새싹인삼 에탄올 추출물의 항산화 및 미백 효능 ⁃

새싹인삼 에탄올 추출물의 항산화 및 미백 효능

⁃ 연구노트 ⁃

박 성 진

한림성심대학교 관광외식조리과/생물소재연구소

Antioxidant Activities and Whitening Effects of Ethanol Extract from Panax ginseng Sprout Powder

Sung-Jin Park

Department of Tourism Food Service Cuisine/Research Institute of Biomaterial, Hallym Polytechnic University

ABSTRACT The antioxidant activities and whitening efficacy of leaf and root extracts of Panax ginseng sprout with 70% ethanol (PSE) were investigated. In the contents of total polyphenol and flavonoid compound, leaf extract was the highest as at 4.83 mg/g and 6.04 mg/g, respectively. In electron donating ability, leaf and root extracts were 52.93% and 47.83%, respectively, at the concentration of 1.0 mg/mL. Tyrosinase inhibition activities of leaf and root extracts were 0.59% and 0.41%, respectively, at the concentration of 1.0 mg/mL. Taken together, these results suggest that P. ginseng sprout has the potential to be developed for functional foodstuff, cosmetics and beauty industrial materials. However, further studies on P. ginseng sprout compounds and their precise biological effects will need to be conducted.

Key words: Panax ginseng sprout powder, antioxidant activity, tyrosinase inhibitory activity, polyphenol, flavonoid

Received 12 November 2018; Accepted 9 December 2018 Corresponding author: Sung-Jin Park, Hallym Polytechnic Universi- ty, Chuncheon, Gangwon 24210, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-33-240-9234 Author information: Sung-Jin Park (Professor)

서 론

체내에 존재하는 항산화 시스템에 의해 인체에서 생성되 는 활성산소는 저해와 방어가 가능하지만, 산업의 발전에 따라 각종 환경요인(매연, 환경호르몬, 알코올 및 흡연 등)은 활성산소의 양을 증가시켜 체내의 항산화 시스템만으로는 산화적 스트레스에 의해 발생하는 손상을 방어하지 못할 수 있다. 대사과정에 생체에 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species)은 생체 내에서 산화 생성물을 합성하며, 이러한 산화물질은 인체에 독성을 일으키며(1), 세포독성 및 암세포의 형성을 촉진한다(2). 이에 대응하여 생명체는 su- peroxide dismutase와 catalase와 같은 효소적 방어기작 과 항산화능을 가지는 물질을 이용하는 방어기작을 가지고 있으며, 방어기작의 약화는 노화의 원인 중에 하나로 활성산 소 제거를 위한 항산화능이 뛰어난 소재의 연구가 이루어지 고 있다(3). 활성산소는 생체 내 단백질의 아미노산을 산화 시켜 단백질의 기능 저하를 초래하며, 세포소기관의 손상을 초래하기도 한다(4,5). DNA에도 손상을 주어 돌연변이나 암의 원인이 되기도 한다. 우리 몸에서 발생하는 질환 중에

암, 동맥경화, 당뇨병, 뇌졸중, 간염, 심근경색, 신장염, 아토 피성 피부염, 파킨슨병 등이 활성산소와 관련이 있다고 알려 져 있다(6-9). 이러한 활성산소는 항산화제를 통해 제거되 는데 비타민 C, 비타민 E, β-카로틴, 카로티노이드 등이 대 표적인 항산화제 물질이며 폴리페놀 및 플라보노이드 또한 항산화 물질로 알려져 있다(10-12). 따라서 생체 내 활성산 소 발생을 억제하기 위해 항산화 물질 개발에 관한 연구들이 많아지고 있으며, 강력한 항산화력을 지닌 butylated hy- droxyanisole 및 butylatedhydroxytoluene과 같은 합성 항산화제가 있지만, 간독성 등 부작용 문제가 제기되어 이를 대체할 수 있는 식품에서 유래된 천연 항산화제 개발이 요구 되고 있으며(13), 이에 따라 안전성이 확보된 천연물을 이용 한 천연 항산화제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(14). 인체 세포의 DNA는 하루에 약 10,000번의 산화 적 공격으로 인해 각종 질병(노화, 암, 심장병 등)을 일으키 지만(15), β-카로틴, 비타민 E, 비타민 C 등과 같은 항산화 영양성분과 총 페놀류 등은 항암효과가 있는 것으로 알려져 있다(16).

