갯기름나물 뿌리 추출물의 항산화 활성

(1)

48(1), 32～39(2019) https://doi.org/10.3746/jkfn.2019.48.1.032

서 론

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 세포소 기관 내에서 물질대사에 관여하는 효소들에 의해 자연적으 로 생성되며 여러 가지 세포 반응을 조절할 수 있는 신호분 자가 된다(1). 하지만 과도한 ROS는 치명적인 산소 독성을 일으키며, DNA 변성, 세포막 분해, 단백질 분해 등을 유발하 여 암, 뇌 질환, 심장질환, 자가면역질환 등의 다양한 질병을 일으킨다(2). ROS는 체내 1차 방어기전으로 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase(GR)와 같은 항산화 효소에 의해 제거된다(3). SOD는 superoxide anion을 과산화수소

(hydrogen peroxide)와 산소(oxygen molecule)로 전환하 는 효소이고, CAT는 SOD에 의해 생성된 과산화수소를 산 소와 물로 전환하는 작용을 하는 산화환원효소이다(4,5).

GPx는 NADP⁺를 매개로 과산화수소를 제거하면서 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione disulfate(GSSG) 로 전환시키며, GR은 GSSG를 GSH로 환원시키는 효소이다 (2,6).

생체 내외의 활성산소 방어시스템을 증가시키는 항산화 물질은 두릅 순과 잎, 삼백초, 머위, 담쟁이덩굴 등의 추출물 들을 이용한 식용식물 유래 천연 생리활성 소재들의 연구로 규명되고 있다(7-10). 그중 미나리과(Umbelliferae)에 속 하는 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunb.)은 식용 이나 약용의 가치가 있는 유용한 식물이다(11). 동아시아 해안에 분포하고 있으며, 우리나라에서는 주로 중, 남부 해 안지대에 자생한다(12). 갯기름나물 잎과 줄기는 방풍나물 이라고 부르며 산채 또는 나물로 식용하며, 뿌리는 식방풍 (植防風)이라는 약재로 이용된다(13). 갯기름나물은 ber- gapten, psolalen, xanthotoxin, peujaponiside 등 cou-

갯기름나물 뿌리 추출물의 항산화 활성

임현화¹*․김인용²*․정윤화^1,2

1단국대학교 식품영양학과

2단국대학교 천연물식의약소재산업화연구센터

Antioxidant Activities of Peucedanum japonicum Thunberg Root Extracts

Hyunhwa Lim¹^*, Inyong Kim²^*, and Yoonhwa Jeong^1,2

1Department of Food Science and Nutrition and

2Research Center for Industrialization of Natural Neutralization, Dankook University

ABSTRACT The antioxidant activities of Peucedanum japonicum Thunberg root extracts were investigated in oxida- tively stressed HepG2 cells. P. japonicum Thunberg root was extracted with distilled water (PJRDE) and 95% ethanol (PJREE); their antioxidant activities were analyzed in the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay, the 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging assay, the Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay, and the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. The extracts were evaluated for cellular anti-oxidation and protection using cell viability, intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity, and antioxidant enzyme activities. PJREE contained high amounts of bio-active compounds such as total phenol (5.64 mg gallic acid equivalent/g) and flavonoid (664.2 µg quercetin equivalent/g) and high antioxidant activities in the DPPH radical scavenging assay (95.5% at 1,000 µg/mL), the ABTS radical scavenging assay (87.2% at 2,000 µg/mL), FRAP (39.8 µmol FeSO4/g), and ORAC (133.4 µmol TE/g). The extracts also enhanced antioxidant enzyme activity such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), and glutathione reductase (GR) in the oxidatively stressed HepG2 cells. The activities of SOD, CAT, GPx, and GR were measured at 85.8%, 68.7%, 90.8%, and 105.4%, respectively, with PJREE (1,000 µg/mL). These results suggest that the extract (PJREE) strongly induces antioxidant activity of the enzymes including SOD, CAT, GPx, and GR and is composed of effective antioxidant compounds against H2O2-stressed HepG2 cells.

Key words: Peucedanum japonicum Thunberg, oxidative stress, antioxidant activity, HepG2 cell, superoxide

Received 22 October 2018; Accepted 28 November 2018 Corresponding author: Yoonhwa Jeong, Department of Food Sci- ence and Nutrition, Cheonan, Chungnam 31116, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-41-550-3477

*These authors contributed equally to this work.

