새싹인삼 추출물의 항산화능 및 멜라닌 생성 억제 효과 이동욱

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새싹인삼 추출물의 항산화능 및 멜라닌 생성 억제 효과

이동욱¹․구희빈¹․이영재²․김교남¹․이승철¹

1경남대학교 바이오융합학부

2지리산곤충산업영농조합법인

Antioxidant and Antimelanogenic Activities of Panax ginseng Sprout Extract

Dong-Uk Lee

¹

, Hee-Bin Ku

¹

, Young-Jae Lee

²

, Gyo-Nam Kim

¹

, and Seung-Cheol Lee

¹

1

School of Bioconvergence, Kyungnam University

2

Jirisan Insect Industry Farming Association Corporation

ABSTRACT The current study evaluated the antioxidant and antimelanogenic activities of 50% ethanol extract of Panax ginseng sprout (PGS) at varying concentrations. Exposure to the PGS extract dose-dependently increased the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging and tyrosinase inhibition activities. PGS extract treatment for 72 h did not affect viability of the B16F10 cells at concentrations of 10%, 50%, and 100%. Exposure to the PGS extract for 72 h significantly and dose-dependently suppressed melanin accumulation in B16F10 melanoma cells. In addition, treatment with PGS extracts down-regulated the expression levels of the MITF melanogenic transcription factor. Taken together, the above results indicate that the antioxidant and antimelanogenic activities of the PGS extract may be linked to the development of functional food or cosmetics.

Key words: Panax ginseng, sprout, extract, antioxidant, antimelanogenic

Received 11 April 2019; Accepted 17 June 2019

Corresponding author: Seung-Cheol Lee, School of Bioconvergence, Kyungnam University, Changwon, Gyeongnam 51767, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-55-249-2684 Author information: Dong-Uk Lee (Graduate student), Hee-Bin Ku (Graduate student), Gyo-Nam Kim (Professor), Seung-Cheol Lee (Professor)

서 론

우리나라 인삼산업법에서 인삼(

Panax ginseng

)은 오갈 피나무과 인삼속 식물로 정의되며, 가공 방법에 따라 수삼, 홍삼, 태극삼, 백삼으로 분류된다. 세계 여러 곳에서 생육하 지만 우리나라에서 자라는 토종 인삼은 약효가 뛰어나 고려 인삼으로 알려져 있다. 한의학에서는 인삼의 효능을 7가지 로 정의하고 있는데, 보기구탈(補氣救脫), 익혈복맥(益血復脈), 양심안신(養心安神), 생진지갈(生津止渴), 보폐정단(補肺定喘), 건비지사(健脾止瀉), 탁독합창(托毒合瘡)이 있다.

인삼은 주로 뿌리만 이용하는데, 뿌리에는 진세노사이드 (ginsenoside)라는 천연물 스테로이드 배당체 및 triterpene 사포닌이 함유되어 있다. 인삼의 과학적 효능은 대부분 진세 노사이드에 의한 것으로 보고되어 있으며(Leung과 Wong, 2010), 심혈관계, 중추신경계, 면역계, 항암 효과 등이 있다.

인삼의 재배는 시간과 노력이 많이 소요되며, 재배 기간에 다양한 병충해에 노출되므로 농약을 사용해야 하는 단점이

있다. 이를 대체하기 위하여 1년 정도 키운 묘삼을 배양토 또 는 수경재배시설에서 6~8일 단기간 재배하는 새싹인삼의 재배법이 개발되었다. 새싹인삼은 재배기간이 짧고 실내 시설 을 이용하여 계절과 무관하게 재배할 수 있고 농약을 사용하 지 않아도 되며 잎부터 뿌리까지 모든 부위를 다 먹을 수 있는 장점이 있다. 또한 새싹인삼에는 인삼 못지않은 다량의 진세 노사이드가 함유되어 있다고 보고되었다(Cho, 2018). 기존 인삼의 한계를 넘기 위하여 발효 새싹인삼의 주름 개선 효과 (Kim, 2019), 새싹인삼 효소가수분해물의 항산화 활성(Kim 등, 2018a), 새싹인삼과 차풀 복합 추출물의 피부 항산화 및 미백효과(Kim 등, 2018b) 등의 생리활성 연구가 진행되었다.

