도라지 종자 추출물의 멜라토닌 함량 및 항산화능
우혜련1․김양지1․이 윤1․김인호2․김석중1
1동덕여자대학교 식품영양학과
2한국식품연구원 식품기능연구본부
Melatonin Content and Antioxidant Activity of Platycodon grandiflorum Seed Extract
Hyeryeon Woo1, Yangji Kim1, Yoon Lee1, In-Ho Kim2, and Seok Joong Kim1
1Department of Food and Nutrition, Dongduk Women’s University
2Division of Food Functionality, Korea Food Research Institute
ABSTRACT The melatonin content and antioxidant activity of Platycodon grandiflorum (PG) seed extract were meas- ured and compared to those of PG sprout and root extracts. Among the solvents used to extract melatonin from seeds, 75% ethanol was better than methanol or 25, 50 or 100% ethanol (v/v), resulting in 146.8 ng melatonin per g extract by ELISA assay. The polyphenol content of seed extract prepared using 75% ethanol was 50.2 μg gallic acid equivalent (GAE)/g. This extract also exhibited dose-dependent antioxidant activity in various assays, showing 519.1 μmol Trolox equivalent (TE)/g in 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging, 645.1 μmol TE/g in 2,2’-azino-bis(3-ethyl- benzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging, 471.1 μmol TE/g in ferric reducing antioxidant power, and 1,438.7 μmol TE/g in oxygen radical absorbance activity. Both the melatonin content and the antioxidant activity were highest in seed extract, followed by sprout and root extracts. Longer sprouting lowered the melatonin content and the antioxidant capacity. In a cellular antioxidant activity (CAA) test using 3T3-L1 cells, seed extract (40 μg/mL) showed 21.5 units CAA while neither sprout nor root extract exhibited any activity. These results suggest that PG seed is a novel functional foodstuff superior to its sprout and root in melatonin content and antioxidant activity.
Key words: Platycodon grandiflorum seed, sprout, root, melatonin, antioxidant
Received 24 July 2018; Accepted 4 August 2018
Corresponding author: Seok Joong Kim, Department of Food and Nutrition, Dongduk Women’s University, Seoul 02748, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-2-940-4466
서 론
한국, 일본, 중국 등지에 분포하는 초롱꽃과의 다년생 초 본인 도라지(Platycodon grandiflorum)는 주로 뿌리를 식 용이나 약용으로 사용하여 왔으며, 기침, 가래 등의 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(1). 도라지 뿌리의 주요 약 리성분으로 platycogenic acid A, B, C 및 platycodin D 등의 사포닌이 확인되었으며, 이러한 성분들과 관련하여 도 라지 뿌리는 혈중 중성지방 감소, 인슐린 저항성 및 혈당 개선, 항염증, 항암 및 항산화 효과 등의 다양한 효능이 있음 이 알려져 있다(2). 도라지 잎과 줄기에서는 항산화능이 일부 보고되었다(3). 이처럼 도라지는 그 뿌리에 대한 연구가 가 장 많으며 줄기 및 잎의 기능성에 대한 연구도 일부 진행되 었으나 종자에 대한 기능성 평가는 거의 이루어지지 않았다.
멜라토닌(melatonin, N-acetyl-5-methoxytryptamine) 은 척추동물의 송과선에서 분비되어 동물의 일주기와 계절
주기 조절, 수면 조절, 생식능력, 항암, 항염증 활성 등의 작 용을 하는 호르몬(4)으로, 발견 초기에 melanocyte stim- ulating hormone을 억제하여 피부색을 밝게 하는 작용 때문 에 멜라토닌이라 명명되었다(5). 이와 같은 생리적 기능 외 에도 멜라토닌은 HO･ 라디칼을 포함한 다양한 활성산소를 직접적으로 소거할 수 있을 뿐 아니라 간접적으로 생체 내의 항산화 효소 활성을 조절하여 생체산화를 억제시킬 수 있는 강력한 항산화제임이 확인되었다(6). 더욱이 멜라토닌은 다 른 항산화제와는 달리 양친매성의 구조를 지니며 그 분해산 물 또한 활성산소를 소거할 수 있는 장점이 있다(7,8). 이처 럼 멜라토닌은 강한 항산화력을 지닌 유용 물질로 알려져 있으나(9), 노화에 따라 생체 내에서의 분비가 점차 감소한 다(10). 그러므로 부족해지는 멜라토닌을 보충하고 수면에 도움을 주기 위한 목적으로 미국 등에서는 dietary supple- ment로 시판되고 있다. 하지만 이들 대부분은 화학 합성제 품이며 최근에는 천연소재 유래 멜라토닌에 대한 관심이 증 가하고 있다(11). 현재 멜라토닌은 동물뿐 아니라 거의 모든 생물계에서 확인되고 있으며, 식물체의 경우 생장, 발생, 개 화와 같은 식물생리 현상에 관여하며 외부의 산화적 스트레 스에 대한 보호물질로서의 기능도 알려져 있다(12,13). 특
히 식물의 종자는 향후 성체식물 발생을 위한 기관으로 타 조직에 비하여 산화적 스트레스를 유발하는 가뭄, 추위, 열, 중금속, 염 등에 대한 보호물질이 풍부하며 대표적으로 폴리 페놀 등이 잘 알려져 있지만(14,15), Manchester 등(16)은 또 다른 보호물질 중 하나로서 종자에 멜라토닌이 풍부함을 보고한 바 있다.
