사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 고 상 훈. 세종대학교 식품공학과. 1. 서론 1.1. 연구의 배경 1) 한방소재 • 국내에 현재 사용되고 있는 신기능성 약용소재는 대부분 기술집약적 제품으로 부가가치가 높으나 대부분 선진국에서 생산되고 있어 우리나라는 수입에 의존하고 있는 실정임.. • 한방산업 및 약용소재 분야는 전통적인 노하우의 축적으로 건강기능성식품 및 대체의약품 시장에서 세계 최고가 될 수 있는 독보적인 분야임.. • 웰-빙 열풍과 건강에 대한 관심이 생활의 전분야로 확산되면서 건강기능성 제품에 대한 수요가 급증하고 있으며 이들의 소재를 천연의 한방자원 및 약용식물로부터 얻으려는 노력이 증가하고 있음.. • 지식집약형 산업 중 건강 및 약용 기능성 소재 관련 산업은 다른 기술에 비해서 기초 연구의 성과가 비교적 쉽게 실용화, 산업화에 즉시 반영되기 쉬운 특징을 가지고 있으므로 고부가가치의 상품으로 개발할 수 있는 잠재성을 가지고 있음.. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 3.

(2) • 한방 약용작물은 매우 다양하지만 이 중 산업적으로 중요한 홍삼 작물을 본 연구의 모델로 사용 하고자 함. 홍삼 추출물은 고미 때문에 다양한 식품에 첨가되는데 어려움이 있으므로 이를 해결하고 더불어 생체 내 흡수를 증진시킬 수 있도록 소재화 하는 것은 홍삼의 다양한 식품 이용을 위해 중요함.. • 홍삼의 성분, 약리 및 임상효능에 대한 현대과학적인 연구는 최근 약 30년간 비약적인 연구 성과를 얻고 있으며, 암세포 증식 억제, 면역강화, 산화 억제, 강장 효과, 항암, 항바이러스 등의 다양한 생리활성이 보고되고 있음.. • 천연물의 생리활성을 이용하기 위한 식품, 의약품, 화장품 소재화 기술은 이미 현시점에 그 한계를 드러내고 있음. 천연 한방소재는 열수추출 후에도 생체활용성이 낮은 단점을 가지고 있으며 한방소재 및 약용식물 특유의 이취와 고미에 의해 식품적용에 제한이 있음.. • 홍삼을 비롯한 한방소재 및 약용식물을 이용한 가공식품류는 대부분 사탕, 정, 캔디, 음료 형태로 유통되는데, 한방소재 특유의 이취 및 고미에 의해 소비자에게 외면 받고 있는 실정임.. • 천연 한방소재의 이취 및 고미억제를 위해 산업적으로 단맛을 내는 성분을 첨가하거나 발효공정을 통해 고미를 내는 물질을 상쇄 또는 분해하는 방법이 이용되고 있음. 하지만, 단맛 성분 첨가에 대한 소비자의 불만족, 발효공정에 의한 생리활성 물질의 감소 등의 단점을 가짐.. • 따라서, 이러한 문제점을 개선할 수 있는 새로운 소재화 기술 및 이를 이용한 신개념의 고부가가치 제품 개발이 절실히 요구됨.. 2) 나노 캡슐화 기술 • 나노기술은 10여 년 전부터 전 세계에서 급속히 발전하여 현재 의약품 등 여러 분야에서 실용화 기술 및 제품이 등장하고 있지만, 식품분야에서의 나노기술은 안전성 및 대량생산의 어려움으로 아직 초보적인 단계에 있는 실정임.. • 식약처에서는 나노기술 응용식품 안전관리를 위한 다양한 작업들을 수행하고 있으며, 2015년부터는 나노기술 응용식품의 안전관리 제도를 시행할 예정임. 따라서, 나노기술 응용식품 안전관리 제도마련을 전후해서는 관련 식품들의 시장이 급속히 성장할 것으로 예상되므로 이를 위한 선제적 기술개발의 필요성이 대두됨.. • 나노기술은 물질의 입자 크기를 나노수준에서 제어하는 기술로서 물질의 입자크기가 현저히 작아짐에 따라 표면적이 증가되어 용해도와 흡수도가 증가하게 되고 생체이용률의 향상을 꾀할 수 있어 약용 소재의 기능성을 극대화 시킬 수 있음.. 4. 2013년 기초연구과제총서.