또한 새싹인삼의 고부가가치 가공 상품 개발을 위하여 새싹인 삼 첨가 카스텔라(Kim 등, 2016), 새싹인삼 첨가 설기떡(Lee, 2018), 새싹인삼을 첨가한 수산가공품 제조(Jeong, 2018), 새싹삼 발효주(Pyo 등, 2018) 등의 연구가 보고되었다.

본 연구에서는 새싹인삼의 주정 추출물을 제조하고, 이 추출물의 항산화 활성과 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하여 새싹인삼의 다양한 활용 가능성을 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

시약

Arbutin, dimethyl sulfoxide(DMSO), potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, sodium

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hydroxide, thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), alpha-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)은 Sigma-Aldrich Co.(St.

Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)은 WELGENE Inc.(Daegu, Korea) 에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL.

(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, 마우스 melanoma 인 B16F10 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구 입하였다. 기타 시약 및 용매는 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

새싹인삼 추출물 제조

본 연구에서의 새싹인삼은 경남 산청에 소재한 지리산곤 충산업영농조합법인에서 수경재배 한 것을 제공받아 이용 하였다. 새싹인삼을 동결건조 한 후 건조물 1 kg에 13 L의 50% 주정을 가하여 72시간 상온에서 아침과 저녁에 한 번 씩 교반하면서 추출하였다. 이후 부직포를 통과한 여과액을 초고속진공저온 추출농축기(COSMOS-660, 경서이엔피(주), Incheon, Korea)를 이용하여 65°C에서 농축하여 추출액 5 kg을 얻었다. 이 추출물을 100% 원액으로 하고 증류수로 희석하여 10, 50%(v/v) 용액으로 제조하여 분석하였다.

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거능은 Jeong 등(2004)의 방법에 따라 새싹인삼 추출물 100 μL에 41 μM DPPH 용액 900 μL를 가한 후 어두운 상태의 상온에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 DPPH 라디칼 소 거능은 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타내었으며, 양 성 대조구로 L-ascorbic acid를 사용하였다.

DPPH 라디칼

소거능(%) ＝

(

^1－ 시료 첨가구의 흡광도

)

^×100

무처리구의 흡광도

Tyrosinase 저해 활성 측정

Tyrosinase 저해 활성은 Vanni 등(1990)의 방법에 준하 여 측정하였다. 상기 시료 100 μL에 sodium phosphate buffer(0.05 M, pH 6.8) 140 μL, tyrosinase(1,500 U/mL) 20 μL, L-tyrosine(1.5 mM) 20 μL를 첨가하여 37°C에서 15분 동안 반응시킨 후 multiplate reader(Sunrise RC/TS/

TS Color TC/TW/BC/6Filter, Tecan Austria GmbH, Grödig, Austria)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하 였다. Tyrosinase 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였 으며, 무첨가구의 흡광도는 시료 대신 증류수로 수행하여 측정하였다.

Tyrosinase

저해능(%) ＝

(

^1－ 시료 첨가구의 흡광도

)

^×100

무첨가구의 흡광도

세포독성

마우스 유래 melanoma 세포인 B16F10의 생존율에 대한

시료의 영향을 평가하였다. 10% fetal bovine serum이 포 함된 DMEM 배지에서 B16F10 세포를 배양한 후, 세포를 취하여 96-well microplate에 각 well에 세포 수가 5×10³ 이 되도록 100 μL씩 분주하였다. 72시간 동안 37°C, 5%

CO2에서 배양한 후 배지를 제거하고 농도별 각 시료가 포함 된 새로운 배지를 넣었다. 추가로 24시간 배양 후 배지 교환 없이 MTT를 phosphate buffered saline(PBS)에 5 mg/

mL가 되도록 녹인 용액을 각 well에 20 μL씩 넣은 다음 3시간 더 배양하였다. 배지를 제거하고 각 well에 DMSO를 100 μL씩 넣어 생성된 formazan을 녹인 후, microplate reader(VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생 존율(%)을 계산하였다.