Author information: Hyunhwa Lim (Graduate student), Inyong Kim (Researcher), Yoonhwa Jeong (Professor)

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marin계 물질이 주요 성분으로 알려져 있으며, 특히 뿌리에 는 peucedanol, umbelliferone 등의 성분이 다량으로 함유 되어 있다(14). 현재까지 갯기름나물에 관한 연구로는 혈관 성 치매에 대한 예방과 치료 효과, 혈압강하작용, 갯기름나 물의 성분 분리 및 생리활성, 미백 및 주름 개선 효과 등이 보고되고 있지만(15-18), 항산화 효능에 관한 연구는 미비 한 실정이다.

본 연구에서는 갯기름나물 뿌리 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량, 전자공여능, 수소공여능의 항산화 활성, HepG2 세포 내 활성산소종(ROS) 소거 활성, 항산화 효소 (SOD, CAT, GPx, GR) 활성을 알아보았다.

재료 및 방법

재료

본 연구에 사용된 갯기름나물 뿌리(Peucedanum japo-

nicum Thunberg)는 충청남도 태안에서 재배된 것을 구입

(약초장터, 충북 제천)하여 사용하였다. Quercetin, gallic acid, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium acetate, potassium persulfate, 2,7-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA), Folin-Cio- calteu’s phenol reagent는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 바이오세 상(Seongnam, Korea)에서 구매하였다. Dulbecco’s modi- fied Eagle’s medium(DMEM)은 WELGENE(Daegu, Ko- rea)에서 구매하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Biowest (Nuaillé, France)에서 구매하였다. Sodium acetate는 Showa(Tokyo, Japan)에서, aluminum nitrate는 덕산과학 (Seoul, Korea)에서 구매하였다.

추출물 제조

갯기름나물 뿌리는 암소에서 건조한 후 분말로 만들어 물 과 에탄올로 추출하였다. 물 추출물은 건조된 시료 150 g에 증류수 1.5 L를 넣고 100°C에서 4시간 환류 추출하였다.

에탄올 추출물은 건조된 시료 150 g에 95% 에탄올 1.5 L를 넣고 78°C에서 4시간씩 3회 환류 추출하였다. 추출된 표본 들은 감압 여과하여 농축기(R-3000, BuCHI Labortechnik AG, Essen, Germany)로 농축한 후 동결건조기(FD8505, Ilshin Lab Co., Dongducheon, Korea)로 건조하여 분말시 료로 사용하였다. 항산화 성분 측정과 항산화 활성 측정을 위하여 분말시료는 증류수에 1 mg/mL로 녹인 뒤 각 실험에 희석하여 사용하였다.

항산화 성분 측정

갯기름나물 뿌리 추출물의 총 플라보노이드 함량은 건강 기능식품공전 시험법 해설서의 방법(19)을 응용하여 측정 하였다. 1 mg/mL의 물 추출액과 에탄올 추출액 40 μL에

증류수 24 μL와 에탄올 120 μL를 넣고 희석하였다. 10%

aluminum nitrate와 1 M potassium acetate를 각각 8 μL 씩 첨가하고 40분 동안 빛을 차단한 상태로 방치하였다. 샘 플들은 microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin(0~200 µg/

mL)을 이용해 표준 검량선을 작성한 후, 추출물의 총 플라 보노이드 함량을 1 g당 mM quercetin equivalent(mM QE/g)로 표기하였다.

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 Singleton 등(20)의 방법을 응용하여 측정하였다. 1 mg/mL의 각 추출액 2 μL에 증류수 158 μL를 넣고 희석한 후 2 N의 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent를 10 μL 첨가하였다. 20% Na₂CO₃용액 30 μL를 가한 후 빛을 차단하여 2시간 동안 방치하였다. 샘플들 은 microplate reader를 이용하여 765 nm 파장에서 흡광 도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(0~1,000 μg/mL) 를 이용해 표준 검량선을 작성한 후 추출물의 총 페놀 함량을 시료 1 g당 mg gallic acid equivalent(mg GAE/g)로 표기 하였다.