이에 본 연구에서는 천연 멜라토닌 및 항산화 물질의 새로 운 자원으로서 그간 식품자원으로 활용되지 않았던 도라지 종자의 가능성을 확인하고자 하였다. 이에 도라지 종자 추출 물의 멜라토닌 함량 및 항산화능을 분석하였으며, 종자의 발아 싹 및 뿌리와도 비교함으로써 종자의 우수성을 확인하 였다.
재료 및 방법
재료
본 연구에 사용한 도라지 종자는 (주)다농(Namyangju, Korea), 건도라지 뿌리는 (주)금광약초(Gwangju, Korea) 에서 구입하였다. 항산화능 분석에 사용한 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzo- thiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), iron(Ⅲ) chloride hexahydrate(FeCl3･6H2O), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid(Trolox), 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, fluorescein은 Thermo Fisher Scientific사(Waltham, MA, USA)의 제품을 사용하였다.
3T3-L1 세포주는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 분양 받았고, cell culture plate는 SPL Life Sciences(Pocheon, Korea)에서 구입하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(PS), trypsin-EDTA 는 Welgene사(Gyeongsan, Korea), phosphate buffer saline(PBS)은 Biosesang사(Seongnam, Korea), 3-iso- butyl-1-methylxanthine(IBMX), dexamethasone, in- sulin, 3- (4,5- dimethyl- 2- thiazolyl) - 2,5- diphenyl- 2H- tetrazolium bromide(MTT), Oil-Red O, 2’,7’-dichloro- fluorescin diacetate(DCFH-DA)는 Sigma-Aldrich Co.에 서 구입하였으며, dimethylsulfoxide(DMSO)는 대정화금 (주)(Siheung, Korea)의 제품이었다. Melatonin 분석용 ELISA kit은 IBL International사(Hamburg, Germany)의 제품을 사용하였으며 그 외 시약들은 분석용 등급을 사용하 였다.
시료 조제
도라지 종자와 건도라지 뿌리는 구입한 그대로 액체질소 하에서 막자사발을 사용해 분쇄한 후 분말을 제조하여 사용 하였다. 발아 싹 준비를 위해서는 종자를 30분간 100 ppm
NaOCl 용액에 침지 소독시킨 다음 세척 후 4시간 동안 멸균 수에 다시 침지하고 25°C 배양기에 파종하였다. 이를 4일 및 8일간 발아시켜 얻은 싹은 동결건조(FDU-2200, EYELA, Tokyo, Japan) 한 다음 액체질소 하에서 분쇄하여 실험에 사용하였다. 분석을 위한 추출물은 각각 메탄올 및 25, 50, 75, 100% 에탄올(v/v) 10 mL에 각 분말시료 1 g을 넣고 30분 동안 초음파 처리하여 얻었다. 그다음 12,000×g, 4°C 에서 10분간 원심분리(5810R, Eppendorf, Hamburg, Ger- many) 한 후 상등액을 취해 40°C에서 진공농축(CentriVap Concentrator, Labconco Co., Kansas, MI, USA) 시키고 추가로 동결건조 하여 잔여용매를 제거한 다음 실험기간 동 안 -80°C에서 보관하면서 사용하였다.
멜라토닌 함량
멜라토닌 분석을 위해 앞서 준비한 추출물에 농축 전과 동일한 용량의 증류수를 첨가하여 30초 동안 vortexing 하 여 재용해시킨 후 12,000×g에서 10분 동안 원심분리 하여 얻은 상등액을 시료용액으로 사용하였다. 멜라토닌 함량 분 석은 ELISA kit의 방법(17)에 따라 실시하였다. 즉 메탄올 과 증류수로 미리 활성화시킨 Sep-Pak C18 칼럼에 시료용 액 0.5 mL와 동량의 증류수를 넣고 120×g에서 5분 동안 원심분리 하였다. 그다음 칼럼에 10% 메탄올 1 mL를 넣고 500×g에서 1분 동안 원심분리 한 후(2회), 칼럼에 부착되 어 남아있던 멜라토닌을 1 mL 메탄올을 넣어 추출하였다.
추출물은 진공농축 시킨 다음 증류수 0.15 mL로 재용해시 키고 이 중 50 μL를 취해 goat-anti-rabbit antibody로 코 팅된 microtiter plate의 well에 첨가하였다. 여기에 멜라토 닌-바이오틴 용액 50 μL, 항혈청 용액 50 μL를 차례로 첨가 하고 4°C에서 16시간 동안 반응시킨 후 0.25 mL wash buffer로 3회 세척하였다. 그다음 0.15 mL의 anti-bio- tin-alkaline phosphatase 용액을 첨가하고 상온에서 2시 간 반응시킨 후 0.25 mL wash buffer로 3회 세척하였다.