새싹인삼(Panax ginseng sprout)은 종자로부터 싹이 터 진 6~8일 사이에 수확된 인삼으로 연중재배가 가능하고 농 약을 사용하여 재배해야 하는 인삼의 재배 환경과 달리 농약 을 사용하지 않고 물로만 재배할 수 있다. 인삼에는 사포닌, 폴리페놀, 폴리아세틸렌, 알칼로이드 등이 다량 함유되어 있 고 그중에서 사포닌은 항산화 작용, 면역증강, 동맥경화와

고혈압 예방(17), 노화 방지 및 간 기능 촉진(18), 항암작용 (19) 등 매우 다양한 효능이 밝혀져 있다(20). 인삼은 가공 방법에 따라 제품의 고부가가치화가 가능하고 다양한 종류 의 가공인삼제품이 개발되어 소비자의 기호를 만족시키고 있다(21). 새싹인삼은 다양한 생리적 유용성을 지닌 작물로 인식되고 있음에도 불구하고 연구는 미비한 실정이다(22).

본 연구에서는 새싹인삼 에탄올 추출물의 미백 효능 및 항산화 활성을 측정하여 항산화 및 화장품 천연소재로서의 활용 가치를 검토하였다.

재료 및 방법

재료

강원도 춘천 소재 수인삼마농장에서 2018년 2월 재배된 새싹인삼(P. ginseng sprout)을 구입한 후 선별･세척하고 풍건한 다음 120 mesh 이하로 분쇄하여 냉장고에 보관하면 서 실험에 사용하였다. 새싹인삼 분말에 10배의 70% 에탄 올을 가한 후 4시간 환류추출 시키고, 추출액을 여과한 다음 감압농축(CCA-1100, Eyela, Tokyo, Japan) 하여 -70°C 에서 급속동결건조(PVTFA 10AT, ILSIN, Gyeonggi, Ko- rea) 과정을 거쳐 분말을 시료로 하여 생리활성 물질 함량분 석 및 미백활성 실험에 사용하였으며, 70% 에탄올로 추출한 추출물의 수율은 14.3%였다.

총 폴리페놀 화합물 함량

총 폴리페놀 함량은 추출물의 페놀성 화합물에 의해 Folin- Ciocalteu’s phenol reagent가 몰리브덴 청색으로 환원되 는 원리를 이용하여 측정하였다(23). 농도별로 만든 시료 1 mL에 10% Folin-Ciocalteu’s reagent와 2% Na₂CO₃ 시약 1 mL를 첨가하여 1시간 동안 암소에서 반응 후 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선(y=22.621x+0.0539, R²=0.9931)은 gallic acid를 이용하여 작성한 후 농도별 시 료의 흡광도를 대입하여 총 페놀 함량을 계산하였다.

총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 농도별로 만든 추출물 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL 및 1.0 M potassium ace- tate 0.1 mL, 증류수 2.8 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실 온에서 30분간 정치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정(24) 하였으며, rutin을 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선(y=

2.4848x+0.0404, R²=0.9999)으로부터 추출물의 총 플라 보노이드 함량을 계산하였다.

전자공여능

추출물의 전자공여작용(electron donating abilities)은 추출물에 대한 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)의 전자공여효과로 각 추출물의 환원력을 측정하였다. 즉 농도

별로 만든 시료 0.2 mL에 에탄올을 사용하여 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL를 첨가하여 혼합한 후 10분 동안 반응시킨 다음 microplate reader로 517 nm에서 흡광도 값을 측정하였다(25). 전자공여능(%)은 [(1－As/Ac)×100)]

으로 나타내었고, As와 Ac에 실험군과 대조군의 흡광도 값 을 각각 대입하여 계산하였다.

DPPH 라디칼

소거능(%) ＝

(

)

control

ABTS 라디칼 소거능

2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 지수 측정의 시료는 75 mM sodium phos- phate buffer(pH 7.4)를 이용하여 농도별로 희석하여 사용 하였다. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate 용액을 암소에서 12시간 동안 반응시켜서 라디칼을 발생시 킨 후 96-well micro plate에 시료 10 μL를 가하고 ABTS 용액 290 μL를 가하여 혼합한 다음 암소에서 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 반응액은 750 nm에서 형광을 측정하 였으며(26), 아래의 식에 의해 라디칼 소거 활성을 계산하였 다. 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다.

