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손상 모발을 위한 EPA 함유 샴푸 개발
이보름1·이옥상1·강태진2·임성실1,#
1충북대학교 약학대학 임상약학실, 충청북도 청주시 흥덕구 성봉로410(개신동)
2삼육대학교 약학대학, 서울특별시 노원구 화랑로 815
(2011 년 7월 11일 접수·2011년 8월 17일 수정·2011년 8월 18일 승인)
Development of Shampoo Formulated by EPA for the Damaged Hair
Bo Reum Lee 1 , Ok Sang Lee 1 , Tae Jin Kang 2 , and Sung Cil Lim 1,#
1Clinical Pharmacy, College of Pharmacy, Chungbuk National University, Sungbongno 410, Cheongju, 361-763 South Korea
2Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Sahmyook University, Hwarangno 315, Seoul, Korea
(Received July 11, 2011 ·Revised August 17, 2011·Accepted August 18, 2011)
Omega-3 fatty acids are a specific type of unsaturated fat that the body cannot manufacture on its own, so they must be obtained from food which is essential fatty acids (EFAs). Omega-3 fatty acids consist of three types which are a- Linolenic Acid (ALA), Eicosapentaenoic (ELA), and Docosahexaenoic Acid (DHA). Especially, EFAs help to prevent skin and hair drying, acne, eczema, prevention from allergies, brittle nails, rashes, and tiny lumps. The aim of this study is to investigate improvement and protection for hair damaged by chemical treatment with omega-3 formulated shampoo. We selected virgin hair sample and divided into two groups for bleaching once and three times and then damaged hair by changing the number of hair bleaching (twice with interval of 15 minutes). Each bleached hair was treated by five different kinds of shampoo (Control, Horse shampoo, DHA shampoo, EPA shampoo, Omega-3 sham- poo mixture). Apart from this, EPA/DHA 2, 5, 8, 10 and 12% shampoo were prepared and treated to hair for compar- ing rate of progress in damaged hair. To quantify improved condition of damaged hair, we performed Scanning Electron Microscope (SEM) for ultrastructure of damaged hair fraction, measurement of thickness change and BCA Protein Assay for recovery rate of damaged hair. The moisture in hair was measured by Thermal analysis machine. In results, we observed the particle of hair surface damaged by bleaching treatment were well improved with treatment with EPA and DHA shampoo. Also, quantity of protein was lowered with higher concentration of EPA & DHA i.e., 8 and 12 % then compared with horse oil shampoo in three times treatment group. It shows that bleached hair have been recovered by treating rapidly and get protective coat. In conclusion, EPA and DHA shampoo improved damaged hair, especially with EPA / DHA 12% shampoo. Also, EPA shampoo could protect the damaged hair depending on increasing concen- tration of EPA. Therefore, we conclude omega-3 shampoo could make damaged hair protect and get healthy hair envi- ronment.
□ Key words - Omega-3 fatty acids. DHA, EPA, hair treatment, bleaching
Omega-3 불포화지방산(PUFAs; poly unsaturated fatty acids) 은 둘 이상의 이중결합을 지닌 장쇄 지방산이다. Omega-3 불 포화 지방은 필수 지방아미노산(Essential Fatty acids; EPAs) 으로써, 피부와 모발의 성장, 콜레스테롤의 메커니즘 및 재 생활성 등에 필요한 요소이다. 최근 이 지방산의 치료학적 적용과 음식 및 영양학적이 적용에 대한 가능성이 알려지면 서 많은 분야에서 이용되어지고 있다. 그러나 이러한 필수
지방산(EPAs)들은 우리 몸 안에서는 생산되지 않기 때문에 음식으로써 섭취되어야한다.1) Omega-3 불포화 지방산의 주 요 식이 원천으로는 어류, 해조류, 특정 견과류 및 식물성 기 름에 포함되어있고 Omega-3 불포화 지방산의 가장 대표적인 Eicosapentaenoic acid (EPA; C20:5n-3)과 Docosahexaenoic acid (DHA; C22:6n-3)는 참치(Tuna), 연어(Salmon), 고등어 (Macherel), 청어 (Herring) 등에 높은 함유율을 나타낸다.2)
Omega-3 불포화 지방산, 즉 EPA와 DHA는 심장질환 (Heart disease), 높은 콜레스테롤 수치(High cholesterol), 고 혈압(Hypertension), 관절염(Arthritis), 요통(Back pain), 골다 공증(Osteoporosis), 건선(Psoriasis), 루퍼스(Lupus), Crohn's
Correspondence to : 임성실
충북대학교 약학대학 임상약학실, 충청북도 청주시 흥덕구 성봉로410(개신동)
Tel: +82-43-261-3590, Fax: +82-43-261-2732
E-mail: [email protected]
disease, Attention-dificity /hyperactivity disorder (ADHD), 눈 건조(Dry eyes) 등 넓은 범위의 질병에서 이용되고 있다.3)4) 하여 본 논문에서는 Omega-3 불포화지방산의 인체 내에서 의 재성활성이 모발에서도 적용되는지 평가해보고자 한다.