마지막으로 0.2 mL의 p-nitrophenyl phosphate 용액을 첨 가하여 500 rpm(microplate shaker CPS-350, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 20분 동안 반응시킨 후 1 N NaOH 용액 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후 micro- plate reader(BioTek Instruments Inc., Colmar Cedex, France)를 이용해 605 nm를 기준파장으로 하여 405 nm에 서의 흡광도를 측정한 후 표준 멜라토닌을 이용한 표준곡선 으로부터 시료의 멜라토닌 함량을 산출하였다.
총 페놀화합물 함량
총 페놀화합물 함량은 Zhang 등(18)의 방법으로 측정하 였다. 96-well plate에 75% 에탄올을 이용해 5 mg/mL로 희석시킨 시료용액 20 μL와 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol 용액 100 μL를 넣고 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 7.5%
Na2CO3 용액 100 μL를 첨가하여 암소에서 1시간 반응시킨 다음 microplate reader를 이용해 750 nm에서의 흡광도를
측정하였다. 총 페놀화합물 함량의 평가는 gallic acid 표준 곡선을 이용하여 각 시료 5 mg에 함유된 gallic acid의 양을 gallic acid equivalent(μg GAE/g)로 환산하여 나타내었다.
항산화능 평가
DPPH 라디칼 소거능을 분석하기 위해 Mohamad 등(19) 과 Brand-Williams 등(20)의 방법을 변형하여 사용하였다.
96-well plate에 농도별로 희석한 시료용액 20 μL와 517 nm에서의 흡광도가 1.000±0.02가 되도록 조절한 DPPH 용액 180 μL를 넣고 30분 동안 암소에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능의 평가는 흡광도를 50% 억제할 때의 시료의 농도(IC50)를 Trolox의 IC50과 비 교한 Trolox equivalent(TE, Trolox IC50/sample IC50= μmol/g)로 나타내었다.
ABTS 라디칼 소거능을 분석하기 위해 Re 등(21)의 방법 을 변형하여 사용하였다. ABTS 용액은 7 mM의 ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 4:1(v/v)로 혼합하여 암 소에 12~16시간 방치 후 실험 당일 에탄올에 희석하여 흡광 도를 0.700±0.02로 맞춰 사용하였다. 96-well plate에 농 도별 시료용액과 ABTS 용액을 넣고 암소에서 6분 동안 반 응시킨 후에 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능 평가는 DPPH와 마찬가지로 IC50과 TE를 이용하였다.
철(Ⅲ) 이온을 환원시키는 능력(ferric reducing anti- oxidant power, FRAP)은 Benzie와 Strain(22)의 방법을 변형하여 사용하였다. FRAP 용액은 300 mM acetate buf- fer(pH 3.6), 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3･6H2O 용액을 10:1:1의 부피비율로 혼합하여 실험 전 37°C로 가온하였 다. 96-well plate에 농도별 시료용액과 FRAP 용액을 넣고 암소에서 4분 동안 반응시킨 후에 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 흡광도를 0.1만큼 증가시키는 시료 의 농도(ΔOD0.1)를 Trolox의 ΔOD0.1와 비교한 TE(Trolox ΔOD0.1/sample ΔOD0.1=μmol/g)로 나타내었다.
산소 라디칼 흡수능(oxygen radical absorbance ca- pacity, ORAC)의 분석은 Huang 등(23)의 방법을 변형하여 사용하였다. 75 mM AAPH, 80 nM fluorescein, sample, Trolox는 모두 75 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 녹여 준비하였다. 96-well plate에 시료용액 25 μL 와 fluorescein 용액 125 μL를 넣고 500 rpm에서 3분 동안 교반시킨 후 37°C에서 30분간 반응시켰다. 그 후 AAPH 용액 50 μL를 가하여 microplate reader를 이용해 ex- citation 485 nm, emission 528 nm(bandpass, 20 nm)에 서 1분 간격으로 40분간 형광을 측정하였다. 최종 ORAC값 은 시료첨가구와 대조구 각각의 형광감소곡선 아래의 면적 (area under curve, AUC)의 차이인 순면적(net AUC)을 구하여 net AUC를 5만큼 증가시키는 시료의 농도(AUC5) 를 Trolox의 AUC5와 비교하여 TE(Trolox Δnet AUC5/ sample Δnet AUC5)로 나타내었다.
세포에서의 독성 및 항산화능
3T3-L1 세포에서의 항산화능을 분석하기에 앞서 시료 의 세포독성을 평가하기 위하여 Lee 등(24)의 방법을 변형 한 MTT법을 사용하였다. 3T3-L1 preadipocyte를 96- well plate(2×103/well)에서 24시간 동안 배양한 후 DMSO 에 농도별로 희석한 각 추출물 시료를 배지에 1% 비율로 혼합하여 처리하였다. 대조구에는 1% DMSO가 함유된 배 지를 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 MTT 용액을 각 well당 100 μL씩 처리하고 37°C, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 방치하여 formazan을 생성하도록 하 였다. 이후 MTT 용액을 제거하고 DMSO로 생성된 for- mazan을 용해하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조 구의 흡광도를 생존율 100%로 보고 시료를 처리한 well의 흡광도를 측정하여 대조구에 대한 백분율로 세포독성을 평 가하였다.
