저출력 광치료 기술의 생물학적 최신 연구동향

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특집 ▒ 중개 의광학

저출력 광치료 기술은 수천 년에 걸쳐 사용된 방법이 지만 아직까지 정확한 기전이 알려지지 않은 미지의 분 야이며 기술에 비해 이론적 배경이 완전히 정립되지 않 았다. 현재까지 발표된 연구동향 (2011-2016년까지의 Pubmed 기준)을 종합하여 보면 광선효과는 다양한 생리 학적 효과를 동반하고 세포수준의 연구는 목적하는 질환 과 관련된 색소포의 분포와 관련된 광선의 파장에 집중 되어 있다. 예전에는 비목적적 세포내 mitochondria의 활 성화나 ATP, Ca²⁺변화 등에 머물러 있던 연구였지만 지금 은 다양한 파장과 출력을 응용하여 적합한 질환의 세포 연구에 적용하고 그에 수반하는 분자생물학적 변화를 측 정하고 있다. 망막유리 환자의 치료로 제안되는 렌즈와 유리체를 관통하여 탈락된 망막에만 광선이 도달하는 기 술이나 켈로이드 환자의 세포의 증식 없이 이동력만을 활성화시켜 흉터를 남기지 않는 기술, 줄기세포의 증식 및 분화 활성 기술 등에 관한 연구는 광선파장 및 진동수, 세포의 조직적 특성에 의해 결정되며 이에 관련된 신호 전달 기전연구까지 수반된다. 각각의 병증에 적용되는 파장대를 표 1에 정리하였다.

저출력 광치료기술 (LLLT, low level light therapy) 은 적정수준의 빛 에너지를 조사하여 세포의 기능을 자극하 거나 억제함으로써 임상효과를 볼 수 있는 광 치료기술 로 visible 또는 near-infrared 광원을 이용하여 고통 완화,

염증, 부종, wound healing, 조직 괴사 방지 등 적용이 광 범위한 기술이다. 2003년 action spectra concept과 함께 세포 내 mitochondria 의 활성과 특정 파장의 빛 에너지와 의 관계가 알려지면서 LLLT 의 생물학적 유효성이 공식 적으로 이론화되었으며 이후 photobiomodulation (PBM) 개념으로 광 적용에 대한 연구를 세포수준으로 끌어올리 고 있다. LLLT 분야의 핵심은 치료에 필요한 정확한 파 장과 적절한 출력, 그리고 광에너지 양의 제어에 있다. 광 이 조직에 닿으면 투과, 산란, 반사, 흡수가 반드시 일어 나고 생물학적 효과를 가지기 위해서는 반드시 조직에 흡수되어야 한다. 조직이 레이저 광선을 흡수하는 정도

* 단국대학교 의과대학 의과학교실, 단국대학교 의학레이저연구센터

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안진철*

특집 ^▒

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표 1. LED 파장별 질환 치료 적용

Application Wavelength (nm)

Operation mode

Wound healing 660, 850 Pulse

Inflammation 630 - 660 Pulse

Photodynamic therapy (PDT) 405 - 630 CW Photorejuvenation 630 - 660 Pulse Sunburn prevention 660 - 970 Pulse or CW

Post inflammatory hyperpigmentation (PIH)

prevention

870 - 970 Pulse or CW

Scar prevetion 805 - 970 CW

Photopreparation 870 - 970 CW

Photoregulation 660 - 850 Pulse

UV-free phototherapy 405 - 850 Pulse or CW

로 인해 다양해지면서 구조, 출력, 크기, 파장대 등이 변 화되고 있어 추후에는 이 부분의 융합적 연구가 많이 요 구 되 어 질 것 으 로 보 인 다 . 레 이 저 는 단 일 파 장 (monochromaric), 동일한 위상과 파동의 균일성 (coherent), 직진성 (collimated)의 특성을 가지고 있는데 비해 LED 는 레이저 광원에 비하여 다소 넓은 출력 스펙 트럼을 가지는 비간섭성 (non-coherent) 이고 비평행광 (non-coillimated) 이어서 넓은 범위의 조사가 가능한 장 점을 가지고 있으며 다색 및 다단계 밝기 제어, 소형화, 높은 광전환 효율이 가능하므로 기능 확장이 얼마든지 가능한 광원이다. LED 칩의 광 출력은 파장에 따라 차이 가 존재하는데 400nm 대역의 UV 영역은 광출력이 20 mW, 850-90 0nm 대역은 10mW 이상, 상처치유 및 통증 완화에 효과가 있는 600-700nm 대역의 경우 평균 40 mW 까지 개발되어 있으므로 치료효율을 극대화 할 수 있는 LED 단위 칩 개발이 중요하다.