(3) • 캡슐화(encapsulation) 기술은 향료, 영양성분 등의 불안정한 물질을 빛, 산소, 수분, 온도 등의 외부요인으로부터 보호하여 손실을 줄이고 나아가 식품산업에서 식품첨가물 또는 식품 유용성분을 캡슐화 함으로써 식품소재의 산화방지 및 보존성 향상, 변화하기 쉬운 식품 소재의 안정화, 불필요한 냄새 및 맛의 차단, 식품소재의 방출속도 조절, 제조공정의 개선 및 물성향상 등의 장점을 지니고 있음.. • 캡슐화 기술을 이용하여 천연 한방소재의 이취 및 고미억제는 물론 생리활성 및 안정성과 저장성의 향상 등을 기대할 수 있음.. • 본 연구진의 고미억제 핵심전략은 한방소재 추출물을 나노캡슐 안에 포집하여 구강 내에서 고미를 못 느끼게 하고 소화시 소장까지 안전하게 도달한 후 방출되도록 함으로써 기능성을 강화하는 것임.. • 홍삼 나노캡슐 제조를 위해 본 연구에서는 홍삼을 1차로 키토산(Chitosan)으로 코팅한 후 그 외부를 변성 베타락토글로불린(Denatured β-lactoglobulin)으로 2차 코팅하여 사용할 예정임.. • 키토산(Chitosan)은 점액질의 물질로, 코어 물질의 효과적인 표적 방출 전달체 제조에 유용하게 사용되며 특히, 소장에서 겔을 형성하여 점막에 머무르는 시간이 증가하기 때문에 코어 물질을 천천히 일정하게 방출하는 특성이 있음.. • 베타락토글로불린(β-lactoglobulin)은 친수성 단백질로 생체 안전성, 높은 친수성, 저렴한 비용, 높은 캡슐화 효율 등의 장점이 있기 때문에, 가장 널리 이용되는 캡슐 물질 중의 하나임. 키토산(Chitosan)은 코일형태의 분자 구조를 가지기 때문에 캡슐 제조시 코어 물질이 확산되어 방출될 가능성이 높음. 변성 베타락토글로불린(Denatured β-lactoglobulin)은 다양한 아미노산의 구조에 의해 컴팩트(compact)한 분자 구성을 나타내기 때문에 키토산(Chitosan) 위에 2차로 코팅함으로써 키토산 분자의 열린 공간을 효과적으로 커버하여 확산에 의한 코어물질의 외부 방출을 방지할 수 있음.. 3) 나노 분무건조 기술 • 액상이거나 액상에 분산된 입자들을 고체화하기 위한 방법에는 열풍건조법, 분무건조법, 동결건조법, 가열건조법 등이 있는데, 이 중 분무건조법은 액상 상태의 물질을 미세한 방울로 분무시킨 후 고온의 열풍과 접촉시켜 액체를 증발, 건조시키는 기술로, 미세한 방울은 표면적을 크게 만들기 때문에 건조시간이 짧고 구형모양의 입자 제조가 가능함.. • 분무건조법은 식품산업에서는 향미성분의 캡슐화, 기능성 첨가제 제조, 미세분말 제조에 이용되고 있는데, 분무건조법은 다른 건조법에 비해 열에 민감한 원료의 건조, 저렴한 비용, 취급의 편이, 대량생산화, 공정의 간편화 등의 장점이 있음. 또한, 액체로부터 직접 건조제품을 얻을 수 있어 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 5.

(4) 연속운전이 가능하며, 제품의 수분, 부피비중, 입도 분포, 원액농도, 분무조건, 건조온도조건을 변화시킴으로써 최종 제품의 이화학적 특성을 조절할 수 있음.. • 최근 개발된 나노 분무건조법은 제약, 생물공학, 재료, 나노기술 분야에 이용되고 있음. 특히 제약 산업에서는 약물의 용해도 및 생체이용률 향상, 캡슐물질의 방출 제어를 통한 약물 표적 전달 향상, 흡입용 미세입자 제조 등에 응용되고 있음.. • 좁은 입도 분포를 보이는 나노미터 범위의 입자를 높은 수득률(yield rate)로 생산이 가능하며 빠른 건조공정으로 인하여 온도에 민감한 물질의 생산에도 적합함.. • 나노 분무건조기는 기존 분무건조기와 액적 분무기술, 가열 시스템, 입자 집진기술이 다르기 때문에 최종 제품의 이화학적 특성이 상당히 다를 것으로 예상되므로 고미제어 및 기능성이 최적화 된 나노캡슐 약용소재의 생산을 위한 제조방법으로 사용될 수 있음.. • 하지만, 약용소재 및 식품소재를 나노 분무건조기술을 이용하여 실험 연구 또는 생산에 사용한 예가 아직 없으므로, 본 연구의 홍삼 추출물과 같은 약용 물질을 이용한 나노분무건조를 수행함으로써 이들의 특성 및 차별성을 비교 평가할 필요가 있음.. [그림 1-1] 실험실 규모 나노 분무건조장치 나노 분무건조장치 B-90 (BUCHI). • 또한 소규모의 연구용으로 개발되어 대량화 실현에 제한이 있으므로, 대량생산 방안을 탐색하여 타당성을 검토하는 것이 중요함.. 6. 2013년 기초연구과제총서.