멜라닌 생합성 억제 활성 평가

B16F10 세포를 이용하여 새싹인삼 추출물의 멜라닌 생 성 억제 효과를 측정하였다. 1 μM α-MSH와 100 μM IBMX 를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후 새싹인삼 추출물을 농도별로 72시간 동안 처리하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 200 μL trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 용해 한 다음 18,472×

g

에서 10분간 원심분리 하였다. 생성된 pellet을 200 μL NaOH와 10% DMSO에 용해하여 100°C 에서 10분간 고정하고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라 닌 생합성 억제 효과를 확인하였다. 또한 새싹인삼 추출물의 B16F10 세포에서 멜라닌 생합성 억제 정도를 현미경을 사 용하여 관찰하였다.

RT-PCR(reverse transcription polymerase chain re- action)을 통한 유전자 발현 분석

B16F10 세포에서 microphthalmia-associated transcription factor(MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP1), tyrosinase related protein 2(TRP2)의 발현 정도 는 RT-PCR 방법을 이용하여 확인하였다. B16F10 세포에 TRIzol^®500 μL를 이용하여 total RNA를 추출한 후 chloroform을 100 μL 넣고 3분 동안 상온에 정치한 다음 18,472×

g

에서 20분 동안 원심분리 하여 상층액을 분리하 였다. 분리된 상층액에 isopropanol 250 μL를 넣고 10분 동안 상온에 한 번 더 정치시킨 후 18,472×

g

에서 15분 동안 원심분리 하여 RNA를 분리한 다음 정량하였다. Accu Power^® Cycle Script RT PreMix kit(Bioneer, Daejeon, Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 각각의 primer와 함께 Maxime PCR PreMix kit(i-Taq;

iNtRON, Seongnam, Korea)을 이용하여 30 cycle 수준으 로 thermal cycler(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)에서 PCR을 수행하였다. 사용된 각각의 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR을 수행한 후 1.5%(w/v) agarose gel 에 전기영동하여 mRNA 유전자 발현 수준을 ChemiDoc^TM XRS+ Imaging System(Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.

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d b

a

e c

b

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

20 40 80 10 50 100

PGSE (%) DPPH radical scavenging . activity (%) .

L-Ascorbic acid (μg/mL)

A

de cd e a b

c

0 10 20 30 40 50 60

0.5 1.0 2.0 10 50 100

PGSE (%) Tyrosinase inhibition . activity (%) .

Arbutin (mg/mL)

B

Fig. 1. (A) DPPH radical scavenging activity and (B) tyrosinase

inhibition activity of Panax ginseng sprout extract (PGSE). Each value is mean±SD. Values with different letters above the bars in each concentration are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05.

Table 1. Primer sequences for PCR analysis

Name Primer sequence (5’→3’) MITF CTGATGGACGATGCCCTCTC (sense)

CCCCTTGCTCAGAAAGCTCA (antisense) TRP1 GTACTGGTGAGCAGCTCTGT (sense)

AGTCTGCAATCACAGCCACA (antisense) TRP2 TGATCACCACGCAACACTGG (sense)

GGGTTGTTTCTCTTCAGCCACT (antisense) β-Actin AGGGAAATCGTGCGTGACAT (sense)

AGCTCAGTAACAGTCCGCCT (antisense)

통계처리

모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 그 결과 SPSS software(Ver. 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사 용하여 처리하고, 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하여 Duncan의 다중범위 검정(Duncan’s multiple range test) 으로 유의성을 검정하였다. 모든 처리 값의 차이는 신뢰 수 준 95%(

P

<0.05)로 비교 분석하였다.

결과 및 고찰

DPPH 라디칼 소거능과 tyrosinase 저해능

본 연구에서 제조한 새싹인삼 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능으로 측정하여 Fig. 1A에 나타내었다.

10, 50, 100%(v/v) 농도로 측정한 새싹인삼 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 14.05±1.09, 55.98±1.27, 77.88±0.50%였다. 대조구로 사용한 L-ascorbic acid는 20 μg/mL 농도에서 43.44±0.84%의 소거능을 나타내었다.