시료의 세포 내 항산화능(cellular antioxidant activity, CAA)은 Wolfe와 Liu(25)의 방법을 변형하여 사용하였다.
이를 위해 먼저 3T3-L1 preadipocyte를 96-well plate (2×103/well)에 분주하고 DMEM(10% BCS, 1% PS)하에 서 100% confluent가 되도록 배양한 다음 이틀 뒤 분화유도 배지(DMEM, 10% FBS, 1% PS, 1% dexamethasone, 1%
IBMX, 0.01% insulin)로 교체하여 분화를 유도했다. 그다음 10% FBS, 1% PS, 0.01% insulin이 함유된 DMEM으로 분 화를 유지시킨 후 8일째 얻은 3T3-L1 adipocyte를 사용해 항산화능 평가를 실시하였다. 분화된 세포에서 배지를 제거 한 후 PBS로 2회 세척하고, DMSO에 4 mg/mL로 희석한 시료와 메탄올에 녹인 DCFH-DA를 serum free DMEM에 각 1%씩 첨가한 다음(최종 시료농도 40 μg/mL) 37°C, 5%
CO2, 암소에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 PBS로 2회 세척하고 PBS에 600 μM 농도로 녹인 AAPH well당 100 μL 처리한 다음 5분 간격으로 1시간 동안 형광 (excitation: 538 nm, emission: 485 nm)을 측정하였다.
세포에서의 항산화능은 시료 첨가 시 형광곡선 아래의 면적 과 대조구에서의 형광곡선 아래 면적을 비교하여 다음과 같 이 CAA unit으로 나타내었다.
CAA
(unit)＝100－
(
∫sample fluorescence area)
×100∫control fluorescence area
통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복하였으며, 그 결과는 평균±표 준편차로 나타내었다. 실험결과는 IBM SPSS Statistics (18, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 일원분산 분석을 실시하였으며, Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰 멜라토닌 함량
0 3 6 9 12 15
M100 E100 E75 E50 E25
Melatonin content (ng/g) .
c
c b
a
d
Fig. 1. Effect of extracting solvents used for melatonin analysis in Platycodon grandiflorum seed. Extracting solvents were 100
% methanol (M100), 100% ethanol (E100), 75% ethanol (E75), 50% ethanol (E50), and 25% ethanol (E25). Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differ- ences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
0 30 60 90 120 150 180
M100E E100E E75E E50E E25E
Melatonin content (ng/g) .
c c
b a
d
Fig. 2. Melatonin contents in P. grandiflorum seed extract. M100 E, E100E, E75E, E50E, and E25E indicated extracts prepared from seeds using 100% methanol, 100% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol, and 25% ethanol, respectively. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differ- ences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
도라지 종자에 대한 연구는 오래전에 조지방, 조단백 함 량(26)이나 flavonoid 존재(27) 정도만 이루어졌고 이후 연 구가 전혀 없다가 최근 들어 유리당, 유기산, 무기질, 아미노 산 및 지방산 등의 구성성분이 밝혀졌다(28,29). 하지만 뿌 리에 비해 종자에서의 기능성 성분이나 특성에 대해서는 거 의 알려진 바가 없다. 일반적으로 종자는 여러 스트레스 조 건에 대한 방어물질로 다른 조직에 비해 멜라토닌 함량이 높은 것으로 알려져 있다(16). 이에 도라지 종자의 기능성 성분으로서 멜라토닌 함량을 분석하였다. 동물에서 처음 확 인된 멜라토닌은 현재 식물을 포함한 다양한 생물체에 존재 하는 것으로 확인되었다. 식물체 내에서의 멜라토닌 기능은 동물에서와 차이가 있지만 공통적으로는 강한 항산화능이 인정되고 있고(12,13), 식물체 유래 멜라토닌도 동물에 의 해 체내로 흡수될 수 있음이 알려짐에 따라 멜라토닌 함량이 높은 식물자원은 새로운 기능성 소재로 활용될 수 있을 것이 다(11,30).
도라지 종자의 멜라토닌 함량을 분석하기 위하여 ELISA 법을 이용하였고, 멜라토닌 함량 분석용 추출용매로는 향후 식품에 적용 가능성을 고려하여 25, 50, 75, 100% 에탄올을 사용하였으며 멜라토닌 분석에 널리 쓰이는 메탄올과도 비 교하였다. 그 결과 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 75% 에탄올을 사용한 경우에 종자 1 g당 멜라토닌 함량은 12.4 ng으로 가장 높게 측정되었고 50%, 25%, 100% 에탄올을 사용하면 점차적으로 멜라토닌 함량이 낮게 측정되었으며, 메탄올은 50% 에탄올보다도 비효율적이었다. 각 용매로 추출 시 얻어 지는 가용성 고형물의 수율이 8.4~9.6%로 큰 차이가 없었던 점을 고려하면 75% 에탄올이 상대적으로 다른 성분보다는 멜라토닌을 더 잘 추출할 수 있음을 의미한다. 한편 각 용매 로 추출하여 얻어진 가용성 고형물에서의 멜라토닌의 함량 을 비교한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 즉 75% 에탄올 추출 물에서의 멜라토닌 농도가 146.8 ng/g으로 가장 높았고 그 다음 50% 에탄올 추출물(120.0 ng/g)이었으며 100% 에탄
올 추출물(13.0 ng/g)에서 가장 낮았다. 25% 에탄올 추출물 (75.2 ng/g)에서의 멜라토닌 함량은 메탄올 추출물(69.0 ng/g)에서의 함량과 유의적 차이는 없었다(P>0.05). 이상의 결과로부터 75% 에탄올은 종자로부터 멜라토닌을 추출하 여 분석하기에 가장 우수한 용매였으며, 75% 에탄올로 추출 하여 얻어진 가용성 고형물은 멜라토닌 함량도 가장 높았다.