(5) 4) 나노 분무건조 기술을 이용한 약용소재 대량생산의 필요성 • 지난 수년 동안 식품관련 학계 및 연구기관에서 식품 나노소재의 제조에 대한 관심이 급격히 높아지고 수많은 연구가 활발히 진행되고 있으나, 제조공정, 가격 등 대량생산의 어려움으로 인하여 제품의 생산은 극히 미미한 실정임.. • 식품 나노소재의 제품화가 활발히 이루어지기 위해서는 이를 대량생산할 수 있는 방안을 탐색하고자 하는 노력이 절실히 필요함.. • 기존의 분무건조기의 경우 제조가 가능한 입자의 크기는 최소 약 2 ㎛ 이며 70%의 회수율을 나타내고 있으나, 나노 분무건조기의 경우 최소 약 300 nm 의 입자 회수가 가능한 것으로 알려져 있음.. • 나노입자 건조분말을 제조하기 위한 분무건조기의 핵심 부분은 용액 시료를 건조기 내로 분무하는 스프레이 헤드와 나노입자 건조분말을 선별 회수하는 장치임. 최근 고속회전 스프레이 헤드와 전기 집진기의 적용으로 보다 작고 회수율이 높은 나노 분무건조기가 개발되었음.. • 본 연구에서는 기존의 분무건조기와 나노 분무건조기를 비교/분석하여 식품 나노소재의 대량생산 가능성 및 나노 분무건조기의 식품 산업체 생산라인에의 적용 가능여부를 탐색하고, 외국의 적용 사례 및 나노분말 개발 사례 등을 조사하여 대량생산화 방안을 모색하고자 시도하였음.. 1.2. 연구의 목표 본 연구팀은 나노캡슐화 방법을 이용하여 천연 한방소재(홍삼 추출물; 건조 홍삼 분말)의 이취 및 고미억제와 더불어 생체이용률을 향상시키고, 이를 대량생산화 할 수 있는 방안을 모색하여 천연 한방소재의 제품화에 이바지하고자 하며 주요 연구 목표는 다음과 같음.. 1) 천연 한방소재의 고미제어 및 생체이용률 향상을 위하여 액상의 한방소재 나노캡슐 제조 및 제조 조건 최적화 2) 액상의 한방소재 나노캡슐을 분무건조하여 한방소재 나노캡슐 분말 제조 및 건조 조건 최적화 3) 문헌조사 및 업체와의 면담을 통해 기존 분무건조기와 나노 분무건조기를 비교/분석하여 나노분말 대량생산 및 생산라인에 적용 가능성을 모색 4) 적합한 모델 선정 후 시제품 생산. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 7.

(6) [그림 1-2] 연구목표 및 주요 연구내용. 1.3. 국내외 연구동향 1) 국내 연구동향 • 영양기능성물질, 단백질, 유산균 등의 안정화 및 조절 방출을 위한 미세캡슐 연구 • 미세캡슐 제조공정 최적화 및 안정성 연구 • 향기성분의 조절 방출을 위한 미세캡슐 연구 • 불쾌취 및 맛의 마스킹을 위한 미세캡슐 연구. ▪ Choi, J. Y., et al. (2006). Spray drying of polymer-adsorbed drug nanocrystal particles.. Journal of the Korean Industrial and Engineering Chemistry, 17(1), 106-110. ▪ Choi, K. O., et. al. (2010). Spray-dried conjugated linoleic acid encapsulated with maillard reaction products of whey proteins and maltodextrin, Food Science. and Biotechnology, 19(4), 957-965. ▪ Choi, Y. H., et al. (2000). Optimization of emulsification and spray drying process for the microencapsulation of flavor compounds. Korean Journal of Food Science. and Technology, 32(1), 132-139.. 8. 2013년 기초연구과제총서.

(7) ▪ Lee, P. S., et al. (2012). Physiochemical properties and prolonged release behaviours of chitosan-denatured β-lactoglobulin microcapsules for potential food applications.. Food Chemistry, 134(2), 992-998.. 2) 국외 연구동향 • 나노 분무건조장치를 이용한 나노입자 제조 및 특성 연구 • 향기성분의 조절방출을 위한 미세캡슐 연구 • 불쾌취 및 맛의 마스킹을 위한 미세캡슐 연구 • 천연색소성분, 영양기능성물질, 비타민, 미네랄, 단백질, 미생물, 감미료, 식품첨가제, 항산화제, 항균제 등의 안정화 및 조절방출을 위한 미세캡슐 연구. • 캡슐 피복물질 개발 및 특성 분석 • 미세캡슐 제조조건 및 가공적성 최적화 연구 • 미세캡슐 구조 및 물리화학적 특성 연구 • 캡슐에서의 물질 이동현상 및 방출 메커니즘 연구. ▪ Mahesh, V. C., Carmen P. (2008). Conversion of nanosuspensions into dry powders by spray drying: A case study. Pharmaceutical Research, 25(10), 2302-2308.. ▪ Okuyama, K. Lenggoro, I. W. (2003). Preparation of nanoparticles via spray route.. Chemical engineering Science, 58(3-6), 537-547. ▪ Reineccius, T. A., et al. (2002). Encapsulation of flavors using cyclodextrins: Comparison of flavor retention in alpha, beta, and gamma types. Journal of. Food Science, 67(9), 3271-3279. ▪ Ribeiro, C. M. M., et al. (2005). Origanum virens L. flavor encapsulation in a spray dried starch matrix. ENPROMER 2005.. ▪ Schnepfleitner, S., Urbanetz, N. A. (2010). Spray drying as a novel method for producing nanoparticles intended for the application in DPI's. Scientia Pharmaceutica. Conference abstract PNM15.. ▪ Sham, J. O. H., et al. (2004).. Formulation and characterization of spray-dried. powders containing nanoparticles for aerosol delivery to the lung. International. Journal of Pharmaceutics, 269(2), 457-467. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 9.