항산화 활성 측정

갯기름나물 뿌리 추출물의 항산화 활성을 in vitro에서 측정하기 위하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 과 ABTS의 라디칼 소거능과 ferric reducing antioxidant power(FRAP), oxygen radical absorbance capacity (ORAC)를 통한 항산화 능력을 분석하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(21)의 방법을 응용하여 측정하였다. 0.15 mM DPPH 용액 240 μL에 시료 160 μL를 넣고 30분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등(22) 의 방법을 응용하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate 용액을 섞어 빛을 차단한 상태로 16시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시켰다. 실험 직전에 ABTS 라디칼 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02 가 될 때까지 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 200 μL와 시료 50 μL를 혼합하여 3분 동안 방치한 후 microplate reader를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였 다. FRAP는 Benzie와 Strain(23)의 방법을 응용하여 측정 하였다. 0.3 M sodium acetate buffer(pH 3.6), 증류수에 녹여 만든 20 mM FeCl3･6H2O, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)을 혼합하여 37°C에서 15분간 활성화한 후 FRAP reagent 290 μL와 시료 10 μL를 혼합하여 37°C에서 15분간 빛을 차단해 반응 시킨 다음 microplate reader를 이용하여 593 nm에서 흡 광도를 측정하였다. ORAC법은 형광물질을 이용하여 과산 화기의 소거 활성을 측정하는 것으로, Ou 등(24)의 방법으 로 측정하였다. 10 µg/mL 농도의 시료 50 µL와 75 mM

(3)

phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 78 mM fluorescein 용 액 50 μL를 섞어 37°C에서 10분간 방치하였다. 방치 후 221 mM 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 25 μL를 첨가하여 microplate reader를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm 파장에서 2분마다 연속적으로 형광을 측정하였다.

HepG2 세포배양

HepG2 세포는 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)에 서 분양받아 사용하였다. 세포는 10% FBS와 1% penicil- lin-streptomycin, 4 mM L-glutamine, 4,500 mg/L glu- cose, sodium pyruvate가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 incubator에서 37°C로 배양하였다.

MTT assay에 의한 세포 생존율 분석

MTT assay를 이용하여 과산화수소로 산화스트레스가 유발된 HepG2 세포의 생존에 갯기름나물 뿌리 추출물이 미치는 영향을 측정하였다. 96-well plate에 세포를 2×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 37°C에서 배양 하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10%(v/v) FBS를 포함한 DMEM 배지 198 μL와 시료 2 μL를 넣어 시료의 최종 농도 가 50~1,000 μg/mL가 되도록 하였다. 1시간 후 1 mM H₂O₂를 처리하여 24시간 동안 배양하면서 산화스트레스를 유도하였다. 그 후 배지를 제거하고 50 μg/mL 농도의 MTT 용액을 각 well에 200 μL를 넣은 다음 4시간 동안 배양하였 다. MTT 용액을 제거하고 200 μL dimethyl sulfoxide를 넣어 formazan crystal이 완전히 용해되면 ELISA reader 를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다(25).

세포 내 활성산소종 소거 활성

세포 내 ROS 소거 활성은 DCF-DA 방법을 이용하여 측정 하였다. HepG2 세포를 96-well plate에 2×10⁴cells/well 이 되도록 분주하고 37°C에서 24시간 동안 5% CO₂ in- cubator를 이용하여 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMEM 배지 198 μL와 시료 2 μL를 넣어 시료의 최종 농도 가 50~1,000 μg/mL가 되도록 한 후, 1 mM 농도로 H₂O₂를 처리하여 1시간 동안 산화스트레스를 유도하였다. 그 후 20 μM DCFH-DA 용액을 처리한 후 45분 동안 방치하여 fluorescence microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광 강도를 측정하였다.

항산화 효소 활성 측정

HepG2 세포에서의 항산화 지표 효소인 SOD, CAT, GPx, GR을 대상으로 활성 측정을 하였다. SOD 활성은 SOD assay kit(BioVision, San Francisco, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. HepG2 세포에서 SOD 활성을 측정하기 위해서 0.1 M Tris-HCl(pH 7.4) buffer로 용해한 세포를 14,000×

g로 5분 동안 원심분리 한 후 상층액을 시료로 사용하였다.