사람의 모발은 감각작용, 체온유지, 두피보호 덩의 기본적 인 인체보호의 역할에서 출발하여, ‘美’와 개성 표현의 수단 으로 발전해 왔다. 초기 미용 산업은 모발의 모양과 색의 변 화라는 단순한 범위 내에서 발전되어 왔고 사람들의 다양한 욕구를 만족하기 위해 무분별한 화학처리와 방법이 적용되었 으며 이로 인해 모발의 손상과 두피 질병이라는 심각한 결 과를 초래하였다.5) 모발손상의 원인은 화학처리 및 환경적 요인 등 매우 다양한 원인들이 있으며 이것은 모발뿐 아니 라 두피까지도 손상시키는 결과를 야기하였다(Figure 1). 화 학적 시술에 의한 손상은 주로 모간의 외부를 둘러쌓고 있 는 모표피와 모피질에 손상을 주게 되고, 손상된 모발은 자 기 회복력이 없기 때문에 정상모는 손상되지 않도록 주의해 야 하며, 손상모는 더 이상 진행되지 않도록 보호 하는 것이 중요하다.6)한동안 단순히 스타일 만들기에 치중했다면 요즘 은 Hair care(헤어케어)의 비중이 점차 커져가고 있다. 화학 처리 전, 후에 샴푸 및 트리트먼트의 사용을 통해 모발 손상 을 최소화하고 손상된 모발의 회복을 위한 많은 방법들이 연구되고 있다.7)모발 제품들은 스타일링과 세정기능을 하는 정도의 단순화 제품에서 모발과 두피 상태에 따라 선택되도 록 전문화되고 세분화 되었다. 특히, 모발에 대한 모세포의 세포분열과 성장 그리고 모발 미세구조에 대한 물리적, 화학 적 특성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.8) 그리하여, 현시대에는 세정제로서의 목적만을 가지던 예전과는 달리, 샴푸제는 계면활성제와 같은 기본적인 성분 외에도 각종 첨
가제들이 개발되어 비듬방지, 모발의 색상보호 등의 특수효 과를 지닌 샴푸들도 개발되고 있다. 또한 제품의 기능도 모 이스쳐라이징 효과(Moisturizing effect)와 컨디셔닝 효과 (Conditioning effect)등을 갖춘 세분화 된 것들도 출시되고 있다. 최근에는 첨가제에 대한 화학부작용을 방지하기 위한 천연물을 이용한 천연샴푸들도 많이 나오고 있다. 한 예로, 마유는 포함한 지방산은 다른 동물성 지방과는 다르게 체내 에서 만들 수 없는 세포막의 중요한 구성요소이다. 마유는 얇은 유막을 형성하여 외부로부터 피부를 보호하며 수분의 증발을 막아주며 항균 작용을 하며 혈액 순환을 원활히 함으 로서 마유 스킨제품 또는 샴푸와 같은 페어제품으로 활용하 였을 때 피부환경의 개선에 도움을 준다(특허 10-0893648).
또, 마유는 체내에서 세포막을 형성하고 콜레스테롤을 제거하 는 다량의 불포화지방산을 함유하고 있는 것에서 Omega-3 불포화 지방산과 비슷한 면을 가지고 있다.
이에 본 연구에서는 Omega-3도 마유처럼 샴푸로 활용하 였을 시, 두피환경을 향상시키고 모발의 손상의 개선 및 방 지를 기대해 볼 수 있을 것으로 생각된다. 오메가-3 지방을 함유하는 유지 중 가장 대표적 유지인 DHA와 EPA 단일성 분을 가지고 샴푸로 만들어서 화학적 시술로 인해 손상된 모발의 보호효과에 대하여 평가하고 샴푸를 개발하고자 하였 다. DHA는 22개의 탄소사슬에 6개의 이중결합을, EPA는 20개의 탄소사슬에 5개의 이중결합을 가진 천연물질이다. 손 상모발에 직접 EPA 혹은 DHA 로 만든 샴푸로 처리하여 회 복정도를 표면적으로 관찰하고 모발성분의 변화를 측정하여 Omega-3 불포화 지방산의 샴푸로서의 이용가능성을 평가하 고자 한다. 또한 현재 이용 가능한 omega-3는 단일성분이 아닌 Mixture contents가 상용되고 있는 것으로 조사되어, 본
Fig. 1. Major Factors for Damage to Hair.
논문에서는 오메가-3 지방을 함유하는 유지 중 가장 대표적 유지인 DHA 혹은 EPA 단일성분을 가지고 샴푸로 제조하여 화학적 시술로 인해 손상된 모발의 보호효과에 대하여 평가 하고 기능성 샴푸로서 개발하고자 하였다.
연구 방법
시약
세포 배양에 사용한 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), RPMI 1640 midum, fetal bovine serum은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사 용하였다. 3 - [4,5 - dimetylthiazol - 2 - yl ] - 2.5 - diphenyltetrazolium bromide MTT) 정량에 사용한 시약 및 Eicosapentaenoic acid (EPA)와 Docosahexaenoic (DHA)와 단 백질 정량에 사용된 BCA kit는 Sigma Chemical에서 구입하 여 사용하였다.
모발 시료
본 연구에 사용된 모발시료는 2009년 08월에 충북 청주의 한 미용실에서 동일인의 건강모발(Virgin hair)을 충분히 얻 어서 준비하였다. 모발은 끝부분에서 15~20 cm의 길이로 잘 라서 채취하였다. 분석용 전자저울로 약 0.2 g을 측정한 후 모근방향이 일정하게 하여 1 cm 실리콘으로 고정시킨 후 군 별 모발시료로 나누어 제작한다. 모발 시료의 오염물질이 묻 지 않도록 증류수로 3회 헹군 후 상온에서 자연 건조하였다.
탈색
본 실험에서는 동일한 손상 모발을 얻기 위하여 건강모발 (Virgin hair)에 대해 탈색제(국내 A사)를 사용하여 일정한 시간간격을 두고 탈색을 유도하여 동일손상을 주었다. 사용된 탈색제는 청주지역의 G 미용사에서 구입하여 시술하였다. 실 험 전, 이물질 제거를 위해 증류수로 세정이 완료된 모발 시 료 2.0 g에 대하여 준비된 탈색제의 제 1제(과황산모늄- 모발 탈색제의 혼합첨가물: 높은 알칼리 성분을 유지하여 큐티클 층을 급속도로 팽윤시켜 과산화수소가 모피질층으로의 확산 촉진)와 제 2제(과산화수소; H2O2 35%- 모발 탈색제: 멜라닌 색소의 산화작용)를 1:3으로 혼합하여 모발에 도포하고 일정 시간(Interval time: 15 minutes) 경과 후 3차 증류수(500 ml)로 3회 헹구어 자연 건조하였다. 이와 같은 방법으로 1-5회 탈색 하여 각 모발에 대한 손상 정도를 조절하였으며, 실제 샴푸처 리는 1, 3회 탈색한 모발 2.0 g에 대하여 샴푸 처리하였다.
샴푸 제조
정제수 44.5 g에 Polyquater 0.5 g을 넣고 교반시켜준 후, SLES 40 g, Cocamide Cocamidopropyl Betaine 10 g을 넣고 잘 교반해준 후, Omega-3 불포화지방산인 EPA와 DHA를 각각 2, 5, 8, 10, 12%가 되도록 첨가하였다. 완성된 샴푸는
24시간동안 첨가물이 잘 섞이도록 안정화시킨다. 보관 시에 는 직사광선을 피하여 서늘한 곳에 보관한다.