(8) 2. 실험방법 2.1. 연구의 내용. 구분. 연구개발의 목표. 연구개발의 내용. 천연 한방소재의 고미제어 및 생체이용률 향상을 위한 한방소재 나노분말 제조. ◆ 천연 한방소재의 고미제어 및 생체이용률 향상을 위한 액상의 한방소재 나노캡슐 제조 - 대표적 한방소재인 홍삼 추출물의 이취 및 고미억제를 위한 나노캡슐 설계 - 키토산(Chitosan) 및 변성 베타락토글로불린(Denatured β-lactoglobulin)을 이용한 홍삼 추출물 나노캡슐 제조 - 한방소재의 이취 및 고미억제, 안정성 향상, 생체이용률 극대화를 위한 액상 나노캡슐 제조 조건 최적화 - 액상 나노캡슐의 이화학적 특성 평가 ◆ 분무건조를 통한 한방소재 나노캡슐 분말 제조 - 액상 나노캡슐의 분말화를 위한 분무건조 조건 최적화 - 나노캡슐 분말의 이화학적 특성 평가. 나노분말 대량생산 및 생산라인에의 적용 가능성 모색. ◆ 한방소재 나노분말의 대량생산 방안 탐색 - 문헌(논문, 특허 등) 조사를 통한 나노 분무건조기의 타입, 건조 원리, 나노캡슐분말 생산 적합성 평가 - 분무건조기와 나노 분무건조기의 특성 및 차별성을 평가하고 대량생산 가능성 모색 - 국내외 기기공급업체 조사, 나노캡슐 분말의 생산 가능성 및 생산라인에의 적합성 평가 ◆ 적합한 모델 선정 후 시제품 생산. 2012 -2013. 2.2. 연구의 방법 1) 천연 한방소재의 고미제어 및 생체이용률 향상을 위한 액상의 한방소재 나노캡슐 제조 • 홍삼 추출물의 이취 및 고미억제를 위한 액상의 나노캡슐 개발 ▪ 키토산과 변성 베타락토글로불린을 이용하여 홍삼 추출물 나노캡슐화. 10. 2013년 기초연구과제총서.

(9) ▪ 제조방법: 키토산(Chitosan)을 0.1% 아세트산 용액에 용해 → 홍삼분말 수용액을 혼합 → 삼인산나트륨(Sodium tripolyphosphate) 용액을 혼합하여 키토산 나노입자 제조 → 베타락토글로불린(β-lactoglobulin)을 고온에서 변성 → 키토산/홍삼분말 나노캡슐 용액에 변성된 베타락토글로불린 용액을 혼합하여 이중 코팅된 나노캡슐 제조. RGE: 홍삼 추출물, CS: 키토산, Denatured-βlg: 변성 베타락토글로불린. [그림 2-1] 홍삼 추출물 나노캡슐의 모식도. • 한방소재의 이취 및 고미억제, 안정성 향상, 생체이용률 극대화를 위한 액상 나노캡슐 제조 조건 최적화. ▪ 홍삼 추출물 용액, 키토산, 변성 베타락토글로불린의 농도 최적화 ▪ 용액의 산도(pH), 혼합처리 시간을 조절하여 캡슐의 크기 제어. • 액상 나노캡슐의 이화학적 특성 평가 ① 홍삼 나노캡슐의 크기 측정. ▪ 입도 분석기를 이용하여 나노캡슐의 크기 및 크기 분포 측정 ▪ 전자 현미경을 통해 나노캡슐 용액 및 분말의 크기와 형태 관찰 - 액상의 시료를 plate 위에 떨어뜨리고 오븐에서 40도 이하의 온도로 4시간 이상 건조한 다음 탄소테이프를 이용해 시편을 제작하여 이미지를 관찰 (주사전자현미경) 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 11.

(10) ② 홍삼 나노캡슐의 정전기적 안정성 측정. ▪ pH의 변화에 따른 홍삼 나노캡슐의 안정성을 측정함으로써 체내 각 장기에서 홍삼 추출물의 방출 특성을 예상할 수 있음. ▪ 나노캡슐들 사이의 전기적 반발력과 인력의 크기를 측정하는 제타전위를 토대로 입자의 분산 안정성 및 방출 특성 예측. ▪ 시료를 분산시킨 후 pH 2.0 ~ 7.0 범위에서 제타전위 측정 ③ 캡슐화 효율 특성 측정. ▪ 캡슐화 효율이 높을수록 한방소재의 이취 및 고미억제 효과가 높기 때문에 캡슐화 효율이 중요한 공정 변수임.. ▪ 캡슐효율 =. 원심분리 후 상등액에 존재하는 코어물질 흡광도 시료의 흡광도. ⨉100. ④ 인공 위장/소장 조건에서 홍삼 추출물의 방출 특성 측정. ▪ 인공 위장/소장 조건에서 홍삼 추출물의 방출 특성을 예상함으로써 우리가 원하는 장기에서 홍삼이 방출되도록 캡슐의 특성을 제어할 수 있음.. Dispersed samples + phosphate buffer (1:1) 󰀻 Addition of pepsin solution 󰀻 pH adjustment to pH 2.0 󰀻 Shaking incubation (37 ℃, 105 rpm, 1 h) 󰀻 pH adjustment to 5.4 with NaHCO3 󰀻 Addition of enzyme mixture (lipase, bile extract, pancreatin) 󰀻 pH adjustment to 7.0 󰀻 Shaking incubation (37 ℃, 105 rpm, 2 h) <In vitro digestion procedure> [그림 2-2] 인공 위장/소장 조건에서의 방출 특성 측정. 12. 2013년 기초연구과제총서.