Reiter 등(30)은 멜라토닌 함량이 3.5 ng/g 수준인 호두를 쥐에게 섭취시킨 결과 혈중 멜라토닌 수치가 12 pg/mL에서 38 pg/mL까지 상승하여 생체 내에서 작용할 수 있음을 보 고한 바 있다. 이에 호두보다 멜라토닌 함량이 높은 도라지 종자를 섭취하거나 종자보다 11배 이상의 멜라토닌이 존재 하는 75% 에탄올 추출물을 섭취하는 것은 생체에 긍정적인 효과를 부여할 수 있다고 판단된다.
한편 이전의 연구(17)에서 유채 종자를 발아시키면 0.8 ng/g이었던 멜라토닌 함량이 발아 6일째에 14.9 ng/g으로 증가함을 보고한 바 있다. 이에 따라 도라지 종자도 4일 및 8일 동안 발아시켜서 싹을 얻은 후에 75% 에탄올 추출물을 제조한 후 멜라토닌 함량을 분석하였다. 그 결과 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 멜라토닌 함량은 4일 발아 싹 추출물에서 37.0 ng/g, 8일 발아 싹 추출물에서 23.6 ng/g으로 나타나 종자 추출물보다 낮았고 발아기간이 길어짐에 따라 멜라토 닌 함량이 더 감소하여 유자종자의 경우와는 차이를 보였다.
뿌리의 75% 에탄올 추출물은 멜라토닌 함량(3.1 ng/g)이 가장 낮았다. 결론적으로 종자에는 4일 발아 싹의 약 4배, 8일 발아 싹의 약 6배, 그리고 뿌리의 약 47배에 달하는 멜라 토닌이 존재하므로 싹이나 뿌리 같은 성체조직보다 종자가 훨씬 우수한 천연 멜라토닌 자원임을 알 수 있었다.
총 페놀화합물 함량
페놀화합물은 식물의 이차 대사산물로서 단순한 페놀분 자로부터 복잡한 고분자를 포함하며 수소원자나 전자를 공 여하여 자유 라디칼을 소거하는 항산화 작용을 한다(31).
0 30 60 90 120 150 180
S G4 G8 R
Melatonin content (ng/g) . a
d c
b
Fig. 3. Melatonin contents in 75% ethanol extracts of P. grandi- florum seed, sprout, and root.S: seed, G4 and G8: sprouts ob- tained at 4- and 8-day germination, respectively, R: root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show sig- nificant differences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
0 15 30 45 60
S G4 G8 R
Gallic acid equivalent (μg/g) . a
c b
b
Fig. 4. Total polyphenol contents in 75% ethanol extracts of P.
grandiflorum seed, sprout, and root. S: seed, G4 and G8: sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R: root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show sig- nificant differences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
0 100 200 300 400 500 600
S G4 G8 R
Trolox equivalent (μmol/g) .
a
d b c
Fig. 5. DPPH radical scavenging activity of 75% ethanol extracts of P. grandiflorum seed, sprout, and root.S: seed, G4 and G8:
sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R:
root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differences at P<0.05 level by Duncan’s multi- ple range test.
이러한 작용을 통해 페놀화합물은 산화적 스트레스로부터 생체를 보호하며 식품에서의 산패억제, 독성산화물 형성 지 연, 영양품질 유지, 저장기한 연장에 도움을 주는 물질로 알 려져 있다(32). 도라지 종자의 75% 에탄올 추출물에 존재하 는 총 페놀화합물 함량은 gallic acid 기준으로 50.2 μg GAE/g이었고, 4일 및 8일 발아 싹 추출물은 종자 추출물보 다 낮은 21.0 및 15.2 μg GAE/g의 총 페놀화합물 함량을 보였으며 발아 기간에 따라 감소하였다(Fig. 4). 뿌리 추출 물은 총 페놀화합물 함량이 2.8 μg GAE/g으로 가장 낮았다.
총 페놀화합물 함량의 이 같은 경향은 멜라토닌의 경우와 유사하였다. 75% 에탄올 추출물에서는 다른 용매 추출물에 비해 종자 고유의 짙은 적자색이 좀 더 나타났는데(data not shown), 이는 Inada 등(27)이 종자에서 확인하였던 플라보 노이드류가 추출된 결과로 보인다. 하지만 75% 에탄올 추출 물에서의 자세한 페놀화합물 조성에 대해서는 추가적인 연 구가 필요하다고 판단된다.