96-well plate에 시료 20 μL, WST working solution 200 μL, dilution buffer 20 μL, enzyme working solution 20 μL를 넣고 37°C에서 20분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광 도를 측정하였다. CAT 활성은 catalase activity colorimetric assay kit(BioVision)을 이용하여 측정하였다. HepG2 세포에서 CAT 활성을 측정하기 위해서 assay buffer로 용 해한 세포를 10,000×g로 15분 동안 원심분리 한 후 상층액 을 시료로 사용하였다. 96-well plate에 시료 60 μL, assay buffer 18 μL, 1 mM H₂O₂ 12 μL를 넣고 25°C에서 30분간 반응시킨 후, stop solution 10 μL를 넣어서 반응을 정지시 켰다. 반응을 정지시킨 용액에 developer mix 50 μL를 넣 고 25°C에서 10분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. GPx 활성은 glutathione peroxidase activity colorimetric assay kit(BioVision)을 이용하여 측정하였 다. HepG2 세포에서 GPx 활성을 측정하기 위해서 assay buffer로 용해한 세포를 10,000×g로 15분 동안 원심분리 한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 96-well plate에 시료 40 μL, assay buffer 10 μL, reaction mix 40 μL를 넣고 15분 동안 반응시킨 후, cumene hydroperoxide solution 10 μL를 넣고 혼합하였다. 혼합된 용액은 340 nm에서 흡광 도를 측정하였고, 25°C에서 30분간 반응시킨 후 재측정하 였다. GR 활성은 glutathione reductase activity colorimetric assay kit(BioVision)을 이용하여 측정하였다.

HepG2 세포에서 GR 활성을 측정하기 위해서 assay buffer 로 용해한 세포를 10,000×g로 15분 동안 원심분리 한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 96-well plate에 시료 40 μL, assay buffer 10 μL, reaction mix 50 μL를 넣고 405 nm에 서 흡광도를 측정하였고, 25°C에서 10분간 반응시킨 후 재 측정하였다.

통계처리

실험 결과는 Minitab 16(Minitab Inc., State College, PA, USA)으로 통계처리 하였고, 일원 분산분석과 Fisher’s 비교 검정법을 통해 유의차(P<0.05) 검정을 하였다.

결과 및 고찰

항산화 성분 함량 및 항산화 활성

갯기름나물 뿌리 추출물 동결건조 분말 시료의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 총 페놀 함량은 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물(PJREE)이 5.6 mg GAE/g, 물 추출물(PJRDE)이 4.8 mg GAE/g으로 PJRDE보다 PJREE 의 총 페놀 함량이 많았다. 총 플라보노이드 함량에서도 PJREE가 664.2 µg QE/g으로 PJRDE(541.6 µg QE/g)보다 함량이 많았다. 갯기름나물 뿌리 추출물의 항산화 활성을 in vitro에서 측정하기 위하여 DPPH와 ABTS의 라디칼 소 거능과 FRAP, ORAC를 통한 항산화 능력을 분석하였다. 시

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료의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Table 2와 같이 추출물 농 도에 의존적으로 증가하였다(125~1,000 μg/mL). EC₅₀값 은 DPPH 라디칼 소거 활성과 반비례 관계로 값이 낮을수록 높은 활성을 의미하는데, PJRDE의 EC₅₀값이 602.9 µg/mL 를 나타냈지만 PJREE에서는 514.7 µg/mL로 높은 활성을 확인할 수 있었다(Table 2). 항산화 활성은 식물체의 페놀류 나 플라보노이드 물질에 기인한다는 Kang 등(26)의 연구에 의하면 총 페놀과 총 플라보노이드 함량이 높았던 PJREE에 서 항산화 활성이 높았다. PJREE(1,000 μg/mL)의 DPPH 라 디칼 소거 활성은 95.5%로 높았으며, 양성대조군인 ascorbic acid의 활성 측정 결과인 96.3%와 유의적 차이가 없었 다. ABTS 라디칼 소거 활성은 Table 3과 같이 추출물 농도 에 의존적으로 증가하였다(250~2,000 μg/mL). TEAC가 높을수록 시료 1 g에 상당하는 Trolox의 양이 많기 때문에 ABTS 라디칼 소거 활성이 높다는 것으로 의미하는데, PJRDE의 TEAC 값이 42.2 μmol TE/g을 나타낸 반면에 PJREE에서는 50.6 μmol TE/g으로 유의적으로 높았다

(Table 3). 갯기름나물 뿌리와 같이 약재로 사용되는 약초 추출물의 항산화 활성에 관한 연구에서는 개사철쑥(30.8 μ mol TE/g), 대청(5.8 μmol TE/g), 수염가래꽃(11.4 μmol TE/g)이 PJRDE(42.2 μmol TE/g)보다 항산화 활성이 낮았 다(27). 또한, 본 연구과 같이 뿌리를 활용한 Hong 등(28)의 연구에서는 갈대 뿌리 분획물의 항산화 활성에 관한 연구에 서 200 μg/mL 농도의 뷰틸 알코올 추출물은 83%, 에틸아세 테이트 추출물은 78%, 헥산은 25%, 물 추출물은 15%의 ABTS 라디칼 소거 활성을 보인 반면에 PJRDE(250 µg/