Radical scavenging

activity (%) ＝

(

)

환원력 측정

50 mL tube에 농도별로 나눈 시료 0.5 mL와 0.2 M so- dium phosphate buffer 2.5 mL와 1% potassium ferri- cyanide 2.5 mL를 첨가하여 50°C에서 20분간 반응시킨 후 trichloroacetic acid 2.5 mL를 넣어준 다음 1,790×g에 서 10분간 원심분리 하여 새로운 15 mL tube에 상층액 2.5 mL와 3차 증류수 2.5 mL 그리고 0.1% iron(Ⅲ) chloride 0.5 mL를 넣어 잘 섞어준 후 700 nm에서 흡광도를 측정하 였으며, 시료의 환원력은 흡광도의 값으로 나타내었다(27).

Tyrosinase 저해 활성

농도별로 만든 시료 40 μL에 0.1 M potassium phos- phate buffer 100 μL 및 mushroom tyrosinase(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 20 μL, 1.5 mM L-ty- rosine solution 40 μL를 첨가하여 혼합 후 37°C에서 15분 동안 반응시킨 다음 492 nm에서 microplate reader로 측 정하여(28) tyrosinase가 억제되는 정도를 다음과 같이 구 하였다.

Tyrosinase inhibition (%)＝ (D-C)－(B-A) D-C ×100

A와 B: 각각 시료를 가지는 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도

C와 D: 각각 시료를 넣지 않은 용액(기준 용액)의 배양 전과 배양 후의 흡광도

Table 1. Total polyphenolic contents and toatl flavonoid contents of Panax ginseng sprout 70% ethanol extracts

Sample Leaf extract Root extract Total phenolic contents

(GAE¹⁾ mg/g) Total flavonoid contents (RE²⁾ mg/g)

4.83±0.52^* 6.04±0.16^*

4.00±0.39 4.92±0.15

1)Gallic acid equivalent. ²⁾Rutin equivalent.

Values are mean±SE. Values are mean of triplicates.

Significantly different at ^*P<0.05.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of 70% ethanol extracts Panax ginseng sprout. Values represent the mean±SE of three independent measurements. Means with different letters (a-g) above the bars are significantly different by P<0.05.

세포배양

실험에 사용한 세포는 mouse melanoma로부터 유래된 B16F10 세포로 한국세포주은행(Seoul, Korea)로부터 분 양받아 사용하였다. 배양세포에 0.25% trypsin 용액을 희석 한 후 세포를 분리하고 DMEM 배지에 fetal bovine serum (FBS; 10%)과 penicillin/streptomycin(1%, 100 U/mL)을 첨가하여 37°C, 5% CO2 배양기에 적응시켜 사용하였다(29).

MTT assay에 의한 세포 생존 능력 측정

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide(MTT) 측정은 세포를 1×10⁴ cells/well이 되게 96-well plate에 180 µL씩 분주하고 추출물을 농도별 로 20 µL 처리한 후 48시간 배양한 다음 MTT 용액(5 mg/

mL) 20 µL를 첨가하여 3시간 반응시킨 후 배양액을 제거하 고 200 µL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 각 well에 첨가 하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정한 다음 (1－시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100에 의하여 생존율을 계산하였다(30).

Melamin 저해 활성

B16F10 melanoma cell을 5×10⁴ cells/well이 되도록 6-well에 접종･배양하고, 각 well에 추출물을 처리한 후 48 시간 동안 배양한 다음 2회 phosphate buffered saline으로 세척한 후 원심분리 하고 세포침전물을 제조하였다. DMSO (10%)가 첨가된 1 N NaOH 용액(150 µL)을 첨가하고 60°C 에서 1시간 용해하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 실험 군의 멜라닌 양은 무첨가군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다(31).

통계처리

통계처리는 SAS version 9.3(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하였으며, Duncan’s multiple range test로 유의성 P<0.05 수준에서 3회 반복하여 검정하였다.

