께를 감소시키고 주 름이 증가하며 탄력을 감소시킨다고 보고되었다(Park 등, 2011). 자외선은 파장에 따라 UVA(320~400 nm), UVB (280~320 nm) 및 UVC(200~280 nm) 세 가지 타입으로 구분되는데, 이 중 UVC는 대부분 오존층에서 흡수되므로
UVA와 UVB가 인체 피부에 영향을 미치는 주요 자극이 되 는 것으로 알려져 있다(Pandel 등, 2013). 자외선 노출은 피부에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 촉진해 광노화 현상뿐 아니라 피부암까지도 유발할 수 있다. 지속해서 자외선에 노출 시 피부세포 안에서는 ROS 의 과도한 생성과 함께 항산화 시스템의 균형이 깨지게 된 다. 과도한 ROS 생성에 의해 피부세포에서는 염증반응이 일어나고 직접 세포 신호전달 과정을 매개해 피부 매트릭스 조직을 파괴하며 세포 내 구조 및 세포막을 손상시켜 피부 주름과 같은 노화를 가속화한다고 알려져 있다(Brennan 등, 2003; Krutmann과 Schroeder, 2009; Kim 등, 2012). 콜 라겐 분해효소의 증가 또한 콜라겐 섬유의 변성 및 파괴를 일으키는 중요한 원인 중 하나로 보고되어 있으며, 생체 내 에서 생성된 ROS는 matrix metalloproteinases(MMPs)와 같은 콜라겐 분해효소의 활성을 촉진하고 콜라겐의 합성을 억제함으로써 피부의 탄력을 감소시키고 주름의 생성을 촉 진하는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2010). 그러므로 활성 산소를 제거하는 항산화 물질이나 콜라겐 분해효소의 작용 을 억제하고 콜라겐 합성을 증가시키는 소재의 발굴이 중요 하다고 할 수 있다. 최근 자외선으로부터 피부 보호에 효과 적인 천연소재 발굴에 관심이 높아지고 있으며, 그 범위는 내륙 식물에서부터 해양 동식물까지 광범위하게 포함된다.
천연에서 유래한 성분을 자외선 차단제로 완벽하게 대체할 수는 없으나 많은 천연소재가 항산화 기능을 가지고 있으므 로 화장료에 사용될 시 자외선으로부터 야기되는 피부 노화 방지에 적합할 것으로 생각된다(Svobodova 등, 2006).
가시오가피(Acanthopanax senticosus)는 한반도와 일 본, 중국, 시베리아 등의 고지대에 자생하는 다년생 낙엽관 목이다(Lim 등, 2007). 가시오가피 추출물은 UVB가 조사 된 무모쥐(hairless mouse)에 경구 투여했을 때 콜라겐 조 직의 파괴를 억제하고 콜라겐 생성을 촉진했다고 보고되었 다(Park 등, 2010). 오가피(Acanthopanacis cortex)는 오 갈피나무로 독성 및 부작용이 없는 생약제로 사용돼 왔으며, 주로 동양권에서는 신경통, 이뇨, 식욕 부진, 고혈압의 치료 와 예방의 목적으로 오가피의 뿌리와 껍질을 이용하였다 (Hahn 등, 1985; Kim과 Park, 2006). 오갈피나무는 잎사귀 의 모양이 인삼과 매우 흡사할 뿐 아니라 그 효능 면에서도 인삼 못지않기 때문에 나무인삼 또는 나무산삼이라고 부르 기도 한다(Lyu 등, 2006). 흰털오가피 잎은 자외선으로 인 한 피부세포 내 과산화수소 및 과산화지질의 생성량을 감소 시키며 항산화 효소의 활성을 증가시킨다고 보고되어 있다 (Shin 등, 2007). 또한, 오가피의 부위별 열수 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 뿌리와 잎에서 가장 높은 수치를 나타낸다고 보고되어 있다(Choi 등, 2011; Heo 등, 2011). 플라보노이드와 같은 페놀성 화합물들은 활성산소 를 제거하는 역할을 수행한다고 보고되어 있다(Ames 등, 1993). 오가피순은 두릅순과 같이 대표적인 햇순나물로 가 시오가피에 비해 오가피순의 성분 및 효능에 대한 연구는 아직 초기 단계에 불과하다. 국내에서는 주름개선 효과를 가지는 기능성 화장품이 관심을 끌고 있다. 주름개선 효과에 관한 연구를 살펴보면 생약재 추출물로부터 피부 주름 개선 소재를 발굴하였고 이러한 연구에 근거하여 본 연구에 사용 한 오가피순의 UVB에 대한 피부 보호 효과를 기대할 수 있으며, 오가피순의 기능성 입증을 통해 천연 기능성 소재로 의 활용을 증가시킬 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 오가피순의 메탄올 추출물을 제조하여 UVB 조 사로 유도한 피부 섬유아세포의 광노화에 미치는 보호 효과 를 검증하고 화장품 소재로서의 가능성을 밝히고자 하였다.