샴푸 처리
샴푸처리는 Control shampoo, DHA & EPA shampoo (each 2, 5, 8, 10, 12%), Horse oil shampoo, Omega-3 shampoo 를 가지고 모발 2.0 g당 1 ml를 덜어서 거품낸 후 주물러서 세정하였다(약 50회). 세정 후 세정액이 맑은 물이 유지될 때 까지 흐르는 증류수로 수세하여 자연 건조하였다. 세정기간 은 1일 1회씩 30일간과 연속 30회 샴푸처리 하였다.
세포독성 측정: MTT Assay (1) 세포배양
정상세포에 대한 독성 측정을 위해 한국 세포주 은행에서 분양받은 NIH3T3 섬유모세포는 DMEM 배지를 사용하였다.
세포배양 온도는 37oC, 습도 95%, 탄산가스 5%의 배양기 (CO2 incubator, 제조사)를 사용하였다. 세포배양 후 flask의 세포를 0.25% trypsin-EDTA로 처리하여 분리한 후 세포독성 측정을 하였다.
(2) MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2.5-diphenyltetrazolium bromide) assay
NIH3T3 섬유모 세포 배양용기(96 well)에 넣은 후 (5×104cells/ml), DHA, EPA를 각 농도별(10, 20, 50, 100, 200µM)로 50 µl 첨가하고 각각 6, 12, 24, 48시간동안 배양하 였다. 3 - [ 4,5 - dimetylthiazol - 2 - yl ] - 2.5 - diphenyltetrazolium bromide (MTT)시약을 20 µl/well 씩 첨가 하고 2시간 동안 반응시킨 후, Centrifuge를 10분간 2000 rpm 처리 후, 120 µl/well를 빼내고 DPBS를 100 µl를 첨가한 후, centrifuge를 다시 10분간 2000 rpm으로 돌린 후, 200 µl를 다 시 빼냈다. Isobutanol 15 ml + HCl 50 µl를 100 µl/well 넣고 complex 결합을 위해 MTT formazan 을 용해하여 흡광도는 ELISA reader 로 MTT의 흡광도(570 nm)를 측정하였다.
모발의 형태학적 변화 관찰 및 두께 측정: SEM method 각 샴푸 처리한 모발에 대하여 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30회 처리한 모발시료의 모표피와 모피질의 변화를 알아보기 위해 SEM (Scanning Electron Microscope, S-2500C, Hitachi, German)을 이용하여 관찰하였다. 모발시료 10가닥을 선택하 여 2 cm 정도로 잘라서 SEM의 샘플 받침대(silver fasten)에 고정시킨다. 고정시킨 시료는 진공상태에서 130초간의 백금 코팅을 2번의 전처리를 거친 후, 주사전자 현미경을 이용하 여 모발의 표면을 관찰하고, 굵기를 측정하였다. 배율은
×500배로 관찰하였다.
모발의 단백질량 측정: BCA Protein assay
BCA에 CuSO4 5%용액을 넣어 섞어서 발색제(BCA : CuSO4= 50 : 1)를 BSA 0, 1 2, 4, 8, 19, 20 µg이 든 microtube에
1.5 ml 씩 넣는다. 모발 시료를 2 cm씩 5가닥를 넣은 microtube 에도 발색제를 1.5 ml씩 넣어준 후 voltexing하여 Water beth(34.7oC)에서 30분간 담가두었다. Cuvette에 각각 옮겨 담은 후, 한 방향으로 cuvette을 분광기에 넣어 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 처음 샘플은 증류수를 넣어 측정하여 0으로 calibration 한 다음에 농도를 측정하였다.
모발 내의 수분측정: Thermal analysis method
샴푸처리한 모발의 수분함량 변화를 측정하기 위하여 건강 모발과 농도별 DHA shampoo (8, 10, 12%), EPA shampoo
(8, 10, 12%), Horse oil shampoo, Omega-3 shampoo로 각각 샴푸 처리한 모발시료를 기름종이(Oil paper)위에 1 cm 미만 의 길이로 잘라서 중량을 측정한 다음(약 2.0 mg), 열분석용 sample holder에 장착하였다. 모발 시료에 대한 열분석은 sample holder와 reference holder에 열을 동시에 가하면서 표준물질과 상대 비교하였다. 표준물질은 N2를 사용하였다.
표준물질과 모발과의 무게 차이를 컴퓨터 프로그램을 이용하 여 0점(0 point)까지 정확히 미세 조정한 다음, 열분석기 (Thermal Analyzer: TA Instruments, SDT2960)를 사용하여 컴 퓨터 프로그램 상에서 모발의 가열계획 (Heating schedule)을
Table 1. Questionnaire
<Condition of hair>
1. The length of hair?
1) very short 2) short 3) middle 4) long 5) very long 2. The density of hair?
1) very less 2) less 3) middle 4) many 5) very many 3. The Thickness of hair?
1) very thin 2) thin 3) middle 4) thick 5) very thick 4. The type of hair?
1) straight hair 2) tend to straight hair 3) naturally curly hair 4) very naturally curly hair 5. Whether the stain?
1)natural hair 2) dyed hair 3) coat hair 4) bleach hair 5) 2 or more hair treatment 6. Degree of hair damage?
1) healthy hair 2) tend to healthy hair
3) middle 4) little damage to the hair 5) very damage to the hair 7. The type of hair?
1) dry 2) tend to dry 3) normalcy 4) tend to oily 5) oily 8. The state of your scalp?
1) healthy 2) is sensitive 3) is wound 4) hair loss is serious 9. The type of the scalp?
1) dry 2) sensitivity 3) normalcy 4) oily 5) dandruff 6) Etc.
10. Day and the number of shampoo?
1) more than twice a day 2) once a day 3) 4~5 times a week 4) 2~3 times a week 11. How to dry your hair after shampoo?
1) natural dry 2) use the dryer and tools 3) go to bed without drying
<Evaluation of use shampoo>
-Choose one answers following the each questions
1) very good 2) good 3) middle 4) bed 5) very bed 12. The scent of shampoo?