항산화능 평가
산화제 및 활성산소종은 인간을 포함한 호기호흡 생물의 대사과정 중에 생성되어 암, 심장질환 등의 다양한 질병이나 노화 등을 유발한다. 이로 인해 산화물질을 중화시킬 수 있 는 항산화능이 높은 식품자원에 대한 관심이 증가하였다 (33). 하지만 식품과 같은 혼합시료의 항산화능은 분석법에 따라 차이를 보이므로 다른 평가기작을 가진 다양한 분석법 을 동시에 적용하여 비교할 필요가 있다. 일반적으로 항산화 능의 평가는 전자공여능 또는 수소원자공여능으로 구분하 나 명확하지 않은 경우도 많다. 예를 들어 널리 알려진 항산 화능 분석법 중에서 DPPH와 ABTS법은 두 기작의 구분이 명확하지 않고 반응용액 및 조건에 따라 영향을 받을 수 있 으며, FRAP법은 전자공여능, ORAC법은 수소원자공여능 을 평가할 수 있는 것으로 알려져 있다(34,35).
DPPH는 화학적으로 수 시간 동안 안정된 유기 질소 라디 칼로서 유기용매 조건에서는 항산화제의 전자공여능 측정 에 주로 이용되는 것으로 알려져 있기에(34) 75% 에탄올 추출물의 항산화능 분석에서는 주로 전자공여능을 측정하 는 것으로 추정된다. 도라지 종자 및 발아 싹, 뿌리 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 농도별로 분석한 결과 모든 시료에 서 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 있었다(data not shown). 이에 DPPH 라디칼을 50% 소거할 때의 시료 농도 (IC50)를 Trolox의 IC50과 비교하여 DPPH 라디칼 소거능을 TE로 표시한 결과 Fig. 5와 같았다. 즉 종자 추출물이 519.1 μmol TE/g의 가장 높은 항산화능을 나타냈으며, 4일 및 8일 발아 싹 추출물들의 항산화능은 각각 123.4 및 96.9 μmol TE/g으로 발아 기간에 따라 점차 감소하였다. 뿌리 추출물 의 DPPH 라디칼 소거능은 가장 낮은 값인 21.2 μmol TE/g 을 보였다. Shon 등(36)은 도라지 뿌리의 에탄올 추출물이 우수한 DPPH 라디칼 소거능이 있다고 하였는데, 본 연구 결과 도라지 종자가 뿌리보다 24배 이상 DPPH 라디칼을 강하게 소거시킬 수 있음이 확인되었다. 도라지 종자, 싹 및
0 400 800 1200 1600 2000
S G4 G8 R
ORAC value (μmol/g) .
a
c b
b
Fig. 8. ORAC of 75% ethanol extracts of P. grandiflorum seed, sprout, and root. S: seeds, G4 and G8: sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R: root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differ- ences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
0 100 200 300 400 500 600
S G4 G8 R
Trolox equivalent (μmol/g) . a
c b b
Fig. 7. FRAP of 75% ethanol extracts of P. grandiflorum seed, sprout, and root. S: seed, G4 and G8: sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R: root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differ- ences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
0 200 400 600 800
S G4 G8 R
Trolox equivalent (μmol/g) . a
d c
b
Fig. 6. ABTS radical scavenging activity of 75% ethanol extracts of P. grandiflorum seed, sprout, and root.S: seed, G4 and G8:
sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R:
root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differences at P<0.05 level by Duncan’s multi- ple range test.
뿌리 추출물에 대한 ABTS 라디칼 소거능 평가에서도 농도 의존성을 나타냈으며 TE로 표시한 ABTS 라디칼 소거능은 Fig. 6과 같았다. 즉 종자 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 645.1 μmol TE/g으로 가장 높았고, 그다음 4일(247.2 μmol TE/g) 및 8일(136.7 μmol TE/g) 발아 싹 추출물이었으며, 뿌리 추출물이 41.5 μmol TE/g으로 가장 낮아 DPPH 라디 칼 소거능과 유사한 양상을 보였다. Jeong 등(3)은 도라지 잎, 줄기의 에탄올 추출물도 ABTS 라디칼 소거능이 있다고 보고한 바 있다. 그러나 본 연구 결과 종자의 발아로 싹이 나면서 ABTS 라디칼 소거능이 점차 감소하였기에 잎이나 줄기보다도 종자의 항산화능이 높을 것으로 여겨지나 확인 을 위해서는 추가적인 비교 연구가 필요하다고 판단된다.
한편 DPPH나 ABTS 라디칼 소거능의 경우 유기용매 조건 에서는 물질의 전자공여능에 의한 것이나 본 실험에서는 75% 에탄올 추출물을 사용하였기에 수소원자공여능에 의 한 효과를 완전히 배제하기는 어렵다(34). 그러므로 추출물 의 항산화능 중에서 순수한 전자공여능을 비교해 보기 위해 FRAP법(22)을 수행하였다. 이 방법에서는 항산화능 증가 에 따라 흡광도(593 nm)도 증가하기에 DPPH나 ABTS법과 는 달리 흡광도 값을 0.1 증가시키는 데 필요한 시료 농도(Δ OD0.1)를 Trolox와 비교하여 TE값을 산출하였다(35). 그 결과 전자공여능도 종자 추출물(471.1 μmol TE/g)이 가장 높아 뿌리 추출물(23.5 μmol TE/g)의 약 20배에 달하였다 (Fig. 7). 4일 및 8일 발아 싹 추출물의 전자공여능은 각각 96.6 및 91.1 μmol TE/g으로 싹들 간에 유의차는 없었다.