재료 및 방법
추출물 제조
오가피순은 한번 수세한 후 건조하고 분쇄기(JL-1000, Hibell, Hwaseong, Korea)를 이용하여 분말로 만들었으며 3 g을 취하여 메탄올 100 mL를 넣고 shaking incubator (VS-8480, Vision Scientific, Daejeon, Korea)를 이용하 여 24시간 동안 실온에서 추출하였다. Whatman No. 2 fil- ter paper(Whatman International, Kent, UK)를 이용하여 여과한 후 추출물을 40°C 이하에서 감압 농축하였다. 농축 액을 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 재용해한 후 0.22 μm
멸균 필터로 여과하고 분석 전까지 -20°C에서 보관하였다.
세포배양 및 세포 독성 실험
인간 섬유아세포주인 Hs68 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입 하여 사용하였다. Fetal bovine serum(FBS, 10%)과 pen- icillin(100 unit/mL), streptomycin(50 µg/mL)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용하 여 37°C, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기(Ther- mo Scientific, Tewksbury, MA, USA)에서 배양하였다.
Hs68 세포를 96-well plate에 1.0×104 cells/well의 농도 로 분주하였다. 24시간 배양 후 FBS가 없는 배지에 시료를 희석하여 24시간 배양하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, 1 mg/mL) 용액 20 μL를 각 well에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다.
마지막으로 상층액을 제거하고 생존 세포에서 생성된 청색 formazan 결정을 DMSO로 가용화시켜 microplate reader (Epoch, BioTek Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 시료처리 시에는 DMSO 의 최종 농도가 0.1%(v/v) 미만이 되도록 시료를 배지로 희 석하여 사용하였다.
UVB 조사에 대한 보호 효과
Hs68 세포를 96-well plate에 1.0×104 cells/well의 농 도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 각 well에 FBS가 없 는 배지로 시료를 희석한 후 처리하여 24시간 동안 배양하 였다. 그 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)으로 1회 세척한 다음 UVB lamp(GL20SE, Sankyo Denki, Japan)를 이용하여 UVB(30 mJ/cm2)를 조사하였 고, UV light meter(UV-340A, Lutron, Taipei, Taiwan) 를 사용하여 자외선 강도를 모니터링 하였다. 모든 UVB 조사 는 96-well plate에 부착된 세포에 PBS를 얇게 도포한 후 수행하였다. 조사 후 FBS가 없는 배지에서 시료를 희석하여 24시간 동안 세포에 처리하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 동일한 조건으로 진행되었다. 이후 UVB에 대한 보호 효과 는 MTT assay를 이용한 세포독성 실험과 동일하게 진행하 였다.
ROS 생성 측정
Hs68 세포에 시료를 24시간 동안 전처리하고 PBS로 세 척한 후 세포를 UVB(30 mJ/cm2)로 조사하였다. UVB 조사 후 세포에 시료를 30분간 처리한 후 25 μM의 dichloro- dihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA)로 염색하였 다. 세포 내 ROS 생성에 해당하는 형광 강도는 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서 fluorescent spec- trophotometer(LS-55, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 로 측정하였다.
A B
Fig. 1. Cytotoxicity (A) and protective effect (B) of the methanol extract from Acanthopanax cortex shoots in untreated and UVB irradiated Hs68 cells. Con, untreated cells; ACS, Acanthopanax cortex shoots extract (μg/mL). Each value is expressed as the mean±standard deviation (n=3). ###P<0.001 versus control. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 versus UVB by ANOVA and the Tukey-Kramer method.
수용성 콜라겐 및 MMPs 측정
MMP-1과 MMP-3의 측정은 human MMP-1, MMP-3 ELISA kit(Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)을 이용하여 배지 중의 MMP-1과 MMP-3의 생성량 을 측정하였다. UVB 조사 후 수용성 콜라겐 생성량은 SircolTM soluble collagen assay kit(Biocolor, Carrick- fergus, Northern Ireland)을 사용하여 측정하였다.
통계처리
통계분석은 GraphPad Prism 5(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 소프트웨어를 이용하여 실시하였다.
데이터 간의 유의차는 one-way ANOVA의 Tukey-Kramer method를 통해 P<0.05 수준에서 검증하였다.