13. The viscosity of shampoo?
14. The viscosity of shampoo you use?
15. The occurrence of bubbles using shampoo?
16. The feeling of shampoo?
17. Feel when rinsing the hair? 1) very tender 2) tender 3) middle 4) stiff 5) very stiff 18. The detergency of shampoo?
19. The moisture of shampoo?
20. Day towels feel after?
21. Completely dry feel after?
22. After drying for the hair shine?
23. After shampoo, it is easy to comb out?
<Patients' characteristics>
25. sex? 1) man 2) woman 26. Age? years 27. Job?
1) employees 2) high school students 3) (graduate) students 4) housewife 5) Etc.
28. Timing and type of hair treatment perm ex) one month ago, Decolorization
분당 5oC로 설정 후 500oC까지 상승시키면서 모발의 무게 감량비를 측정하였다.
샴푸 사용성 평가 (1) 연구방법
본 연구는 Control shampoo와 가장 효과가 판단되어진 EPA 12% 샴푸를 가지고 각 3회 사용한 결과에 대한 평가 를 얻어 샴푸의 사용성에 대해 평가하고자 하였다. 자료 수 집방법은 총 50명 대한 설문조사를 통하여 얻었다. 각 한 명 당 10 ml의 샴푸를 제공하였고, 하루 1회 3일간 실시하도록 하였고, 쓰고 난 후 바로 설문을 작성할 수 있도록 충분히 설명하였다. 샴푸의 평가 목록으로는 Omega-3 샴푸의 향, 점도, 기포 생성력의 적정성, 질(느낌), 헹굼 후의 모발의 질 (느낌), 세정력, 보습력, 타올 드라이 후의 질(느낌), 완전 건 조 후의 느낌, 모발의 광택, 빗질의 용이성을 각 항목에 포 함시켜서 작성하도록 하였다. 답안은 1~5번까지의 문항으로 구성 되어있다(Table 1).
(2) 평가방법
본 연구는 Omega-3 불포화 지방산을 첨가한 샴푸를 사용 한 후 사용성에 대한 만족도를 측정하고자 각 문항에 대한 평균을 구하였다. 평균값이 1에 가까울수록 사용성이 긍정적 인 것으로 5에 가까울수록 부정적인 것으로 평가하였다.
통계 처리
분석은 SPSS 12K (Window version)를 이용하였으며, 분 석방법으로는 Student t-test 및 ANOVA one way analysis를 이용하였다. Significant value는 p < 0.05로 하였다.
연구 결과
EPA 및 DHA의 섬유모세포(NIH3T3 cell; fibroblast cell)에 대한 세포독성
정상 세포주인 NIH3T3 섬유모 세포에 Omega-3 불포화 지방산 EPA, DHA를 각각 10, 20, 50, 100, 200 µM을 6, 12, 24, 48시간 처리하여 MTT assay한 결과, 농도와 시간에 의존적으로 세포독성이 증가하였다. Omega-3 불포화 지방산 인 EPA와 DHA 10, 20, 50 µM에서 48시간까지 처리된 세 포에서 세포의 생존율의 차이가 나타나지 않았고 100 µM와 200µM에서 EPA, DHA 모두에서 시간 의존적으로 세포독성 Fig. 2. The Cytotoxicity of EPA Based on MTT Assay in NIH3T3 Fibroblasts. The cells were treated with 10, 20, 50, 100, 200µM EPA, and incubated at 37oC for 6-48 h. Results represented mean±S.E.M. of five experiments. Significantly different from control values : p < 0.05 (ANOVA followed by Turkey's test).
Table 2. Effect of Bleaching Degree on Hair Morphology
Degree of bleaching
None once 2nd 3rd 4th 5th
Boundary - + + ++ +++ ++++
Disquamation - + ++ +++ +++ ++++
Dissolution - - - + ++ +++
Swelling - - + ++ +++ ++++
Elution - - - ++ +++ ++++
;+: A little, ++: Slightly, +++: Sever, ++++: Very sever
;Boundary (line of cuticle), Disqumation (break away, peeling off or fall off the cuticle), Swelling (expend the combination of internal hair),
Elution (flow out protein in cortex and medullar)
Table 3. Improvement of 1 Bleached Hair Morphology Following EPA Shampoo Treatment Treatment (Day)
1 10 20 30
E P A
2%
5%
8%
10%
12%
Table 4. Improvement of 3 Bleached Hair Morphology Following EPA Shampoo Treatment Treatment (Day)
1 10 20 30
E P A
2%
5%
8%
10%
12%
이 증가하였고, EPA보다 DHA에서 세포독성이 높은 것으로 나타났다(Figure 1, 2).
샴푸 처리에 따른 손상모발의 형태학적 개선 효과 (1) 탈색 횟수에 따른 모발의 형태학적 변화
탈색정도에 따른 모발의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 탈 색을 하지 않은 정상모발(Virgin hair)은 전체적으로 매끄러 운 외형을 보이고 있으며 스케일이 규칙적으로 겹쳐있었다.
1, 2회 탈색모에서는 큐티클층의 경계불분명(Boundary)과 큐 티클층의 들림을 나타내는 박리현상(Disquamation)이 나타났 으며 3회 탈색모에서는 경계불분명(Boundary), 박리현상 (Disquamation)에 부분적인 큐티클층의 용해(Dissolution) 가 관찰되었다. 4회에서는 큐티클층의 용해(Dissolution)와 모발 내의 용출 (Elution)이 관찰되었고, 5회 탈색모에서는 경계불 분명(Boundary), 박리(Disquamation), 용해(Dissolution), 팽창 (Swelling), 용출현상(Elution)이 심한 것으로 관찰되었다 (Table 2).
(2) 농도별 EPA 및 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 형태학적 개선효과
① 농도별 EPA 샴푸 처리
EPA 2, 5, 8, 10, 12% 첨가한 샴푸를 손상모발(1, 3회 탈 색모)에 처리한 결과, EPA의 함유량이 높은 샴푸에 대해 손
상모의 상태가 개선되는 것을 확인하였다. 특히, EPA 12%
샴푸 처리한 모발에서 20회 처리 후의 모발표면이 많이 매 끄러워진 것을 볼 수 있다(Table 3, 4).