레이저 광의료기기의 세계시장은 현재 안과 수술용, 피부미용 시장이 대부분을 차지하였으나 치과 및 수의학 용 레이저기기의 큰 성장이 예상되고 최근 연구동향을 살펴보면 피부과, 성형외과 영역에서 가정의학과, 산부 인과, 비뇨기과, 치과, 안과, 이비인후과, 마취통증의학으 로 확산되고 있는 추세이다. 2014년 한국특허정보원 특 허정보진흥센터는 광치료 (진단 제외) 유망기술 및 R&D 방향제안으로 망막질환 (황반변성)/노안치료, 제모기술,

당 분야에 적용될 수 있다.

단국대학교 의과대학에서는 2001년부터 광 조사에 의 한 생물학적 효과를 연구해오고 있다. 기초연구로는 파 장별, 세기별 세포 기능 향상 혹은 생리활성 조절효과를 분석하고 있고, 임상적으로는 각 질환에 따른 파장별 효 과를 꾸준히 연구하고 있다. 광 조사에 의한 세포초기 반 응은 ATP와 칼슘이온의 증가가 대표적으로 알려져 있는 데 본 연구팀이 시간대 별로 분석한 결과 10-15분 이내에 ATP와 칼슘이온이 증가하고 이때 발생한 에너지는 mitochondria potential 증가, second messenger (cAMP, cGMP, Heatshock protein 등)의 활성화 및 ROS 발생량을 조절할 수 있음을 발견하였다. 특히 ROS 에 대한 조절이 흥미로운데 성체줄기세포 분화 초기나 정상상태의 섬유 아세포 (진피층) 에서의 광조사는 ROS를 증가시켜 분화, 이동, 증식을 유도하지만 손상상태에서는 ROS의 양을 감소시켜 항산화효과와 염증완화 효과를 유도할 수 있음 을 확인할 수 있었다. 또한, mitochondria energy metabolism 에 관여하는 RNA array 분석 결과 mitochondria potential 강화와 관련된 효소 (NADH dehydrogenase oxidase, ATP synthase)의 활성화를 유도하 는 것이 관찰되었다. 따라서 본 연구팀에서는 광조사는 파장별로 세포 내 기능을 다르게 유도할 수 있고 세포종 류 혹은 상태에 따라 다르게 조절 할 수 있는 것으로 보고 파장별, 세포별로 나누어 다양한 생리활성 효과를 연구 하고 있다. 본 연구팀에서 수행했던 그리고 진행 중인 몇 가지 연구 결과를 아래에 나열하였다.

1. 성체줄기세포와 저출력레이저를 이용한 상처치유 (wound healing) 효과

본 연구팀은 850nm LED와 골수유래 성체줄기세포를 이용하여 피부조직 괴사 억제 및 상처치유효과를 연구한 바 있다. 쥐의 등 부분에 가로 3cm 세로 1.5cm 의 절개를 내고 skin flap 을 실시하였다. 흰쥐의 대퇴부에서 추출한 골수유래 성체 줄기세포를 primary culture 하고 stemness 표 2. 조직 세포 구성물의 선택적 흡수파장

Component Wavelength (nm)

Nucleic acid 260-280

Protein 280-300

Hemoglobin 400, 542, 554, 576

Melanin 400-800

Water 1400-10000

Lipid 900-1400

Collagen (type I, II) 400-500

Flavins 420-500

Cytochrome 620-900

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(분화가능성) 를 확인하였다. 실험군은 골수유래 성체줄 기세포만 주입한 그룹, 광조사만 실시한 그룹, 성체줄기 세포 주입과 광조사를 같이 실시한 그룹으로 나누어 관 찰하였다. 성체줄기세포와 LED광조사를 같이 실시한 그 룹의 상처치유율이 가장 높았고 병리분석 결과 염증으로 인한 조직괴사가 가장 적고 (H&E), 콜라젠 등의 조직간 결합능이 증가하였으며 (Masson-Trichome staining), 내 피 혈관 생성이 월등하게 높아지는 것 (PECAM-1 staining) 을 관찰 할 수 있었다 (그림 1).