(11) ⑤ 사포닌 분석. ▪ 캡슐에 포집되지 않은 홍삼의 고미를 내는 주 구성성분인 사포닌 정량 ▪ 원심분리 후 상등액을 일정량 취해 HPLC를 이용하여 고미 유발의 성분인 사포닌을 표준 용액으로부터 정량.. ▪ 사포닌 중 기능성식품 인정 주요성분인 Ginsenoside Rb1 및 Rg1을 분석 ▪ 사포닌 정량 HPLC 조건 - 역상 HS C18 컬럼, 이동상 용매 Phosphoric acid, Acetonitrile을 각각 80~15%, 20~ 85% 로 기 울 기 용 리 (gradient elution) 이 용 , flow rate 1.0 m L/m in, UV detector(203 nm)에서 검출. 2) 분무건조를 통한 한방소재 나노캡슐분말 제조 • 액상 나노캡슐의 분말화를 위한 분무건조 조건 최적화 ▪ 분무건조기를 이용하여 액상의 홍삼 나노캡슐을 분말화 ▪ 분무건조시 홍삼 나노캡슐 용액의 농도, 용액 투입 속도, 건조 온도 등 변수를 조절하여 홍삼 나노캡슐분말의 크기를 제어. • 나노캡슐분말의 이화학적 특성 분석 ▪ 나노캡슐분말의 이화학적 특성을 분석하여 액상의 나노캡슐의 특성과 비교하여 건조 조건을 보완. ▪ 관능평가를 통해 실제로 느껴지는 맛을 평가. ① 홍삼 나노캡슐분말의 크기 측정. ▪ 나노캡슐분말 수용액 제조 후 입도 분석기를 이용하여 나노캡슐의 크기 및 크기 분포를 측정, 액상의 나노캡슐 입도와 비교. ▪ 전자 현미경을 통해 나노캡슐분말의 크기와 형태 관찰 - 시편에 탄소테이프를 붙인 후 시료를 소량 올려준 다음 전도성 물질로 코팅한 후 이미지를 관찰 (주사전자현미경) ② 홍삼 나노캡슐분말의 정전기적 안정성 측정. ▪ 나노캡슐분말 수용액 제조 후 제타전위를 측정하여 액상의 나노캡슐 제타전위와 비교 ▪ 필요시 초음파 분산기를 사용하여 나노캡슐 재분산 처리 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 13.

(12) 3) 한방 소재 나노분말의 대량 생산 방안 탐색 • 문헌(논문, 특허 등) 조사를 통해 분무건조장치 및 나노 분무건조장치의 타입, 건조 원리, 나노 캡슐분말 생산 적합성 평가. ▪ 분무건조장치 제품별 홍삼 나노캡슐의 크기 제어 변수 (아토마이저 타입, 회전판 속도, 건조물 회수 장치 등)를 탐색. • 분무건조장치와 나노 분무건조장치의 특성 및 차별성을 평가하고, 대량생산 가능성 평가 ▪ 문헌조사를 통해 분무건조장치와 나노 분무건조장치의 특성 및 차별성을 평가 ▪ 제조된 액상의 홍삼 나노캡슐을 건조하여 두 기기의 차이점 평가. • 문헌(논문, 특허 등) 조사 및 검색을 통해 국내외 기기공급업체를 조사하고 업체와의 면담을 통해 나노캡슐분말의 생산 가능성과 생산라인에의 적합성 평가. ▪ 국내외 분무건조장치 제조/공급업체를 조사하여 식품회사 공급 사례 탐색 ▪ 업체들과의 면담을 통해 식품나노분말소재의 생산 사례 탐색. 4) 적합한 모델 선정 후 시제품 생산 • 앞서 정립된 최적의 조건에 따라 액상 나노캡슐 제조. • 선정된 기기 모델을 이용하여 나노캡슐 분말 시제품 생산. 14. 2013년 기초연구과제총서.

(13) 3. 결과 및 고찰 3.1. 액상의 한방소재 나노캡슐 제조 3.1.1. 시료 제조 • Materials ▪ Chitosan (CS) : degree of deacetylation 84.21%, molecular weight 22 kDa ▪ β-lactoglobulin (βlg) : degree of protein 98%(dry basis), 93.4%(total weight) ▪ Sodium tripolyphosphate (TPP) : technical grade, 85% ▪ Red ginseng extract (RGE) : 정관장 홍삼분(Korean Red Ginseng Powder) ▪ Acetic acid (concentration : 0.1% v/v) ▪ Hydrochloric acid (HCl) : 1M, 0.1M ▪ Sodium hydroxide (NaOH) : 1M, 0.1M ▪ Sodium bicarbonate (NaHCO3) : 1M, 0.1M ▪ 0.01M Phosphate buffered saline (PBS; pH 7.4/L) ▪ Pepsin from porcine gastric mucosa (concentration : 4.0 mg/mL) ▪ Lipase from porcine pancreas (concentration : 0.2 mg/mL) ▪ Pancreatin from porcine pancreas (concentration : 0.4 mg/mL) ▪ Bile extract porcine (concentration : 2.4 mg/mL) ▪ Ginsenoside Rb1 : standard material, 10 mg ▪ Ginsenoside Rg1 : standard material, 10 mg. • 키토산 용액 (concentration : 2.0 mg/mL) ▪ 200 mg의 키토산 분말을 0.1%(v/v) 아세트산 용액에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 2시간 동안 용해. ▪ 짙은 노란 색의 투명한 키토산 용액 생성. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 15.