이 결과는 발아 싹들 간에 유의차를 보였던 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 결과와는 차이가 있는 것으로 아마도 두 발아 싹들 간에 전자공여능은 유사하나 4일 발아 싹의 수소원자 공여능이 다소 높았기 때문으로 추정된다. DPPH, ABTS 및 FRAP법은 기본적으로 생체에서 나타나지 않는 자유 라 디칼의 사용이나 반응조건에서 전자나 수소원자공여능을 평가하는 방법이다. 그러므로 생체나 식품에서 실제로 작용
하는 자유 라디칼인 과산화 라디칼에 대한 소거능을 평가하 기 위해서는 ORAC법을 자주 이용한다(23). 이 방법에서는 AAPH 유래의 과산화 라디칼을 소거할 수 있는 수소원자공 여능을 분석하는 것으로 생리적 조건과 유사한 pH 7.4, 37°C 수용액의 반응조건을 사용하며 항산화능의 총량을 나 타낸다(23,34). 도라지 종자, 발아 싹 및 뿌리 추출물에 대한 ORAC 분석 결과(Fig. 8), 앞의 방법들을 통해 얻은 결과와 유사하였다. 즉 종자 추출물의 ORAC값이 1,438.7 μmol TE/
g으로 과산화 라디칼에 대한 수소원자공여능이 가장 높았고 뿌리 추출물은 66.9 μmol TE/g으로 가장 낮았다. 발아 싹의 경우 4일 싹에서 774.4 μmol TE/g, 8일 싹에서는 591.6 μmol TE/g으로 유의적 차이는 없었으나(P>0.05), 4일 싹의 수소원자공여능이 다소 높았다.
이상의 결과로부터 도라지 종자는 싹이나 뿌리에 비해 멜 라토닌 함량뿐 아니라 페놀화합물 함량, 항산화능 모두 높았 으며 그 양상은 모두 유사하였다. 한편 Kim(35)은 동일한 방법들을 이용해 멜라토닌의 항산화능을 보고한 바 있어 종 자 추출물의 항산화능이 높은 것은 아마도 높은 멜라토닌
0 25 50 75 100 125
0 5 10 50 100 500
Concentration (μg/mL)
Cell vialbility (%) .
S G4 G8 R
a a aa
aa a a a
a a
a a
a a
a a a a a
b b
c c
Fig. 9. Viability of 3T3-L1 cells treated with 75% ethanol extracts of P. grandiflorum seed, sprouts, and root.S: seed, G4 and G8:
sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R:
root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters at each bar show significant differences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
-60 -40 -20 0 20 40
CAA (unit) .
S G4 G8 R a
b
d c
Fig. 10. CAA of 75% ethanol extracts at 40 μg/mL of P. grandi- florum seed, sprout, and root in 3T3-L1 cells. S: seed, G4 and G8: sprouts obtained at 4- and 8-day germination, respectively, R: root. Data represent the mean±SD of triplicates. Different letters show significant differences at P<0.05 level by Duncan’s multiple range test.
함량과도 관련이 있다고 판단된다. 또한 멜라토닌 추출에 가장 효율적인 용매가 75% 에탄올이었는데 이 용매는 페놀 화합물과 항산화 물질 추출에도 가장 우수하였다고 보고된 바 있어(37) 종자의 75% 에탄올 추출물에 멜라토닌 함량과 더불어 페놀 및 항산화 물질 함량이 높은 것으로 판단된다.
세포에서의 독성 및 항산화능
앞서 사용한 DPPH, ABTS, FRAP, ORAC법에 의해 대상 물질이 높은 항산화능을 보이더라도 그 결과는 단순한 화학 적 반응을 통해 얻어진 것이다. 그러므로 이러한 결과를 세 포 내로의 흡수나 세포 내에서의 작용이 필요한 생물체 내 결과와 직접 연관시키기에는 무리가 있다. 이에 항산화능이 확인된 물질들에 대해 생물체 내에서의 항산화능을 평가하 는 방법으로서 세포 항산화 분석법이 개발되었다(25). 이 분석법에서는 비극성의 DCFH-DA가 세포 내로 확산되어 세포 내 에스터레이스에 의해 2개의 아세틸기를 잃고 극성 의 2’,7’-dichlorofluorescin(DCFH)으로 전환되어 세포 내 에 존재하게 된다. DCFH가 세포 내 과산화 라디칼에 의해 산화되면 형광의 2’,7’-dichlorofluorescein(DCF)으로 전 환되지만, 세포 내로 들어온 항산화 물질이 과산화 라디칼을 소거하면 DCF 생성이 억제되어 형광이 감소한다. 그러므로 대조구에 비해 시료 첨가구에서 형광이 감소되는 정도를 측 정해 세포 내 항산화능, 즉 CAA를 평가하는 방법이다. 본 실험에서 사용한 세포주는 3T3-L1이었다(38).