2. 세포 초기 부착능에 대한 광조사 효과

이러한 세포분화 및 증식은 세포이식 후 초기 부착능이 상당히 중요한데 이에 관여 하는 focal adhesion kinase의 광조사 후 발현 을 조사하였다. 그림 2 와 같이 600nm 이상 의 파장대 광조사는 세포의 초기부착을 돕 는 효과를 보였고 특히 850nm 에서 가장 유 의적으로 관찰되었다.

3. 광조사에 의해 발현되는 단백질 profiling

증식, 분화, 에너지 메타볼리즘이 광조사 에 의해 조절될 수 있는지, 조절이 가능하다 면 어떠한 단백질이 형성되는지 알아보기 위하여 RNA microarray analysis 를 시행하 였다. 줄기세포에 660nm의 LED 조사 후 RNA를 분리하고 quantitative PCR 분석을 실시하였다 (그림 3). 세포주기 조절과 분화 에 관련된 transforming growth factor-beta (TGF-b)와 cytochrome C, GTPase, Rho family 등이 크게 증가하였고 세포신호전달 의 중요 인자인 heat shock protein (HSP) family 등도 유의하게 증가하였다. 특히 세 포고사 (apoptosis) 방해인자로 알려진 HSP 70과 HSP 60의 발현이 의미 있었으며 세포

손상으로 신호전달의 기형이 발생할 때도 광조사가 이를 적절히 조절할 수 있음을 발견하였다.

세포손상으로 정확한 신호전달이 불가능할 때 HSP 발 현을 통해 단백질 이상형성을 바로 잡고 s e c o n d messenger 의 신호를 증폭시키는 것으로 가정하고 여러 가지 이온채널 불균형, 독성물질의 노출 등의 세포손상 환경을 만들어 질환 실험을 실험해보았다.

그림 1. 850nm LED와 stem cell 을 이용한 wound healing

그림 2. 줄기세포 부착능에 대한 파장대별 LED 효능 실험

성체 줄기세포의 초기 부착에 관여하는 focal adhesion kinase (붉은색) 면역염색 결과 600nm 이상의 파장대 광조사는 세포의 초기 부착능을 향상시키고 특히 850nm 의 파장이 유효하였다.

광조사는 세포막 GPCR/Rho family 의 활성을 통해 이동 성 및 사멸방지에 기여하는 것으로 관찰되었다 (그림 4).

5. 광조사에 의한 heat shock protein (HSP) 의 조절 연구

열충격단백질로 발견되었지만 열에 의해서만 발현되지

조를 취하지 않은 불량 단백질에 결합하여 그들의 분자 간 회합형성을 방지하고 재생을 촉진하는 기능을 갖고 있다.

이 때문에 HSP를 대량으로 축적하고 있는 세포는 극한 상 황에 대한 저항성을 가질 수 있다. 이러한 HSP 의 chaperone 기능은 평상시에도 합성 직후의 미성숙한 단백 질에도 결합하여 그들의 고차구조형성, 세포 내 수송, 세 포 소기관의 막투과 등에서 중요한 역할을 맡고 있다. 따 라서 HSP 는 완벽한 상태의 세포가 생존하기 위해서도 필 수적인 것으로 알려져 있다. HSP 의 또 하나 의 중요한 기능은 변성 단백질을 분해한다 는 것이다. 유비퀴논도 대표적인 HSP 이지 만 변성단백질에 공유 결합하여 proteasome 분해 지표로 작용하고 있다. 이러한 HSP 이 광조사에 의해 조절되는지 확인해보기 위해 사람의 정상섬유아세포에 LED 조사 후 HSP 의 발현을 확인해 보았다. HSP 발현을 형광 분석한 결과 660 nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세 포사멸) 발현에, 850 nm 는 HSP 60, 90 (세포 사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었 다 (그림 5).