(14) • 베타락토글로불린 용액 (concentration : 1.0 mg/mL) ▪ 100 mg의 베타락토글로불린 분말을 3차 증류수(deionized water)에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 1시간 동안 용해. ▪ 25℃에서 2시간 동안 수화(for good protein hydration) ▪ 무색의 투명한 베타락토글로불린 용액 생성. • 변성 베타락토글로불린 용액 (concentration : 1.0 mg/mL) ▪ 1M HCl 용액을 이용하여 베타락토글로불린 용액의 pH를 pH 2.4로 조절 ▪ 중탕기(double boiler)를 이용하여 80℃에서 30분간 가열 ▪ 완전히 식을 때까지 25℃에서 식혀 무색의 투명한 변성 베타락토글로불린 용액 생성. • 삼인산 나트륨(Sodium tripolyphosphate) 용액 (concentration : 1.0 mg/mL) ▪ 100 mg의 삼인산 나트륨 분말을 3차 증류수(deionized water)에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 30분 동안 용해. ▪ 무색의 투명한 삼인산 나트륨 용액 생성. • 홍삼분말 용액 (concentration : 2.0 mg/mL) ▪ 200 mg의 홍삼분말을 3차 증류수(deionized water)에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 24시간 동안 용해. ▪ 약간 불투명한 홍삼분말 용액 생성 (완전히 용해되어 투명해지지는 않음) ▪ 이후 실험을 위하여 냉장 보관 (4℃). • 펩신 용액 (concentration : 4.0 mg/mL) ▪ 400 mg의 펩신 분말을 0.1M HCl에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 2시간 동안 용해. ▪ 약간 불투명한 펩신 용액 생성. 16. 2013년 기초연구과제총서.

(15) • 소장 효소 복합체 용액 ▪ 20 mg의 리파아제 분말, 40 mg의 판크레아틴 분말, 240 mg의 bile extract 분말을 0.1M NaHCO3에 첨가하고 volumetric flask를 이용하여 total volume을 100 mL로 조정 - Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 1시간 동안 용해. ▪ 연한 갈색의 약간 불투명한 소장 효소 복합체 용액 생성. • 사포닌 (Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 표준 용액 (concentration : 1.0 mg/mL) ▪ 각각의 표준물질 10 mg을 10 mL의 메탄올(HPLC grade)에 용해 ▪ 충분히 용해시킨 후 15 mL 코니칼튜브에 담아 냉장 보관 (4℃). 3.1.2. 액상 나노캡슐 제조 • 키토산 나노캡슐(Blank) 제조 ▪ Kaloti, M ., & Bohidar, H. B. (2010)에 의 하 면 “키 토 산 나 노 캡 슐 은 키 토 산 의 (+) charged amino group과 삼인산 나트륨의 (-) charged phosphate group 사이의 ionic gelation (extensive intermolecular crosslinking)에 의해 형성되며, 생성에 있어서의 결정 요인은 키토산 용액의 농도, 용액의 pH, 삼인산 나트륨과의 혼합 비율 등”임. [그림 3-1] 키토산 나노캡슐 형성 및 구조 출처 : Kaloti, M., & Bohidar, H. B. (2010). 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 17.

(16) [그림 3-2] 키토산 나노캡슐 형성 조건 출처 : Kaloti, M., & Bohidar, H. B. (2010). - 그러나, 낮은 키토산 용액의 농도(0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL)에서는 나노캡슐 형성 조건대로 수차례 제조를 시도하였으나 모두 coacervation이 발생하여 키토산 입자들이 침전 (precipitation)하는 현상이 발생하였음. [그림 3-3] 키토산 나노캡슐 형성시 coacervation 발생 기작 출처 : Kaloti, M., & Bohidar, H. B. (2010). - 따라서, 반복 실험을 통해 아래와 같은 최적의 생성 조건을 확립함. 18. 2013년 기초연구과제총서.