결과 및 고찰

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

식물성 식품 속에 함유된 페놀화합물의 기능은 다양하며, 식물성 식품에 함유된 페놀성 분자들은 체내에서 항산화, 항비만 및 항염증 등과 같은 기능을 가지고 있는 것으로 알 려져 있으며(32), 플라보노이드류는 화학구조에 따라 fla- vonols, flavones, catechins, isoflavones 등으로 분류되 며, 물과 에탄올에 대한 용해도가 다르고 과산화 지질 생성 억제 등의 생화학적 활성은 구조적 차이에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다(33). 70% 에탄올의 새싹인삼 추출물의 잎과 뿌리의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 Table 1에 나타내었다. 잎과 뿌리의 총 페놀 함량은 4.83 mg/g과 4.00

mg/g을 나타내었으며 총 플라보노이드 함량은 6.04 mg/g 과 4.92 mg/g으로 나타내었다. 새싹인삼 추출물의 항산화에 대한 효과가 있는 것으로 생각되며 추후 항산화 작용에 대한 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

DPPH 라디칼 소거능

특정 물질에 대한 항산화 활성을 측정하는 여러 방법 중 DPPH 자유 라디칼 소거 활성법은 간단하고 대량으로 측정 이 가능하며, 비교적 간단하고 짧은 시간 내에 항산화 활성 을 측정할 수 있어 널리 사용되고 있다(34). 부위별 새싹인삼 추출물의 DPPH 소거능은 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 각각 잎은 10.32, 31.69, 52.93%, 뿌리는 12.60, 32.16, 47.83%로 확인되었으며(Fig. 1), 뿌리와 잎 모두 높은 항산 화 효능을 보였고 잎과 뿌리의 항산화 효능은 비슷한 결과를 보이는 것으로 확인되었다. 식용으로 상용하는 새싹인삼은 전자공여 활성을 나타내었으며 잎의 경우 향후 천연 항산화 제 소재 개발에 유용하게 사용될 것으로 생각된다. 화장품 소재로 많이 이용되고 있는 맥문동 뿌리의 물과 에탄올 추출 물이 1.0 mg/mL의 농도에서 각각 12.78%와 28.9%의 전자 공여활성을 나타낸다는 보고(35)와 비교하면, 새싹인삼 추 출물은 맥문동보다 약 2배 높은 활성을 나타내었다. 이는 새싹인삼 추출물에서 우수한 자유 라디칼에 의한 노화 억제

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of 70% ethanol extracts Panax ginseng sprout. Values represent the mean±SE of three independent measurements. Means with different letters (a-e) above the bars are significantly different at P<0.05.

Fig. 3. Reducing power of 70% ethanol extracts Panax ginseng sprout. Values represent the mean±SE of three independent measurements. Means with different letters (a-g) above the bars are significantly different at P<0.05.

Fig. 4. Tyrosinase inhibition rate of 70% ethanol extracts from Panax ginseng sprout. Means with different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05.

효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.

ABTS 라디칼 소거능

부위별 새싹인삼 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 각각 잎은 46.12, 50.25, 57.27%, 뿌리는 46.34, 49.87, 55.14% 소거능을 나타내었 다(Fig. 2), 잎, 뿌리 추출물 모두 농도 의존적으로 증가하며 항산화 효능을 보였고 잎과 뿌리의 항산화 효능은 비슷한 결과를 보이는 것으로 확인되었다.

환원력

환원력은 시료가 Fe³⁺에 수소를 공여하여 라디칼을 안정 화시킴으로써 Fe²⁺로 환원되는 것을 이용한 방법으로, 새싹 인삼 추출물의 환원력은 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL의 농도에서 각각 잎은 0.09, 0.15, 0.24, 뿌리는 0.09, 0.15, 0.22를 나 타내었으며 농도 의존적으로 증가함을 나타내었고 효과는 미미한 것으로 판단된다(Fig. 3).

Tyrosinase 저해 활성 확인

피부 내에서 tyrosinase는 아미노산인 tyrosine으로 시 작되는 멜라닌 생합성 과정 중에서 tyrosine으로부터 3,4- dihydroxy phenylalanine(DOPA), DOPA로부터 DOPA quinone 그리고 dihydroxyindole로부터 멜라닌을 형성한 다(36). 새싹인삼 추출물을 대상으로 tyrosinase 저해 활성 을 측정한 결과(Fig. 4). 새싹인삼 추출물 5.0, 10.0 mg/mL 에서 잎은 8.3, 22.8%, 뿌리는 15.0, 37.7%의 저해율을 나 타내어 잎보다 뿌리에서 더 좋은 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 비타민 C와 비교하였을 때 tyrosinase 저해 활성 결과가 낮았지만 새싹인삼 뿌리 추출물은 천연소 재로서의 미백기능 효과가 있는 것으로 판단된다. 일부 생약 과 해조류의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 치자 36%,

인삼 27%, 지실 15%, 매생이 21%, 청각 11% 그리고 미역 7%의 저해율을 보고하였으며(37), 제주산 식물을 이용한 tyrosinase 저해 연구에서 1,000 μg/mL의 농도에서 10%

미만의 효과를 나타낸 결과(38)와 비교하여 새싹인삼 추출 물의 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며 돌단풍 잎의 피부 미백 효과와 유사한 결과를 나타내었다(39).