또한 파장별로 HSP 발현의 최대치가 약 간씩 틀렸는데 HSP 60 의 경우 660nm 조사 후 15분, 850nm 조사 후 30분에 최대였으며 HSP 90은 15분 이후부터 60분까지 발현이 유지되는 것을 관찰 할 수 있었다.

6. 비분화성 갑상선 암세포에 대한 광조사 연구

광조사에 의한 갑상선 암세포의 공격성 증 가는 광역학 치료에 대한 연구 중 우연히 발 견하였다. 비분화성 갑상선 암세포는 발병 율은 그다지 높지 않지만 치사율이 높은 갑 상선암이다. 비분화성이기 때문에 항암치료

그림 3. 줄기세포를 이용한 LED 조사 후 신호전달 기전 탐색

성체 줄기세포에 660 nm LED 를 조사하고 30분 뒤 RNA를 추출하였다. Qiagen 사의 heman RNA profiler kit 를 이용하여 광조사에 의해 조절되는 단백질을 탐색한 결과 세포손상을 유도하는 apoptosis, inflammation 등의 발현인자는 감소되고 proliferation, differentiation, mitochondria energy metabolism, migration 등은 증가하는 것으로 나타났다.

그림 4. 각막세포를 이용한 wound healing, migration, proliferation 신호전달기전 분석 사람의 각막세포에 wound 를 주고 광조사후 세포가 이동하여 메꿔지는 정도를 정량분석한 결과 740nm 에서 가장 이동능이 증가하는 것을 발견하였으며 이에 관여하는 단백질은 Rho family 로 밝혀내었다.

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에 내성을 보이며 증식이 폭발적으로 일어나 전이되기 쉬 운 특성을 가지고 있다. 본 연구팀은 비분화성 갑상선 암 의 광역학 치료 동물모델 구축 중에 이 현상을 발견하게

되었다. 그림 6과 같이 쥐의 갑상선에 비분화성 갑상선 암 세포를 주입하고 광역학치료 대조군 중의 하나로 630nm 광조사군만 설정하였다. 4 주후, 광조사만 실시한 군의 갑 상선암세포가 현저하게 증가하는 것을 발견하고 갑상선 암조직을 채취하여 병리분석을 실시하였다. 이 암조직은 광조사 후 macrophage 의 폭발적으로 증가하고 허혈이 나 타나 급성염증소견을 보였고 면역화학염색에서는 암전 이 요소인 저산소증 유발인자 (Hypoxia inducible factor 1, HIF-1)와 혈관내피 세포 성장인자 (Vessel endothelial growth factor, VEGF) 의 발현이 급격히 증가하는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 갑상선 암발현 가능성을 가지고 있는 환자의 구강궤양 개선을 위한 저출력치료가 위험할 수 있음을 증명하였다.

7. 독성노출에 손상된 세포의 광조사 효과 연구

신경세포에 독성물질인 ouabain을 처리하고 LED조사 로 신경세포 보호효과를 관찰해보았다. Ouabain 은 Src tyrosine phosphatase 를 증가시켜 Na-K ATPase 활성을 억

제하여 이온 펌프의 수송 affinity를 떨어트 리는 것으로 알려져 있다. 신경세포를 ouabain 에 2 시간 동안 노출시킨 뒤 광조사 를 실시하고 src 와 Na-K ATpase 의 활성을 관찰한 결과 광조사는 세포막 이온채널의 교란을 억제하고 src의 발현을 조절하여 세 포 내 스트레스를 완화시킬 수 있음을 증명 하였다 (그림 7).

8. 광조사의 백내장 보호효과 연구

어린 흰쥐에 sodium selenite를 주입하여 백내장을 유도하고 동시에 광조사를 실시 하였다. 백내장 억제 및 예방효과를 예비 실 험한 결과 740nm 에서 가능성이 있음을 발 견하였고 현재 광조사의 백내장 보호기전 을 연구 중에 있다 (그림 8).