(17) ▪ 20 mL의 키토산 용액(2.0 mg/mL)을 magnetic stirrer를 이용하여 25℃, 350 rpm으로 계속 저어 주면서 10 mL의 삼인산 나트륨 용액(1.0 mg/mL) 10 mL를 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 분산시킴 (CS : TPP = 2 : 1) - 다 혼합한 후 30분 동안 같은 조건에서 계속 저어 주면 희미한 색의 약간 불투명한 키토산 나노캡슐 용액이 생성됨. [표 3-1] 키토산 나노캡슐(Blank)의 크기 및 정전기적 안정성 pH of solution. Diameter (nm). zeta potential (mV). 2.0. 153.97 ± 0.72. 32.37 ± 0.27. 3.0. 151.70 ± 1.06. 31.38 ± 0.40. 4.0. 145.37 ± 1.27. 33.47 ± 0.42. 5.0. 115.73 ± 1.27. 28.90 ± 0.55. 6.0. N.A. 16.04 ± 0.40. 7.0. N.A. 4.20 ± 0.09. ▪ 처음 키토산 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 pH 4.7, 24℃에서 142.47 ± 1.12 nm의 Blank 나노캡슐이 생성되며, 용액의 pH를 조절하면서 크기 및 정전기적 안정성을 측정한 결과는 [표 3-1]과 같음. ▪ Kaloti, M., & Bohidar, H. B. (2010)에 의하면 “키토산 나노캡슐은 pH 5.0 ~ 7.5 사이에서 농도 및 삼인산 나트륨과의 혼합 비율에 따라 coacervation이 발생하며, 형성된 coacervate droplet 들은 Oswald ripening에 의해 점점 크기가 커져서 침전(precipitation)하여 흰색의 침전물(sediment)을 형성”함 - 실제로 실험 과정에서도 pH 5.8 ~ 6.0 사이에서 상기 현상이 발생하여, pH 6.0 이후로는 입자 크기의 측정이 불가능하였음 - 이러한 경향은 키토산/변성 베타락토글로불린 이중 코팅 나노캡슐(Blank) 및 홍삼 추출물을 코어 물질로 포집하여 제조한 나노캡슐에서도 동일하였음. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 19.

(18) [그림 3-4] pH별 나노캡슐 용액의 투과도 (wave length : 570 nm). ▪ 각 나노캡슐 용액의 pH별 투과도를 측정한 결과는 [그림 3-4]와 같으며, pH 5.0 ~ 6.0 사이에서 coacervation이 발생하면서 투과도가 점점 떨어지는 것을 알 수 있음. - pH 7.0에서의 투과도가 pH 6.0보다 증가한 것은, 침전(sediment)이 더 compact 해 지면서 용액 중의 부유입자가 줄어들어 용액의 투명도가 증가했기 때문으로 추정됨. <조명을 켰을 때>. <조명을 껐을 때>. [그림 3-5] pH별 키토산 나노캡슐 용액. 20. 2013년 기초연구과제총서.

(19) ▪ [그림 3-5]에서 좌측에서 우측으로 갈수록 pH가 증가하며 pH 6.0 ~ 7.0의 키토산 나노캡슐 용액은 입자들이 침전하여 비교적 맑은 상태임을 알 수 있음 - 조명을 껐을 때 사진(우측)을 보면 pH 6.0 ~ 7.0의 용액에서 아래 부분의 흰 색 침전을 더 잘 관찰할 수 있음. • 키토산/변성 베타락토글로불린 나노캡슐(Blank) 제조 ▪ Lee, P. S., et. al. (2012)에 의하면 “베타락토글로불린의 등전점(Isoelectric point)은 pH 4.5에서 pH 5.0 사이에 있으며, 이 등전점을 계기로 낮은 pH에서 (+) charge를 띠던 입자들이 높은 pH로 갈수록 (-) charge를 띠게 됨”. ▪ Chen, L., & Subirade, M. (2005)에 의하면 “키토산 나노캡슐과 변성 베타락토글로불린은 ionic, hydrophobic interaction 및 hydrogen bonding에 의해 형성”되며, 따라서 용액의 pH가 pH 5.0 ~ 5.5 사이에 있을 때 가장 큰 zeta potential 차이를 갖게 되므로 이 조건에서 가장 compact 한 이중 코팅 나노캡슐을 형성할 것이라 추정할 수 있음. ▪ 그러나, 처음 제작된 시료들을 그대로 사용하여 상기의 키토산 나노캡슐이 생성되는 조건은 pH 4.7 이고 변성 베타락토글로불린은 pH 2.4 근처이므로 두 용액을 혼합하여 pH 5.0 ~ 5.5 상태를 만드는 것은 매우 어렵고, 또한 키토산 나노캡슐 용액과 변성 베타락토글로불린 용액의 혼합비율(CS/TPP : βlg = 1 : 2)을 지켜야 하므로 두 용액을 혼합 하였을 때 pH 범위가 pH 5.0 ~ 5.5 사이에 있도록 만드는 일은 현실적으로 매우 어려움 - 따라서, 반복 실험을 통하여 아래와 같은 최적 조건을 확립함. ▪ 1M NaOH 용액을 이용하여 변성 베타락토글로불린 용액의 pH를 5.5로 조정한 후, 20 mL의 키토산 캡슐용액을 magnetic stirrer를 이용하여 25 ℃, 350 rpm으로 계속 저어 주면서 40 mL의 변성 베타락토글로불린 용액(1.0 mg/mL)을 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 분산시킴 (CS/TPP : βlg = 1 : 2) - 다 혼합한 후 30분 동안 같은 조건에서 계속 저어 주면 희미한 색의 약간 불투명한 키토산/변성 베타락토글로불린 나노캡슐 용액 생성됨. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 21.