결과 및 고찰
세포독성 및 UVB 자극에 대한 오가피순 메탄올 추출물의 피부세포 보호 효과
오가피순 메탄올 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 Hs68 세포주를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 먼저 UVB 비조사군에 추출물을 6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL 농도 로 처리했을 때 모든 농도에서 세포독성은 보이지 않았다 (Fig. 1A). 또한, Hs68 세포에 30 mJ/cm2의 UVB를 조사한 경우 세포 생존율이 약 65% 수준으로 감소하였으며 오가피 순 메탄올 추출물을 처리하자 UVB 조사군에 비해 농도 의 존적으로 세포 생존율이 증가하는 결과를 나타내었다(Fig.
1B). 이 결과를 통해 오가피순 메탄올 추출물이 UVB에 의 해 유도된 피부세포 독성을 강력하게 억제한다는 것을 확인 하였다.
UVB 조사에 따른 ROS 생성에 대한 오가피순 메탄올 추출물 의 효과
UVB 조사는 피부에서 DNA 손상, ROS 생성 등을 통해
다양하게 피부세포의 기능을 파괴한다(Afaq 등, 2005). 생 성된 ROS는 피부의 구성성분인 단백질 산화, 지질 과산화 반응 등을 개시시키며 MMPs의 발현을 촉진해 진피층의 매 트릭스 성분인 콜라겐, 엘라스틴 섬유를 분해하고 절단시킴 으로써 피부 노화를 가속한다(Park, 1997; Al-Nuaimi 등, 2014; Wohlrab 등, 2016). 최근 많은 천연물의 ROS 소거능 효과를 통한 피부 보호 효과 및 항노화 효과를 증명한 바가 있으며 밤껍질 추출물, 토마토 추출물 등이 그 예이다(Lee 등, 2018). 본 연구에서는 세포 내에서 UVB에 의해 발생하 는 ROS에 대한 오가피순 메탄올 추출물의 억제 활성을 알아 보기 위해 Hs68 세포에 UVB를 조사한 뒤 ROS의 양을 측정 하였다. UVB 조사군은 대조군보다 ROS의 생성이 급격히 증가하였으나 오가피순 추출물은 12.5, 25, 50 μg/mL 농도 에서 UVB 조사로 유도된 ROS의 생성량을 각각 11, 18.2, 31.6% 감소시켰다(Fig. 2). Jeon 등(2017)은 곡류 추출물 의 처리가 자외선 조사로 손상된 피부 섬유아세포에서 ROS 의 생성을 감소시키고 추가로 MMP-1으로 인한 콜라겐 분 해를 억제하여 피부 노화 억제 효과를 나타낸다고 보고한 바 있다. 본 연구에서도 오가피순 추출물이 UVB에 의해 증 가한 ROS를 감소시켜 UVB 자극에 대한 피부 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
UVB 조사에 따른 MMP-1, MMP-3 및 수용성 콜라겐 생성 에 대한 오가피순 메탄올 추출물의 효과
피부세포의 결합 조직을 구성하는 성분 중 콜라겐은 피부 진피에 존재하는 섬유아세포에서 합성되며 피부 건조 중량 의 90% 정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 따라서 콜 라겐의 분해는 결합 조직의 탄력 저하와 주름 생성 등에 직 접적인 영향을 미치게 된다(Shin 등, 2013). 체내에서 생성 되는 MMPs 가운데 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하 는 protease로서 MMP-1의 활성을 억제하면 콜라겐의 분 해를 감소시켜 피부조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예 방할 수 있는 것으로 알려져 있다(Quan 등, 2001). MMP-3
A B
Fig. 2. Effects of the methanol extract from Acanthopanax cortex shoots on time course of ROS generation (A) and ROS production at 10 min (B) in UVB-induced Hs68 cells. Con, untreated cells; ACS, Acanthopanax cortex shoots extract (μg/mL). Each value is expressed as the mean±standard deviation (n=3). ###P<0.001 versus control. ***P<0.001 versus UVB by ANOVA and the Tukey- Kramer method.
A
B
C
Fig. 3. Effect of the methanol extract from Acanthopanax cortex shoots on MMP-1 (A) and MMP-3 (B) production and soluble collagen content (C) in UVB-induced Hs68 cells. Con, untreated cells; ACS, Acanthopanax cortex shoots extract (μg/mL). Each value is expressed as the mean±standard deviation (n=3). ###P<0.001 versus control. **P<0.01 and ***P<0.001 versus UVB by ANOVA and the Tukey-Kramer method.