지금까지 살펴본 바와 같이 본 연구팀에

그림 5. 사람의 섬유아세포를 이용한 LED 파장별 HSP 발현 분석 사람의 섬유아세포에 광조사를 실시한 후 HSP 발현을 형광염색하여 분석하였다. 660nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세포사멸) 발현에, 850nm 는 HSP 60, 90 (세포사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다.

그림 6. 암세포의 LED 조사 후 공격성 분석

사람의 비분화성 암세포에 레이저를 조사한 후 4 주 동안 관찰 한 결과 폭발적으로 갑상선 암의 크기가 커지는 것을 관찰 할 수 있었고 암 공격성의 마커인 염증인자분석 (상단우측), 저산소인자 (HIF-1a, 하단좌측), 혈관형성인자 (VEGF, 하단우측) 가 광조사후 상당히 증가되어있음을 발견하였다.

식), differentiation (분화) 등으로 분류하고 다양한 분자생물학기법과 비임상시험을 통 해 광 조사가 GPCR(G-protein coupled receptor)에 관련하여 각 세포의 polarity에 기여할 것으로 생각하고 있다. GPCR은 여 러 가지 자극에 반응하는 수용체 중 하나로 빛에 의한 자극은 주로 이 수용체와 이온수 용체들을 통해 여러 가지 반응을 유도할 수 있을 것으로 가정하고 있다.

저출력 광 조사는 파장대별로 특이한 효과 가 있으며 이러한 파장대의 특성을 잘 활용 하면 각막손상 회복이나 백내장 예방, 이온 채널의 변화로 인한 세포사멸 방지, 줄기세 포의 분화, 산화질소 조절에 따른 염증완화 신호전달 기전 등에 효과가 있을 것으로 예 상하고 있다. 그 동안의 본 연구팀의 LED 를 이용한 연구결과 및 성과를 간단히 표 3에 정리하였다.

그림 7. 신경세포의 급성독성 반응에 대한 850 nm LED 보호효과 분석

신경세포를 ouabain 에 두 시간동안 노출시킨 후 광조사를 실시한 결과 광조사는 ouabain 의 주요경로인 src를 비활성화시켜 이온채널의 교란을 억제하여 Na-pump 의 항상성을 유지할 수 있음을 밝혀내었다.

그림 8. 740nm LED의 백내장 예방 효과 pilot study

표 3. 단국대학교 의과대학 안진철 교수팀의 PBM 관련 연구분야 및 연구성과

Physiological transduction pathway Materials

Wound healing Fibroblast, endothelieal cell and stem cell 850nm LED Inflammation & angiogenesis Macrophage and endotheial cell 640, 660, 740, 850nm LED

Photodynamic therapy (PDT) Glioma, stomach cancer, head & neck, thyroid cancer, lung cancer, ovary cancer, colorectal cancer

Cancer Autophage and aggressiveness 660, 850nm LED

Anti-biotics Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 400nm area LED

Differentiation Bone marrow derived stem cell and umbilical cord derived 430, 540, 660, 740, 850nm LED

G-protein coupled recpetor (GPCR) Corneal epithelial, Cataract disease, acute inflammation, and nerve cell 430, 540, 660, 740, 850nm LED

Transforming growth factor-beta (TGF-β) Stem cell differentiation and cancer autophage 430, 540, 660, 740, 850nm LED

Heat shock protein (HSP) Fibrobalst and epithelail cell 430, 540, 660, 740, 850nm LED

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약 력

안진철

2006년 단국대학교 의학레이저협동과정 의학과에 서 박사학위를 취득하여, 2006년 3월부터 2013년 9월까지 단국대학교 의학레이저연구센터 연구조 교수로 재직하였으며, 현재는 동 대학교 의과대학 의과학교실 주임교수로 재직하고 있다. 주요 연구 분야는 Photobiology, Low level laser therapy(LLLT), Medical Laser(의학 레이저), Photodynamic therapy(PDT) 이다.

E.mail : jcahn@dankook.ac.kr