mL)는 14%로 갈대 뿌리 추출물보다 항산화 활성이 낮았다 고 보고하였다. 본 결과에서는 DPPH 라디칼 소거능과 같이 갯기름나물 뿌리 에탄올 추출물이 물 추출물보다 ABTS 라 디칼 소거 활성이 높아 전자공여능에 따른 항산화 활성이 높음을 확인할 수 있었다. FRAP와 ORAC 방법에 의한 라디 칼 소거 활성은 Table 4와 같다. ORAC 측정의 PJREE는 133.4 μM TE/g, PJRDE는 58.2 μM TE/g으로 PJREE의 항산화 활성이 유의적으로 높았다. 본 연구와 같이 뿌리를 활용한 Lee 등(29)의 소리쟁이 뿌리 추출물 시료의 항산화 활성에 관한 연구에서도 물 추출물(1,286 μM TE/g)보다 에탄올 추출물(1,396 μM TE/g)에서 높은 항산화 활성을 나타냈다. FRAP 측정에서는 PJREE가 39.8 μM FeSO₄/g, PJRDE가 27.3 μM FeSO₄/g으로 PJRDE보다 PJREE에서 환원력 활성이 높았다. 시료의 총 페놀 함량이 높을수록 FRAP법에 의한 환원력 활성이 높다고 보고한 Lee 등(1)의 연구와 같이 본 연구에서 총 페놀 함량이 높았던 에탄올 추 출물에서 환원력 활성이 높았다. 또한 본 연구와 같이 뿌리 를 활용한 Lee 등(29)의 연구에 의하면 삼채 뿌리와 잎 추출 물 시료의 항산화 활성 및 항염증에 관한 연구에서 물 추출 Table 1. Total phenol and flavonoid contents of Peucedanum

japonicum Thunberg extracts Samples¹⁾ Total phenol content

(mg GAE/g)²⁾

Total flavonoid content (µg QE/g)³⁾ PJRDE

PJREE

4.75±0.03^b 5.64±0.11^a

541.61±7.59^b 664.17±6.76^a

1)PJRDE: P. japonicum Thunberg root distilled water extract, PJREE: P. japonicum Thunberg root ethanol extract.

2)mg GAE/g: mg gallic acid equivalent per sample 1 g.

3)µg QE/g: µg quercetin equivalent per sample 1 g.

Values are mean±SD (n>3 independent experiments).

Means with different letters (a,b) in the same column are sig- nificantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Table 2. DPPH radical scavenging activity of P. japonicum Thunberg extracts (%)

Samples¹⁾ Concentration (µg/mL)

EC50 (µg/mL)²⁾

125 250 500 1,000

PJRDE PJREE

5.83±2.25^Bd 7.17±0.79^Bd

22.69±1.33^Cc 31.21±2.07^Bc

38.12±1.34^Cb 52.16±1.54^Bb

85.84±2.90^Ba 95.52±2.19^Aa

602.89±2.73Â 514.70±7.26^B Ascorbic acid 95.67±0.30Âa 96.11±0.35Âa 95.77±0.37Âa 96.25±0.65Âa 31.69±1.03^C

1)PJRDE: P. japonicum Thunberg root distilled water extract, PJREE: P. japonicum Thunberg root ethanol extract.

2)EC50 means the effective concentration of substance that causes% of the maximum response.

Means with different small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A-C) in the same column are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Table 3. ABTS radical scavenging activity of P. japonicum Thunberg extracts (%)

Samples¹⁾ Concentration (µg/mL) TEAC²⁾

(µmol TE/g)

250 500 1,000 2,000

PJRDE PJREE

14.66±0.89^Bd 20.36±0.55^Ad

22.98±1.33^Bc 29.63±2.07^Ac

33.21±1.34^Bb 36.30±1.54^Ab

76.13±2.50^Ba 87.24±2.19^Aa

42.24±1.84^A 50.55±1.02^A

1)PJRDE: P. japonicum Thunberg root distilled water extract, PJREE: P. japonicum Thunberg root ethanol extract.

2)TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity.

Means with small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A,B) in the same column are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(5)

물(200 μM FeSO₄/g)보다 주정 추출물(510 μM FeSO₄/g) 에서 환원력이 높았다. 본 연구에서는 갯기름나물 뿌리의 에탄올 추출물이 물 추출물보다 환원력이 높았기 때문에 전 자 환원력을 갖는 항산화 성분 함량도 높을 것으로 생각된다.