는 pro-MMP-1을 활성화하며 기저막의 type Ⅳ collagen 을 특이적으로 분해한다고 알려져 있다(Oh 등, 2006; Lee 등, 2012). Lee 등(2018)은 Hs68 세포를 대상으로 UVB를 조사하였을 때 MMP-1과 MMP-3의 분비가 증가했고 이로 인해 콜라겐 함량 또한 감소했다고 보고하였다. 따라서 피부 노화와 직접 관련이 있는 MMPs의 분비를 억제하는 소재를 찾는 것이 중요하다. UVB 자극 후 증가한 MMPs에 대한 오가피순 추출물의 영향을 확인하기 위해 MMP-1과 MMP- 3의 생성량을 측정하였다. UVB 조사로 인해 Hs68 세포의 배지에서 MMP-1과 MMP-3의 분비가 증가하였고, 오가피 순 추출물은 UVB로 유도된 MMP-1과 MMP-3의 생성을 유 의적으로 감소시켰으며, 특히 50 μg/mL의 농도에서 MMPs 생성 억제 효과가 가장 크게 나타났다(Fig. 3A, 3B). 수용성 콜라겐 생성을 측정한 결과 UVB 조사에 의해 수용성 콜라 겐의 함량이 크게 감소하였으나, 오가피순 추출물 처리군에 서는 모두 유의적으로 증가하였다(P<0.001)(Fig. 3C). 세포 보호 효과가 높게 나타난 50 μg/mL의 농도에서 수용성 콜 라겐의 함량도 가장 높게 측정되었다. Shin 등(2007)은 자 외선이 조사된 세포에 흰털오가피잎 추출물을 처리하여 세
포 내의 superoxide dismutase 및 catalase 활성을 측정한 결과 효소 활성이 증가함을 확인하였다. 이처럼 오가피순이 함유한 페놀성 화합물의 항산화 활성에 의하여 UVB 조사로 증가한 ROS의 생성을 감소시켜 산화적 스트레스를 억제하 여 피부 보호 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 오가피잎에 는 protocatechuic acid, eleutheroside B, eleutheroside E, rutin, hyperoside, scopolin, chiisanoside, oleanolic acid 등 다양한 생리활성 성분이 함유되어 있다고 알려져 있다(An 등, 2017). 이러한 성분 중에서도 rutin은 human dermal fibroblasts에서 H2O2에 의해 생성되는 ROS와 MMP-1의 mRNA 발현량을 감소시키고 콜라겐의 mRNA 발현량을 증가시킨다고 보고되어 있다(Choi 등, 2016). Park 등(2010)은 가시오가피 추출물을 쥐에 경구 투여하였을 때 피부조직에서 주름의 형성 및 자외선에 의한 콜라겐 조직의 파괴 반응을 억제하고 콜라겐 생성을 촉진해 자외선에 의한 피부 주름을 예방하거나 완화할 수 있는 효과가 있음을 보여 주었다. 따라서 본 연구에서는 오가피순 추출물이 ROS와 MMPs의 생성을 감소시키거나 콜라겐 생성량을 증가시켜 효과적으로 피부 광노화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
요 약
UV 조사는 피부의 광노화를 일으켜 피부를 두껍게 하고 주 름지게 하며 색소침착과 건조함을 유발한다. 광노화는 MMPs 를 활성화함으로써 콜라겐을 감소시킨다. 본 연구에서는 오 가피순 메탄올 추출물이 광노화에 대한 억제 효과가 있는지 피부 섬유아세포를 이용하여 평가하고자 하였다. Hs68 세 포를 이용하여 모든 농도에서 세포독성을 확인하였으며 시 료의 독성은 나타나지 않았다. 오가피순 추출물은 UVB 조 사군에 비해 농도 의존적으로 세포 생존율을 증가시켰다.
오가피순 추출물은 12.5, 25, 50 μg/mL 농도에서 UVB 조 사로 유도된 ROS의 생성량을 각각 11, 18.2, 31.6% 감소시 켰으며 콜라겐 생성량을 증가시켰다. 또한, 오가피순은 UVB 조사에 의한 MMP-1과 MMP-3의 증가를 농도 의존 적으로 억제하였다. 결론적으로 오가피순 메탄올 추출물은 자외선에 의한 피부 노화와 주름 생성을 효과적으로 개선하 는 천연 소재로 이용될 수 있을 것이다.
감사의 글
본 연구는 중소기업청에서 지원하는 2018년도 산학연협력 기술개발사업(No. C0505079)의 연구수행으로 인한 결과 물임을 밝힙니다.
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