② 농도별 DHA 샴푸 처리
DHA를 2, 5, 8, 10, 12% 첨가한 샴푸를 손상모발에 처리 한 결과, DHA의 함유량이 높은 샴푸에 대해 손상모의 상태 가 개선되는 것을 확인하였다. DHA를 2, 5% 첨가한 샴푸의 경우, 20회 처리 후에도 부분적으로 거칠어 보였다. DHA를 10, 12% 첨가한 샴푸의 경우, 10회 처리 후에 눈에 띄게 모 발의 표면의 들린 큐티클층의 각질이 제거되어 균일하여 보 였으며 30회 처리 후에는 정상모발과 비슷하게 모발의 표면 이 매끄러워진 것을 관찰 할 수 있었다(Table 5, 6).
③ Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸 처리
Horse oil 샴푸를 손상 모발에 처리한 결과, 샴푸 10회 처 리 후에는 1회 시술 보다 눈에 띄게 큐티클층의 각질이 제 거되어 세정되었다. 20회 처리 후에는 10회와 크게 다르지 않았다. 샴푸 처리 30회의 경우, 표면이 매끄러워졌음을 알 수 있었다. Omega-3 샴푸의 경우 10회 처리 후 큐티클층의 각질이 조금 제거된 것으로 관찰되었고 샴푸처리 전과 후의 차이가 크게 나타나지 않았다. 30회 시술 후에는 일부 각질 이 보이지만 세정효과는 있는 것으로 보였다(Table 7).
Table 5. Improvement of 1 Bleached Hair Morphology Following DHA Shampoo Treatment Treatment (Day)
1 10 20 30
DHA 2%
5%
8%
10%
12%
Table 6. Improvement of 3 Bleached Hair Morphology Following DHA Shampoo Treatment Treatment (Day)
1 10 20 30
DHA 2%
5%
8%
10%
12%
Table 7. Improvement of Hair Morphology Following Other Shampoo Treatment Treatment (Day)
1 10 20 30
Once bleached Hair
OME
H.O
3rd bleached hair
Con
H.O
OME: Omega-3 shampoo
H.O: Horse oil shampoo
농도별 EPA 및 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 두께 증가 효과
(1) 탈색 횟수에 따른 모발의 굵기 변화
모발의 굵기는 개개인에 따라 다르고 동일인의 모발이라 하여 그 굵기는 다르지만, 일반적인 동양인의 모발 굵기인 50~150µm 정도이다.9) 본 실험에서 사용한 모발의 평균 굵 기는 101.6973 µm로 건강한 정상모발인 것을 확인한 후, 사 용하였다. 탈색 횟수에 따른 모발 굵기 변화를 측정한 결과, 탈색횟수가 반복됨에 따라 모발의 굵기가 얇아졌다( p< 0.05, p = .012). 정상모발과 1회 탈색한 모발 굵기 사이의 유의한 차이는 나타나지 않았으며(p > 0.05; p = 0.307), 2회부터 유의 하였다(Figure 4).
(2) 농도별 EPA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 두께 증가
효과
1, 3회 탈색으로 인해 손상된 모발에 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸를 처리하여 두께 변화를 측정한 결과, 농도가 증 가함에 따라 모발의 두께가 증가하였고(p >0.05, p =.021; 1 bleached hair, p=.024 ; 3 bleached hair), EPA 12% 샴푸 처 리한 1, 3회 탈색모발이 각각 4.6%(102.92 µm; 1 bleached hair), 3.8%(96.67µm; 3 bleached hair)의 두께증가율로 가장 큰 차이를 보였다(Figure 5).
(3) 농도별 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 두께 증가 효과
1, 3회 탈색으로 인해 손상된 모발에 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸를 처리하여 두께 변화를 측정한 결과, 농도가 증 가함에 따라 모발의 두께가 증가하였다(p > 0.05, 1 bleached hair- p=.032, 3 bleached hair- p=.017). DHA 12% 샴푸 처 리한 1, 3회 탈색모발이 각각 4.5%(102.74 µm; 1 bleached hair), 2.5% (95.43µm; 3 bleached hair)의 두께증가율로 가 장 큰 차이를 보였다(Figure 5).
(4) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸 처리한 손상모발의 두께 증가 효과
Horse oil 샴푸 및 Omega-3 샴푸 처리함에 따라 모발의 Fig. 3. The Cytotoxicity of DHA Based on MTT Assay in
NIH3T3 Fibroblasts. The cells were treated with 10, 20, 50, 100, 200µM DHA, and incubated at 37oC for 6-48 h. Results represented mean±S.E.M. of five experiments. Significantly different from control values : p < 0.05 (ANOVA followed by Turkey's test).
Fig. 4. The Effect of Bleaching Degree on Hair Thickness.
Fig. 5. The Effect of EPA & DHA Shampoo on Hair Thickness after Hair Bleaching. (a) The thickness of 1 bleached hair, (b) The thickness of 3 bleached hair. The hair tresses were treated once a day for 8, 10, 12% EPA shampoo, 8, 10, 12% DHA shampoo, Horse oil shampoo (H.O), Omega-3 shampoo (OME).
Results represented mean±S.E.M. Significantly different from control values: p < 0.05
두께 변화를 측정한 결과, Horse oil 샴푸는 Control 샴푸에 비해 모발의 두께 증가율이 Omega-3 샴푸의 두께 증가율 보다 크게 나타났다(Figure 5).
농도별 EPA 및 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 단백 질 감소 효과
(1) 탈색정도에 따른 모발의 단백질량 측정
BCA protein 정량법을 실시하여 모발손상이 많이 될수록 단위 시간당 모발내의 단백질이 많이 유출된다는 것을 이용 하여 실험한 결과 탈색 횟수가 증가할 수록 유출된 단백질 이 많음을 확인하였다(Figure 6).
(2) 농도별 EPA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 단백질량 감소 효과
① 하루 한번 30회 샴푸 처리한 손상모발
1회 탈색한 모발의 EPA의 농도별 단백질 감소율(3.271 µg)은 EPA 0, 2, 5, 8, 10 ,12% 함량에 따라 각각 11.3%(2.690 µg), 27.9%(2.357µg), 32.8%(2.199 µg), 42.0% (1.896 µg), 45.1%
(1.79µg), 51.0%(1.602 µg)이였다. 3회 탈색한 모발의 EPA의 농도별 단백질량의 감소율(4.165 µg)은 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12%의 함량에 따라 각 12.9% (3.626 µg), 17.9%(3.418 µg), 24.1%(3.160µg), 36.9%(2.624 µg), 45.8% (2.255 µg), 50.5%
(2.058µg)이었다.