HepG2 세포 생존율

본 실험에서는 갯기름나물 뿌리 추출물에 의한 세포 보호 효과를 알아보기 위해 MTT 측정방법을 이용하여 세포 생존 율을 확인하였다. Fig. 1과 같이 HepG2 세포에 과산화수소 를 처리하여 산화스트레스를 유도하였을 때 대조군에 비해 71%로 감소했지만, 같은 조건의 세포에 125, 250, 500, 1,000 µg/mL의 농도로 갯기름나물 뿌리 추출물 동결건조 분말 시료를 처리한 결과 농도 의존적으로 세포 사멸이 억제 되었다(Fig. 1). 또한, 물 추출물(PJRDE)보다 에탄올 추출 물(PJREE)에서 더 높게 세포 사멸이 억제되었다. H₂O₂는 산화스트레스를 유발시키는 물질로서 in vitro 실험에서 독

성을 일으킬 때 자주 이용되며, H₂O₂에 의해 일어난 산화 손상(oxidative stress)은 활성산소종의 증가와 항산화 방 어시스템 사이의 불균형을 의미하여, 이는 DNA, 단백질, 지 질 등의 분자와 반응하여 손상을 일으킨다(30). Seo와 Kim (31)은 민들레 추출물이 손상된 조골세포의 증식 및 분화를 촉진하고 산화스트레스에 대한 보호하는 효과가 있다고 보 고하였으며, Park 등(32)은 부챗말 추출물이 산화 손상으로 부터 뇌 신경계를 보호하는 효과가 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 갯기름나물 뿌리 추출물이 HepG2 세포의 산화 스트레스를 보호하여 세포 생존율을 증가시킴을 알 수 있었 다.

세포 내 활성산소종 억제 활성

세포 내 산화스트레스에 의해 발생하는 ROS 소거에 대해 갯기름나물 뿌리 추출물의 영향을 알아보았다. HepG2 세포 에 과산화수소로 산화스트레스를 유도한 후 DCF-DA pro- be를 이용하여 ROS에 따른 형광 발색 정도를 측정하였다.

H₂O₂ 처리군의 ROS는 178%로 증가했지만, 갯기름나물 뿌 리 추출물은 125, 250, 500, 1,000 μg/mL에서 농도 의존적 으로 ROS 소거 활성을 보였다(Fig. 2). 특히 1,000 μg/mL의 PJRDE에서는 159.1%로 감소한 반면, PJREE에서는 105.5

%로 감소하여 ROS 소거 활성이 유의적으로 높았다. 미토콘 드리아에서 생성되는 활성산소 종류에는 superoxide radical, hydroxyl radical, peroxyl radical, hydrogen per- oxide가 있다(33). 활성산소의 양이 지나치면 DNA, RNA, protein, 세포 내 소기관 등을 손상시켜 여러 질병을 일으키 기 때문에 활성산소의 소거 활성이 중요한 역할을 지니게

a a

ab ab

b ab b

d c

c

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

ROS formation (% of control) .

125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL

H2O2 (1 mM)

Control -

H2O2 (1 mM) +

PJRDE +

PJREE +

Fig. 2. Intracellular ROS scavenging activity of P. japonicum Thunberg root extracts. The intracellular ROS was detected by the DCF-DA method. Fluorescence of DCF produced by ROS in H2O2 treated HepG2 cells were compared to the control and the cells treated with various concentration of Suaeda japonica Makino extracts in presence of H2O2. Control, group of non- treatment with samples; Positive control, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; PJRDE, P. japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol ex- tract. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly differ- ent at P<0.05 (Fisher’s LSD).

edede decdc e

a

b d

0 20 40 60 80 100 120

Cell viability (% of control) .

125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL

H2O2 (1 mM)

Control -

H2O2 (1 mM) +

PJRDE +

PJREE +

Fig. 1. Cytotoxic effects of P. japonicum Thunberg root extracts for oxidatively stressed HepG2 cells. HepG2 cells were exposed to various concentrations of P. japonicum Thunberg root extracts and hydrogen peroxide (1 mM H2O2) for 24 h. The cell viability was determined by MTT assay. Control, group of non-treatment with samples; Positive control, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; PJRDE, P. japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol extract.

Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-e) above the bars are significantly differ- ent at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Table 4. ORAC and FRAP of P. japonicum Thunberg extracts Samples¹⁾ ORAC

(µmol TE/g)²⁾

FRAP (µmol FeSO4/g)³⁾ PJRDE

PJREE

58.16±2.43^b 133.37±4.36^a

27.28±2.38^b 39.76±1.17^a Ascorbic acid 873.96±4.8 18,586.11±306.90

1)PJRDE: P. japonicum Thunberg root distilled water extract, PJREE: P. japonicum Thunberg root ethanol extract.

2)µmol TE/g: µmol trolox equivalent per sample 1 g.

3)µmol FeSO4/g: µmol iron sulfate (Ⅱ) equivalent per sample 1 g.

Means with different letters (a,b) in the same column are sig- nificantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(6)

된다(33). 본 연구 결과 과도하게 증가한 활성산소를 갯기름 나물 뿌리 추출물 처리로 감소시켜 산화스트레스로부터 보 호할 수 있었고, 이로 인해 HepG2 세포 생존율이 증가할 수 있었던 것으로 생각된다. 또한 활성산소종의 한 종류인 peroxyl radical 소거 활성이 PJRDE보다 PJREE에서 높았 던 ORAC 결과와 유사하게 세포 내 활성산소종 소거 활성도 PJREE에서 유의적으로 높았다.

항산화 효소 활성

HepG2 세포에 과산화수소로 산화스트레스를 유도했을 때 이에 대응하는 항산화 효소의 활성을 알아보기 위해 SOD, CAT, GPx, GR의 활성을 측정하였다. HepG2 세포에 갯기름나물 뿌리 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 전 처리한 후 1 mM H₂O₂로 산화스트레스를 유도하였다. H₂O₂처리한 SOD 효소 활성이 대조군에 비하여 약 64.6%로 감소한 것에 반해 PJRDE, PJREE를 처리한 후 SOD 효소 활성이 73.3%, 85.8%로 H₂O₂ 처리군과 비교하여 유의적으로 증가하였다 (Fig. 3). 산화스트레스에 대한 갯기름나물 뿌리 추출물의 CAT 활성은 Fig. 4와 같다. H₂O₂ 처리한 CAT 효소 활성이 대조군보다 약 39.2%로 감소하였다. PJRDE를 처리한 군에 는 39.3%로 감소하였지만, PJREE에서는 68.7%로 증가하 였다. 물 추출물에서는 H₂O₂처리로 인해 발생하는 산화스 트레스를 감소시키지 못한 반면에 에탄올 추출물에서는 CAT 효소 활성이 유의적으로 증가하여 산화스트레스를 감 소시켰다. Orr와 Sohai(34)의 연구에 의하면 CAT 활성이 증가할수록 수명을 연장하고 노화를 지연시킨다고 보고하 였는데, 본 연구에서 갯기름나물 에탄올 추출물이 CAT 활 성을 증가시켜 HepG2 세포의 노화를 지연시키고 세포 생존 율 증가에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. Lin 등(27)의 연구에서는 쿠마린 계열이 활성산소종을 제거하고 자유라

디칼에 의한 손상으로부터 보호하는 능력을 갖추고 있다고 보고하였다. 갯기름나물 뿌리에는 umbelliferone, peucedanol 등의 쿠마린 성분을 함유하고 있기 때문에 산화스트 레스에 의한 CAT 항산화 효소 활성 저해 억제 효과가 있을 것으로 생각된다(14). 쿠마린은 페놀화합물의 한 종류로 본 연구 결과 총 페놀 함량이 PJRDE보다 PJREE에서 높았고, CAT 활성도 같은 경향을 나타내어 에탄올 추출물에서 산화 스트레스 억제 활성이 높았다. GPx 활성은 H₂O₂처리군에 서 대조군보다 약 58.3%로 감소하였고, PJRDE와 PJREE를 처리한 후에는 각각 76.6%, 90.8%로 유의적으로 증가하여 산화스트레스를 감소시켰다(Fig. 5). H₂O₂와 같은 활성산소 종은 호흡 과정에서 생성되기도 하지만, 외부자극에 의해

0 20 40 60 80 100 120

Control H2O2 PJRWE PJREE

Peucedanum japonium Thunberg extracts (1,000 µg/mL)

SOD activity (% of control) .