한편, tyrosine은 피부에서 tyrosinase에 의해 3,4-di- hydroxyphenylalanine(DOPA)과 DOPA-quinone으로 전 환되고, 이는 여러 과정을 거쳐 멜라닌이 생성되어 피부와 머리카락의 색소 물질을 형성한다. 멜라닌은 피부에서 자외 선 피복에 대한 중요한 방어 기작으로도 작용하지만 상피조 직에서의 멜라닌의 과다한 증가는 기미, 주름, 검버섯 등과 같은 피부 문제를 일으킨다(Kim과 Uyama, 2005). 따라서 tyrosinase 활성에 대한 식물 소재의 억제 효과는 많은 관심 을 받고 있다. Fig. 1B에 나타낸 바와 같이 새싹인삼 추출물 은 10, 50, 100%(v/v) 농도에서 각각 14.40±0.17, 17.07±

0.01, 19.11±1.02%의 tyrosinase 저해능을 나타내었다.

대조구로 사용한 arbutin은 0.5 mg/mL 농도에서 21.27±

2.45%의 tyrosinase 저해능을 나타내었다.

Cho(2018)는 본 연구에 사용한 것과 동일하게 재배된 새 싹인삼의 경우 5년근 인삼보다 약 3배 함량의 진세노사이드 가 검출되었다고 보고하였다. 진세노사이드는 항산화 활성 과 전사인자 Nrf-2의 활성이 있으며(Saw 등, 2012), tyrosinase 저해능(Hong 등, 2013)이 보고되었다. 따라서 새 싹인삼 추출물의 DPPH 라디칼 소거능과 tyrosinase 저해 능은 추출물에 함유된 진세노사이드의 기여가 높음을 알 수

있다. 한편, Kim 등(2018b)은 새싹인삼과 차풀의 배합비율 1:9, 추출용매 30% 에탄올에서 80°C로 추출하였을 때 가장 좋은 항산화능과 tyrosinase 저해능을 보인다고 보고하였 으나, 새싹인삼 추출물만의 결과는 나타내지 않아 본 연구와 직접 비교하기는 어려웠다. 본 연구에서 제조한 추출물의 경우 고형물 함량은 1.67%였다. 즉 16.7 mg/mL의 고형물 함량으로 대조구로 비교한 L-ascorbic acid나 arbutin에 비 해 매우 높은 농도였고, 같은 농도라고 가정한다면 대조구에 비해 새싹인삼 추출물은 비교적 낮은 활성을 나타내었다.

이는 대조구가 순수한 물질이지만 새싹인삼 추출물에는 진 세노사이드 이외에 다양한 물질이 함유되어 있기 때문이다.

본 연구의 새싹인삼 추출물의 진세노사이드 Rb1과 Rg1 함 량을 한국식품과학연구원에 의뢰하여 분석한 결과 각각 0.08, 0.09 mg/mL로 측정되었다.

B16F10 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과

B16F10 세포에서 세포독성을 MTT assay를 실시하였 다. 100% 가득 찬 상태의 B16F10 세포에 10, 50, 100%(v/v) 농도의 새싹인삼 추출물을 72시간 동안 처리한 결과, B16F10 세포 생존율은 아무것도 처리하지 않은 대조구 대 비 각각 96.5±2.9%, 97.8±5.1%, 101.1±2.8%로 나타났으 며 유의적인 세포독성이 발견되지 않았다(Fig. 2).

(4)

NS

0 20 40 60 80 100 120

Control Arbutin 10 50 100

Cell viability (%) .

Fig. 2. Effect of Panax ginseng sprout extract on the cell via-

bility of B16F10 cells. Each value is mean±SD. NS: not sig- nificant.

f a

e b

c d

-20 0 20 40 60 80 100 120

Blank Control Arbutin 10 50 100

Melanin content (%) .

A A

B Panax ginseng sprout extract

Blank Control Arbutin 10% 100%

Fig. 3. Effect of Panax ginseng sprout extract on melanogensis

of B16F10 cells. (A) Melanin content of B16F10 cells. Each value is mean±SD. Values with different letters above the bars in each concentration are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.05. (B) Microscopic image analysis.

Panax ginseng sprout extract

Control 10% 50% 100%

MITF TRP1 TRP2 β-Actin

Fig. 4. Effect of Panax ginseng sprout extract on mRNA ex-

pression levels of melanogenic genes in B16F10 cells. β-Actin was used as an internal control.