EPA 2, 5, 8, 10 ,12% 샴푸 처리한 손상모발에 대해 protein assay한 결과, 농도에 의존적으로 모발의 단백질량이 감소하는 것으로 나타났다(p < 0.05; 1 bleached hair- p=.024, 3 bleached hair- p =. 001). 1회 탈색모에 대한 샴푸처리에서 는 10회 처리 후, 3회 탈색모에서는 15회 처리 후 EPA 8, 10, 12%를 샴푸 처리한 모발에서 단백질량의 차이나 나타났 다(p < 0.05; 1 bleached hair- p = 0.031, 3 bleached hair- p =.021).
② 연속 30회 샴푸 처리한 손상모발
1회 탈색한 모발의 EPA의 농도별 단백질 감소율(3.271 µg) 은 EPA 0, 2, 5, 8, 10 ,12% 함량에 따라 각각 11.3%
(2.690µg), 27.9%(2.357 µg), 32.8%(2.199 µg), 42.0%(1.896 µg),
45.1%(1.796µg), 51.0%(1.602 µg)로 나타났다. 3회 탈색한 모발 의 EPA의 농도별 단백질량의 감소율(4.165 µg)은 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12%의 함량에 따라 각 12.9%(3.626 µg), 17.9%
(3.418µg), 24.1%(3.160 µg), 36.9%(2.624 µg), 45.8%(2.255 µg), 50.5%(2.05µg)로 나타났다.
EPA 2, 5, 8, 10 ,12% 샴푸 처리한 손상모발에 대해 protein assay한 결과, 농도에 의존적으로 모발의 단백질이 감 소하는 것으로 나타났다(p < 0.05; 1 bleached hair- p = .024, 3 bleached hair- p = .001).
EPA 8, 10, 12% 샴푸 처리한 1회 탈색모는 10회, 3회 탈 색모는 15회 처리 후부터 모발로부터의 단백질량이 비첨가 군과 EPA 2, 5% 첨가 샴푸군보다 통계적으로 유의하게 차 이나 나타났다(p < 0.05; 1 bleached hair-p = .031, 3 bleached hair-p=.021).
(3) 농도별 DHA 샴푸 처리에 따른 손상 모발의 단백질량 감소효과
① 하루 한번 30회 샴푸 처리한 손상모발
1회 탈색모의 DHA 농도별 단백질 감소율(3.271 µg)은 Fig. 6. The Effect of Bleaching Degree on Hair Protein
Content. Significantly different from control values : p < 0.05.
Fig. 7. The Effect of Increasing Moisturizing for Damaged Hair Following Shampoo Treatment. (a) One bleached hair-B1, (b) Three bleached hair-B3. The hair tresses were treated once a day for 8, 10, 12% EPA shampoo, 8, 10, 12% DHA shampoo, Horse oil shampoo (H.O), Omega-3 shampoo (OME). Results represented mean±S.E.M. Significantly different from control values: p < 0.05
DHA 0, 2, 5, 8, 10 ,12%에 따라 각각 11.3%(2.690 µg), 23.1%(2.513µg), 23.6%(2.499 µg), 39.8%(1.968 µg), 42.1%
(1.895µg), 46.2%(1.759 µg)로 나타났다. 3회 탈색모의 DHA 농도별 단백질량의 감소율(4.165 µg)은 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12%에 각 12.9%(3.626 µg), 19.2(3.365 µg), 24.3%(3.152 µg), 38.3%(2.549µg), 49.6%(2.101 µg), 52.4%(1.982 µg)의 감소율 로 나타났다.
DHA 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸 처리한 손상모발에 대해 protein assay한 결과, DHA 비첨가군(DHA 0%; Control)과 DHA 첨가군 모두에서 모두 의존적으로 단백질이 감소하였다 (p > 0.05; 1 bleached hair- p = .035, 3 bleached hair- p = .010). 1회 탈색한 모발에서는 옴 8, 10, 12% 처리한 모발 의 단백질량이 15회 샴푸 처리 후, DHA 비첨가군과 DHA 2, 5% 처리한 모발군 모두보다 단백질량이 유의하게 감소하 였고, 3회 탈색모에서는 20회 처리 후에 DHA 8, 10, 12%
샴푸처리한 모발의 단백질량 감소율이 유의하게 감소하였다
(p < 0.05; 1 bleached hair- p = .002, 3 bleached hair- p = .021).
② 연속 30회 샴푸 처리한 손상모발
1회 탈색한 모발의 DHA의 농도별 단백질 감소율(3.271 µg) 은 DHA 0, 2, 5, 8, 10 ,12%함에 따라 각각 11.3%(2.690 µg), 23.1%(2.513µg), 23.6%(2.499 µg), 39.8%(1.968 µg), 42.1%(
1.895µg), 46.2%(1.759 µg)로 나타났다. 3회 탈색한 모발의 DHA 농도별 단백질량의 감소율(4.165 µg)은 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12%의 함량에 따라 각 12.9%(3.626 µg), 19.2(3.365 µg), 24.3%(3.152µg), 38.3%(2.549 µg), 49.6% (2.101 µg), 52.4%
(1.982µg)의 감소율로 나타났다.