Control Positive control PJRDE PJREE a

b c

d

■ Control ▨ Positive control

□ PJRDE ■PJREE

Fig. 3. Effect of P. japonicum Thunberg root extracts on super- oxide dismutase (SOD) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

Control, group of non-treatment with samples; Positive control, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; PJRDE, P.

japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol extract. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

a

c c

b

0 20 40 60 80 100 120

Control H₂O₂ PJRDE PJREE

Peucedanum japonicum thunberg extracts (1,000 µg/mL)

Catalase activity (% of control) ,

Control Positive control PJRDE PJREE

□ PJRDE ■PJREE

Fig. 4. Effect of P. japonicum Thunberg root extracts on catalase (CAT) activity in H2O2-treated HepG2 cells. Control, group of non-treatment with samples; Positive control, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; PJRDE, P. japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol extract. Values are mean±SD (n>3 independent experiments).

Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

b c

d a

0 20 40 60 80 100 120

GPx activity (% of control) .

□ PJRDE ■PJREE

Fig. 5. Effect of P. japonicum Thunberg root extracts on gluta- thione peroxidase (GPx) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol extract. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(7)

세포막에 존재하는 수용체를 통해 생성된다(35). GPx를 통 해 환원형 GSH를 산화형 GSSG로 산화시키는 과정에서 H₂O₂를 제거하게 된다. Choi(36)에 의하면 증가한 활성산 소가 세포의 사멸과 관련이 있다는 연구와 같이 본 연구에서 도 갯기름나물 추출물이 GPx의 활성을 증가시켜 활성산소 를 감소시킬 수 있었으며, 이를 통해 세포 사멸을 억제하여 HepG2 세포생존율 증가에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.

GPx 활성은 H₂O₂처리군에서 대조군보다 약 54%로 감소하 였고, PJRDE와 PJREE를 처리한 후에는 각각 76.6%, 90.8

%로 유의적으로 증가하여 산화스트레스를 감소시켰다(Fig.

5). GR에 의해 산화형 GSSG는 환원형 GSH로 환원되어 인 체 내에서 균형을 이루며 존재하지만, 세포 내의 독성이나 산화 손상이 발생하면 GSSG가 서서히 증가하게 되어 그로 인해 GSH/GSSG의 불균형이 초래하게 되어 결국 세포 사멸 이 일어나게 된다(37). 본 연구에서 H₂O₂처리로 감소하였 던 GR의 활성이 PJRDE(63.6%), PJREE(105.4%)로 인해 증가하여 GSH/GSSG의 불균형으로 발생하는 세포 사멸을 방지하여 HepG2 세포생존율 증가에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다(Fig. 6).

요 약

갯기름나물 뿌리를 물(PJRDE)과 에탄올(PJREE)로 추출하 여 각각의 시료를 전자공여능과 수소공여능 측정을 통한 항 산화 활성과 인간 간암 세포인 HepG2 세포를 이용하여 활 성산소종의 억제 활성과 항산화 효소 활성을 조사하였다.

갯기름나물 뿌리 추출물의 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량 은 PJREE에서 많았고, hydrogen atom transfer(HAT)와 electron transfer(ET)에 의한 항산화 활성도 PJREE에서 높게 나타났다. 갯기름나물 뿌리 추출물은 H₂O₂에 의해 산

화스트레스가 유발된 HepG2 세포의 세포생존율을 증가시 켰다. 특히 PJREE에서 높은 세포생존율과 세포 내 ROS 소 거 활성을 확인할 수 있었다. 산화스트레스가 유도된 HepG2 세포에서 항산화 효소인 SDO, GPx, GR은 PJRDE와 PJREE 처리군에서 증가하였으며, CAT 효소는 PJREE 처리군에서 만 유의하게 증가하였다. 본 연구에서는 갯기름나물 뿌리 추출물의 전자공여능, 수소공여능과 과산화수소를 처리한 HepG2 세포를 이용하여 항산화 활성을 확인하였다. 이러한 항산화 작용을 통해서 간세포의 산화스트레스에 대한 보호 효과가 있다는 점에서 천연 생리활성물질로 갯기름나물 뿌 리를 유용하게 이용할 수 있을 것으로 생각한다.

감사의 글

본 연구는 농림축산식품부 농림축산식품연구센터 지원사업 (과제번호 714001-07-5-SB110)에 의해 수행되었으며 이 에 감사드립니다.

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a

b c

a

0 20 40 60 80 100 120

GR activity (% of control) .

□ PJRDE ■PJREE

Fig. 6. Effect of P. japonicum Thunberg root extracts on gluta- thione reductase (GR) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

japonicum Thunberg root water extract; PJREE, P. japonicum Thunberg root ethanol extract. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

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