세포 생존율 측정

MTT assay는 cell proliferation과 viability의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있으며, 새싹인삼 추출물에 의한 melanoma 세포의 생존율을 확인한 결과(Fig. 5), 추출 물이 10, 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 확인하였다. 따라서 B16F10 세포에서 세포독성 이 없어 50 μg/mL 농도 이하에서 멜라닌 생합성 저해 실험

Concentration (μg/mL)

Fig. 6. Inhibition melanin synthesis of 70% ethanol extracts from roots of Panax ginseng sprout. Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05.

Concentration (μg/mL)

Fig. 5. Cell viability of 70% ethanol extracts from Panax ginseng sprout on B16F10 melanoma cell. Means with different letters above the bars are significantly different at P<0.05.

을 진행하였다.

마우스 흑색 세포(B16F10)에서의 멜라닌 생합성 저해 활성 측정

멜라닌은 세포 내의 소기관인 ribosome에서 tyrosinase 라는 효소의 생합성에서 합성되기 시작한다. 이 효소의 작용 으로 아미노산의 일종인 tyrosine에서 몇 단계의 합성을 거 쳐, 흑색소포 표면에 침착하여 검고 갈색의 작은 멜라닌 입 자가 만들어진다(40). 새싹인삼 추출물의 melanoma 세포 에서의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과는 Fig. 6에 나타내었다. 측정 결과 새싹인삼 추출물은 50 μg/mL의 농 도에서 무첨가군에 비해 멜라닌 생성을 9.3% 저해하였다.

유럽밤나무 꽃(chestnut flower)의 메탄올, 에탄올, 물 추출 물을 통한 멜라닌 저해 연구에서 보고된 50 μg/mL 농도에 서 멜라닌 생합성 저해는 9, 11, 8%로 새싹인삼 추출물과 비슷한 결과를 나타내었다(41). 초음파 병행을 통한 병풀

(Centella asiatica L.)의 에탄올, 물 추출물의 멜라닌 생합 성 저해는 200 μg/mL의 농도에서 10% 이하의 효과를 나타 낸 결과와 비교하면 새싹인삼 추출물은 피부 색소 침착에 효능이 있는 미백 소재로 이용 가능할 것이라 생각된다(42).

요 약

본 연구에서는 기능성 미백 화장품의 천연 소재로 새싹인삼 (Panax ginseng sprout)을 70% 에탄올로 추출하여 추출물 의 항산화능과 미백 효과에 대해 연구하였다. 70% 에탄올의 새싹인삼 추출물의 잎과 뿌리의 총 페놀 및 플라보노이드 함 량은 4.83 mg/g과 4.00 mg/g을 나타내었으며, 총 플라보노 이드 함량은 6.04 mg/g과 4.92 mg/g을 나타내었다. 잎과 뿌리의 전자공여능은 1.0 mg/mL에서 52.93%, 47.83%, ABTS 라디칼 소거능은 57.27%, 55.14%, 환원력은 0.24, 0.22를 나타냈다. Melanoa 세포에 대한 새싹인삼 에탄올 추출물의 최대허용농도는 100 μg/mL 이상으로 확인되어 세포독성이 미약함을 확인하였다. 뿌리 추출물의 멜라닌 생 성 저해능은 50 μg/mL에서 9.3%를 나타냈으며, 세포 내 tyrosinase 활성 저해능은 10.0 mg/mL에서 잎이 22.8%, 뿌리가 37.7%의 저해율을 나타내었다. 새싹인삼 추출물은 총 페놀화합물 및 총 플라보노이드 화합물 함량이 높아서 항산화 활성 및 미백 효과를 나타내었다. 본 연구 결과를 바탕으로 새싹인삼이 기능성 제품의 소재, 천연 항산화 소재 및 기능성 미백 화장품 소재로써 활용 가능하리라 생각된다.

감사의 글

본 연구에서는 2018년도 한림성심대학교 교내학술연구비 지원에 의하여 수행된 연구 결과의 일부이며 이에 감사드립 니다.

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