DHA 2, 5, 8, 10 ,12% 샴푸 처리한 손상모발에 대해 protein assay한 결과, DHA 비첨가군(DHA 0%; control)과 DHA 첨가군 모두에서 농도에 의존적으로 모발 단백질이 감 소하는 것으로 나타났다(p > 0.05; 1 bleached hair- p = .035, 3 bleached hair- p = .010). DHA 8, 10, 12% 처리한 모발의 단백질 정량에서는 1회 탈색모에서는 15회 처리, 3회 탈색모
Table 8. Patients' Characteristics
Shampoo groups
EPA 12% shampoo Control shampoo
Total (n) 52 35
Gender (n) Male 11(21.2%) 11(31.4%)
Female 41(78.8%)* 24(68.6%)*
Age (years) 24.67±2.3786 21.47±1.3648
Occupation (n)
Worker 9(17.3%) 3(8.6%)
Students 38(73.1%)* 27(77.1%)*
House keeper 4(7.7%) 2(5.7%)
Etc. 1(1.9%) 3(8.6%)
Experience of hair perm (n) Yes 48(92.3%) 30(85.7%)
No 4(7.7%) 5(14.3%)
Hair Condition
Kind of hair (n)
Non treatment 4(7.7%) 4(11.4%)
Dyed hair 31( %)* 16(45.7%)*
Coated hair 4(7.7%) 3(3.8%)
Bleached hair 8(22.9%) 6(17.1%)
More than 2 perm 5(9.6%) 6(17.1%)
# of shampoo (n)
More than 2 a day 6(11.5%) 3(8.6%)
Once a day 41(78.8%)* 26(74.3%)
4~5 a week 4(7.7%) 4(11.4%)
2~3 a week 1(1.9%) 2(5.7%)
Methods of drying (n)
Natural dry 7(13.5%) 2(5.7%)
Dry machind 43(82.7%)* 30(85.7%)*
Sleep without dry 2(3.8%) 3(8.6%)
;
*p < 0.05
에서는 20회 처리 후, DHA 비첨가군과 DHA 2, 5% 처리한 모발군 모두보다 단백질량이 유의하게 감소하였다(p < 0.05; 1 bleached hair- p = .002, 3 bleached hair- p = .021).
(4) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸 처리에 따른 손상모 발의 단백질 감소 효과
① 1회 탈색모 (B1; 1 bleached hair)의 단백질량
Horse oil을 30일 처리한 후 단백질량의 감소율이 51.1%
(1.375µg)로 EPA 10, 12% 첨가된 샴푸군과 비슷한 비율로 단백질량 줄어든 것으로 나타났다(45.1%; EPA 10%, 51.0%;
EPA 12%)(p > 0.05, p = .670). DHA 첨가한 샴푸의 경우, 12%를 첨가한 샴푸를 처리한 모발이 Horse oil 처리한 모발 의 단백질 감소량과 유의하게 비슷한 경향을 나타내었다 (p > 0.05, p = .520).
② 3회 탈색모 (B3; 3 bleached hair)의 단백질량
Horse oil을 30일 처리한 후 단백질량의 감소율이 50.6%
(2.055µg)로 EPA 12%와 DHA 10, 12% 첨가한 샴푸군과 비슷한 감소율을 보였고 통계적으로 유의한 것으로 나타났다 (p > 0.05, p = .038).
농도별 EPA 및 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발 내 수 분함량 증가 효과
(1) 농도별 EPA 샴푸 처리한 손상모발 내의 수분 증가 효과 손상모발(1, 3회 탈색모)에 EPA 8, 10, 12% 샴푸 처리하 여 모발 내의 수분 함량을 측정한 결과, EPA 첨가 농도가 높을수록 샴푸처리 후 수분함량이 높은 것으로 나타났다
(p > 0.05). EPA 10, 12% 샴푸가 Control 샴푸 처리군 (2.23 mg)에 비해 샴푸 처리함에 따라 수분함량이 높아지는 것으로 나타났으며 EPA 12% 샴푸처리한 모발의 수분함량이 21.9% (2.72 mg; 1 bleached hair), 52.1% (2.54 mg; 3 bleached hair)의 증가율로 가장 높았다(Figure 7).
(2) 농도별 DHA 샴푸 처리한 손상모발 내의 수분 증가 효과 손상모발(1, 3회 탈색모)에 DHA 8, 10, 12% 샴푸 처리하여 모발내의 수분함량을 측정한 결과, DHA 첨가 농도가 높을수 록 샴푸처리 후 수분함량이 높은 것으로 나타났으며(p > 0.05), DHA 10, 12% 샴푸가 샴푸 처리함에 따라 Control에 비해 유 의하였다. DHA 12% 샴푸가 샴푸처리 전에 비해 17.0%
(2.61 mg; 1 bleached hair), 47.9% (2.47 mg; 3 bleached hair)의 수분함량이 증가한 것으로 나타났다(Figure 7).
(3) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸 처리한 손상모발 내 의 수분 증가 효과
Horse oil 샴푸처리한 모발의 경우, 20.6% (2.69 mg; 1 bleached hair), 52.6% (2.55 mg)의 수분증가율을 보여 EPA 12% 샴푸처리한 모발과 비슷한 경향을 나타내었으며 Omega-3 샴푸처리한 모발은 8.9%(1.82 mg; 1 bleached hair), 9.0% (2.43 mg)의 증가율로 EPA 8% 샴푸처리한 모발 과 비슷한 경향을 나타내었다(Figure 7).
샴푸 사용성 평가 (1) 환자의 특성
본 연구는 손상모발 개선에 가장 효과가 있다고 판단되어
Fig. 8. Summary of Questionnaire Regarding the Use of 12% EPA Shampoo.
Significantly different from control values : p < 0.05
진 EPA 12% 샴푸에 대해 사용성을 평가하기 위한 임상평 가를 실시하였다. 설문에 참여한 환자는 총 52명으로 성별, 직업, 모발 손상도, 모발 타입, 두피 상태 등에 관한 특성은 Table 8과 같다.
(2) 샴푸의 사용성 평가
샴푸의 사용성을 평가한 결과, 평균 2.37±0.6977의 만족도 로 평가되었다. 샴푸의 점도(2.65±0.6069), 샴푸 사용 시 퍼 짐성(2.58±1.0099), 기포 생성력 적절성(2.6±0.6661), 헹굼 시의 모발의 느낌(2.27±0.6476), 타올 드라이 후의 느낌 (2.45±0.6457), 건조 후 모발의 광택(2.45±0.3659), 사용 후 빗질의 용이성 (2.38±0.5879), 보습력(2.3±0.5414) 등이 긍정적인 평가였으며 샴푸향(3.2±0.7410), 샴푸의 세정력 (1.78±0.5698) 등의 항목에 서 부적정인 평가였다(Figure 8).