일반적으로 추출물의 세포 내 항산화능을 평가하기에 앞 서 추출물의 세포독성을 먼저 평가하여 적용이 가능한 시료 양을 확인한다. 이를 위해 도라지 종자, 발아 싹 및 뿌리 추출 물을 0~500 μg/mL 농도 범위에서 세포에 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 조사하였는데, 이때 대조구 세포 의 생존율은 100%로 하였다. 그 결과 Fig. 9에서와 같이 종자, 발아 싹 및 뿌리 추출물 모두 50 μg/mL 처리까지는 대조구에 비해 유의적으로 생존율이 감소하지 않아 세포 독
성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 세포 내 항산화능 분석을 위해서는 좀 더 안전하게 40 μg/mL 농도로 각 추출 물을 3T3-L1 세포에 처리하여 CAA값을 분석하였다. 그 결과 Fig. 10에 나타낸 바와 같이 종자 추출물의 CAA값이 21.5 unit으로 나타나 세포 내에서의 항산화능이 확인되었 다. 그러나 발아 싹 추출물들은 오히려 대조구보다 세포 내 산화를 더 진행시켰으며 뿌리 추출물의 효과는 거의 없었다.
이처럼 종자 추출물의 세포 내 항산화능이 발아 싹이나 뿌리 추출물보다 높은 이유는 종자 추출물에 멜라토닌 및 페놀화 합물의 함량, 그리고 항산화능이 높기 때문으로 추정된다.
실제로 Phiphatwatcharaded 등(39)은 멜라토닌 자체가 세 포 내에서 항산화능이 있음을 보고하였고, Wolfe와 Liu(25) 도 페놀화합물의 세포 내 항산화능을 보고한 바 있다.
일반적으로 식물의 종자는 향후 성체식물 발생을 위한 기 관으로 탄수화물, 단백질, 지방 등이 풍부하여 오래전부터 인간의 주요한 영양급원으로 이용되어 왔을 뿐 아니라(40), 산화적 스트레스로부터 조직을 보호하기 위한 항산화 물질 들이 풍부하여 인체에도 유용한 기능성을 부여할 수 있는 것으로 알려져 있다(14-16). 이에 다양한 종자에 대한 기능 성 평가는 물론 발아를 통한 종자의 기능성 향상이나 유용한 기능성을 지닌 신규 종자의 발굴에 대한 관심도 증가하고 있다(17,41). 도라지는 예로부터 뿌리를 주로 식용 및 약용 으로 사용한 만큼 이에 대한 기능성 연구는 많으나 종자의 기능성 평가는 매우 미미한 수준이다. 이에 본 연구를 통해 기능성 소재로서 도라지 종자의 활용 가능성을 확인한 결과 도라지 종자의 추출물은 멜라토닌 및 페놀 화합물의 함량, 그리고 화학적, 세포 내 항산화능이 매우 높았으며, 특히 발 아 싹은 물론 기능성이 많이 알려진 뿌리보다도 훨씬 우수하 였다. 현재 도라지 종자는 식용유의 제조에 일부 이용되고 있어 식용이 가능하다고 판단되나 아직까지 유지특성이나 구성성분(28,29) 정도만이 알려져 있다. 이에 종자 추출물 의 제품화를 위해서는 향후 추가적인 항산화 물질 분석이나
동물실험을 통한 효능검증 등이 필요하다고 사료된다.
요 약
본 연구에서는 도라지 종자의 기능성을 평가하기 위해 ELISA를 이용한 멜라토닌 함량 분석, 최적 추출용매 선정, 그리고 추출물에 대한 화학적 항산화능 및 3T3-L1 세포주 를 이용한 세포 내 항산화능을 조사하였다. 종자로부터 멜라 토닌 추출에는 75% 에탄올이 가장 우수하였으며 이 추출물 의 멜라토닌 함량은 146.8 ng/g이었다. 해당 추출물의 페놀 화합물 함량은 50.2 μg GAE/g이었으며 DPPH 라디칼 소거 능, ABTS 라디칼 소거능, FRAP, ORAC법으로 분석한 항산 화능이 각각 519.1, 645.1, 471.1, 1,438.7 μmol TE/g으로 나타났다. 이러한 종자 추출물의 멜라토닌 및 페놀화합물 함량, 그리고 항산화능은 싹이나 뿌리보다 높았다. 3T3-L1 세포주에 40 μg/mL 추출물을 처리한 세포 내 항산화능 분 석에서도 종자 추출물이 21.5 unit의 항산화능을 보인 반면 에 싹이나 뿌리 추출물의 항산화능은 나타나지 않았다. 이로 부터 도라지 종자는 싹이나 뿌리보다 멜라토닌 함량이 높고 항산화능이 우수한 새로운 기능성 식품자원으로서의 활용 가능성을 확인하였다.
감사의 글
이 논문은 2015년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단 의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(NRF-2011-0025524) 과 (재)오뚜기재단의 연구 및 출판지원사업 결과의 일부로 서 이에 감사드립니다.
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