새싹인삼 추출물이 B16F10 세포의 멜라닌 생합성을 억 제하는지 알아보기 위하여 B16F10 세포에 1 μM α-MSH와 100 μM IBMX를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후, 새싹인 삼 추출물을 10%, 50%, 100% 농도로 72시간 동안 처리하 였다. 그 결과 새싹인삼 추출물은 각각의 농도에서 아무것도 처리하지 않은 대조구 대비 88.49±5.07%, 63.86±3.71%, 48.08±4.12%로 농도 의존적이며 유의적인 멜라닌 형성 억 제 효과를 나타냈다. 본 실험에 사용된 양성 대조구인 500 μg/mL의 arbutin은 22.22±4.11%의 저해 활성을 나타냈다 (Fig. 3A). 또한, 새싹인삼 추출물이 B16F10 세포 내 멜라 닌 축적에 미치는 영향을 알아보고자 현미경으로 관찰한 결 과, B1610 세포는 1 μM α-MSH와 100 μM IBMX 유도에 의해 멜라닌이 다량 축적되었으며 축적된 멜라닌은 새싹인 삼 추출물 10%, 100% 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하 는 것을 확인하였고 양성 대조구로 사용된 arbutin 역시 멜 라닌의 축적을 효과적으로 감소시켰다(Fig. 3B).

이전 연구에 따르면 호장근 추출물이 α-MSH로 유도된 멜라닌 형성을 SK-MEL-2 세포에서 유의적으로 억제하였 음을 보고하였고(Kim과 Ryu, 2012), 민들레 추출물이 B16F10 melanoma에서 tyrosinase 효소 활성을 억제하여 멜라닌 축적을 억제한다고 보고한 바 있다(Kang과 Yoo, 2009). 멜라닌은 세포 내 소기관인 리보솜에서 tyrosinase 에 의해 생합성되며, 표피의 기저층에서도 역시 tyrosine이 tyrosinase 효소에 의해 여러 단계를 거쳐 합성이 이루어진 다. Tyrosinase는 멜라닌 합성에 있어 중요한 역할을 하는 핵심 효소로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 MITF, TRP1, 그리고 TRP2 등은 멜라닌 생합성에 영향을 미치는 주요한 인자로 알려져 있다(Kwon, 2016).

미백 소재를 탐색하는 연구에 있어 멜라닌 합성량, tyrosinase 활성, MITF, TRP1, 그리고 TRP2의 발현 등을 체 계적으로 분석하고 그 작용기전을 규명하는 것은 중요하다.

따라서 본 연구에서는 새싹인삼 추출물 처리가 B16F10 세 포의 멜라닌 합성에 관여하는 유전자의 발현에 어떠한 영향

을 미치는지 분석하고자 하였다. 멜라닌 생합성 저해 실험과 마찬가지로 새싹인삼 추출물을 10%, 50%, 100% 농도로 72시간 B16F10 세포에 처리하고 MITF, TRP1, TRP2의 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조구 대비 새싹인삼 추출물은 MITF 발현 수준을 농도 의 존적으로 감소시켰으나 TRP1 및 TRP2의 발현에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 4). 이는 새싹인삼 추출물이 멜라닌 합 성과 관련한 전사인자인 MITF의 발현을 감소시켜 tyrosi- nase의 활성에 영향을 미치는 것으로 추측되며, 상대적으로 멜라닌 합성의 후기과정인 TRP1 및 TRP2의 작용과는 무관 한 것으로 생각된다.

(5)

요 약

수경재배한 새싹인삼의 50% 주정 추출물을 제조하여 항산 화 활성과 멜라닌 생성 억제 효과를 평가하였다. 새싹인삼 추출물은 농도가 높아질수록 DPPH 라디칼 소거능과 tyrosinase 저해 활성이 증가하였다. 또한, B16F10 세포에서 새싹인삼 추출물은 농도 의존적이며 유의적으로 멜라닌 생 합성을 저해하였다. RT-PCR 분석은 새싹인삼 추출물이 멜 라닌 생합성 과정의 전사인자인 MITF의 발현을 조절하고 이를 통해 tyrosinase의 활성에 영향을 미침으로써 멜라닌 합성을 저해한다는 가능성을 보여주었다. 이상의 결과는 새 싹인삼 추출물이 보유하고 있는 항산화 활성과 멜라닌 생성 억제 효과가 가공품 개발로 연결될 수 있음을 시사한다.

감사의 글

본 연구는 중소기업청에서 지원하는 2018년도 산학연협력 기술개발사업(과제번호S2600783)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.

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