고찰 및 결론
본 논문에서는 동일한 사람의 정상모발에 탈색시술로 동일 손상을 주었고 샴푸로 트리트먼트 한 후, 손상모발의 보호효 과를 평가하였다. 샴푸처리군은 Control 샴푸, DHA와 EPA 샴푸, horse oil 샴푸, Omega-3 샴푸였으며, 처리모발에 대해 서는 MTT assay, 광학현미경 SEM (Scanning electron microscope)을 이용한 모발의 형태학적 관찰 및 두께측정, BCA kit를 이용한 Protein assay, 열분석(Thermal analysis)을 이용한 수분측정, 설문을 통한 임상 평가를 실시하였다.
정상세포에 대한 DHA와 EPA의 세포독성을 알아보기 위 해 NIH3T3 섬유모 세포(NIH3T3)에 대해 MTT assay 한 결 과, EPA, DHA 모두 50 uM 이하에서는 세포독성이 나타나 지 않았으며, 100, 200 uM 처리한 세포군에서 세포독성이 나타났다. 따라서 샴푸에 DHA 와 EPA를 첨가할 때 독성이 나타나지 않은 50 uM 이하의 농도를 사용해야할 것으로 생 각된다. Menendez 등의 오메가 3 불포화 지방산이 정상세포 에는 영향을 주지 않고, 인체 암세포에만 선택적으로 세포독 성을 유발한다는 것과 일치하며 이러한 암세포의 선택적 세 포독성을 나타내는 기전에는 지방산 합성억제와 malonyl- COA 세포독성의 억제 의한 세포고사에 기인한다고 보고하 였다.10)
손상모발의 개선을 알아보기 위해 모발의 특성을 측정한 결과, 모발은 탈색정도가 증가할수록 즉, 손상된 모발일수록 단위시간당 용출되는 단백질량이 증가하는 것으로 나타났으 며, 모발의 두께가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 형태학 적으로는 큐티클층의 경계불분명, 큐티클층의 들림을 나타내 는 박리현상, 큐티클층의 용해, 모발내의 용출현상이 심해지 는 것으로 나타났다.
손상모발의 보호효과를 평가하기 위해 손상된 모발일수록 모발 내부에 있는 모피질로부터 단백질이 많이 용출된다는 것을 이용하여 Protein assay한 결과, DHA의 농도가 증가함
에 따라서 단위 시간당 용출되는 Protein의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, DHA 8, 10, 12% 처리한 모발의 단백질량의 감소율이 높았으며, 하루 한번 처리한 손상모보 다 연속하여 샴푸처리 한 모발에서 단백질량이 더 많이 줄 것으로 나타났다. 따라서 DHA 12%가 가장 보호효과가 있 는 것으로 나타났다. EPA 샴푸를 처리한 모발의 경우, EPA 8, 10, 12%가 첨가된 EPA 샴푸에서 큰 폭으로 단백질량이 줄어드는 것으로 나타났으며 DHA를 처리한 모발보다 단백 질량 감소율이 높은 것으로 나타났다. 따라서 EPA 12%가 가장 큰 단백질 감소율을 보였다. DHA와 EPA 샴푸와의 비 교평가를 위해 마유샴푸와 OMEGA-3 샴푸를 각각 비교하면 마유샴푸가 omega-3 샴푸보다 샴푸처리 횟수가 증가함에 따 라 단백질량이 더 큰 폭으로 줄어드는 것으로 나타났으며, 1 회 탈색모에서는 마유 샴푸, EPA 10% 샴푸, EPA 12% 샴 푸, DHA 12% 샴푸와 단백질 감소율이 비슷한 경향을 나타 냈으며, 3회 탈색모에서는 마유 샴푸, EPA10% 샴푸, 12%
샴푸와 DHA 12% 샴푸와 비슷한 것으로 나타났다.
샴푸처리에 따른 손상모발의 형태학적 변화는 EPA와 DHA를 각각 8, 10, 12% 첨가한 샴푸의 경우, 10회 처리 후 에 눈에 띄게 모발의 표면의 들린 큐티클층의 각질이 제거 되어 균일하여 보였으며 30회 처리 후에는 정상모발과 비슷 하게 모발의 표면이 매끄러워진 것을 관찰 할 수 있었다. 특 히, EPA 12%를 첨가한 샴푸에서 20회 처리 후의 모발표면 이 많이 매끄리워진 것을 볼 수 있었다.
샴푸 처리함에 따라 모발의 두께변화는 DHA와 EPA 첨가
%가 높을수록 두께가 굵어지는 것으로 나타났으며, 1회 탈 색모발의 두께변화는 마유샴푸, EPA 12%, DHA 12%, EPA 10% 샴푸의 순이었으며, 3회 탈색한 모발의 굵기는 EPA 12%, DHA 12%, 마유 샴푸 순인 것으로 나타났다.9)11)
모발내의 수분함량 변화는 DHA와 EPA의 함량이 높을 수 록 처리횟수가 증가함에 따라 모발내의 수분함량이 감소하였 으며 1회 탈색모발에서는 EPA 12%, 마유, DHA 12% 샴푸 순이었으며, 3회 탈색모발 에서도 EPA 12%, 마유, DHA 12% 샴푸 순이었다. 모발 내의 수분은 모발의 형태유지, 열 에 대한 저항성, 케라틴결합사이의 수소결합의 형태유지 및 큐티클의 부서짐 등의 중요한 역할을 한다.12)
샴푸의 사용성에 대한 임상평가는 EPA 12% 샴푸가 Control 샴푸에 비해 세정력, 사용 시 감기는 느낌, 수분공급 효과, 드라이 건조 후의 느낌 등이 좋은 것으로 나타난 반면 에 점도 및 향에 대해서는 좋지 않게 평가되었다.
본 논문의 연구결과, EPA와 DHA는 손상모를 개선시키고 특히, EPA 샴푸의 농도가 증가할수록 보호효과는 높은 것으 로 나타났다. 또한, EPA 12% 첨가된 샴푸가 가장 손상모발 에 대해 샴푸의 처리가 반복됨에 따라 개선되는 것으로 나 타났다. 따라서, EPA 12% 샴푸는 손상모를 보호하고 모발 환경 개선을 위한 샴푸로서의 개발가능성이 있는 것으로 사
료된다.
감사의 글
이 논문은 2010년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한 국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(2010- 0003810). “This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea(NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology(2010-0003810)”
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