(20) [표 3-2] 키토산/변성 베타락토글로불린 나노캡슐(Blank)의 크기 및 정전기적 안정성 pH of solution. Diameter (nm). zeta potential (mV). 2.0. 157.47 ± 2.23. 31.12 ± 0.88. 3.0. 156.17 ± 0.60. 31.15 ± 0.45. 4.0. 115.67 ± 0.21. 30.21 ± 0.32. 5.0. 96.93 ± 0.67. 20.07 ± 0.62. 6.0. N.A. 8.96 ± 0.17. 7.0. N.A. 4.47 ± 0.38. ▪ 처음 키토산/변성 베타락토글로불린 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 pH 4.7, 23℃에서 149.00 ± 3.76 nm의 Blank 나노캡슐이 생성되며, 용액의 pH를 조절하면서 크기 및 정전기적 안정성을 측정한 결과는 [표 3-2]와 같음. • 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 제조 ▪ Rejinold, N. S., et. al. (2011)에 의하면 “사포닌 성분은 키토산의 (+) charged amino group과 사포닌의 (-) charged hydroxyl group 사이의 hydrogen bonding interaction에 의해 키토산 나노캡슐에 포집(loading)되며, 포집에 있어서의 결정 요인은 각 물질의 농도 비율”임 - 따라서, 상기의 실험 결과를 토대로 반복 실험을 통해 아래의 최적 생성 조건을 확립함. ▪ 키토산 용액(2.0 mg/mL) 20 mL를 magnetic stirrer를 이용하여 25℃, 350 rpm으로 계속 저어 주면서 홍삼 추출물 용액(2.0 mg/mL) 10 mL를 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 혼합한 후 (CS : RGE = 2 : 1), 10 mL의 삼인산 나트륨 용액(1.0 mg/mL) 10 mL를 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 분산시킴 (CS : TPP = 2 : 1) - 다 혼합한 후 30분 동안 같은 조건에서 계속 저어 주면 희미한 색의 약간 불투명한 키토산/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액 생성됨 - 이후 변성 베타락토글로불린으로 이중 코팅을 생성하는 방법은 상기에 언급된 과정과 동일함. 22. 2013년 기초연구과제총서.

(21) [표 3-3] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐의 크기 및 정전기적 안정성 pH of solution. Diameter (nm). zeta potential (mV). 2.0. 170.37 ± 2.02. 28.57 ± 0.37. 3.0. 170.97 ± 1.71. 29.05 ± 1.31. 4.0. 185.37 ± 1.61. 29.63 ± 0.83. 5.0. 106.60 ± 0.62. 17.33 ± 1.21. 6.0. N.A. 9.83 ± 0.39. 7.0. N.A. -1.05 ± 0.36. ▪ 처음 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 pH 4.7, 24℃에서 199.20 ± 34.59 nm의 나노캡슐이 생성되며, 용액의 pH를 조절하면서 크기 및 정전기적 안정성을 측정한 결과는 [표 3-3]과 같음. [그림 3-6] 조건별 나노캡슐의 크기 및 정전기적 안정성 비교. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 23.

(22) 3.1.3. 액상 나노캡슐의 이화학적 특성 평가 • 캡슐 형태 분석 ▪ 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐을 제작한 후 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscopy; TEM)을 이용하여 촬영한 사진은 아래와 같음. [그림 3-7] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 (생성시). ▪ 투과전자현미경을 통해 분석한 코어 물질이 포집된 나노캡슐은 타원형에 가까운 구형 입자이고, 100 nm 보다 작다고 추정되는 개별 나노캡슐(primary particle)이 약간 뭉쳐져(aggregated) 있는 형태임. 24. 2013년 기초연구과제총서.

(23) [그림 3-8] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 (In vitro 위장 조건 통과 후). ▪ In vitro 위장 조건을 통과한 나노캡슐은 처음 생성시 보다 약간 더 구별이 가능하도록 서로 떨어진 형태이며 TEM 사진으로 포착된 입자들은 50 nm 보다 더 작은 나노캡슐들로 추정됨 - 위장 조건을 통과하더라도 나노캡슐은 형태를 잘 유지하고 있으며 홍삼 추출물 코어 또한 생성시와 마찬가지로 잘 포집되어 있는 상태임. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 25.

(24) [그림 3-9] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 (In vitro 소장 조건 통과 후). ▪ In vitro 소장 조건을 통과한 나노캡슐은 홍삼 추출물 코어 물질이 빠져 나가 외곽 껍질만 남은 형태이며, 크기 또한 위장 조건 통과시와 마찬가지로 50 nm 보다 더 작은 나노캡슐들의 잔재로 추정됨. 26. 2013년 기초연구과제총서.

(25) • 캡슐화 효율 특성 측정 ▪ 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐의 캡슐화 효율(Encapsulation Efficiency)은 아래의 공식으로 측정할 수 있음. 캡슐화 효율 =. (처음 투입한 사포닌의 양 - 남아 있는 사포닌의 양) 처음 투입한 사포닌의 양. ⨉100. - 캡슐화 효율을 측정하기 위한 전처리 방법은 아래와 같음. ▪ 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액 제조 후 용액 10 mL를 초고속원심분리용 튜브(Ultra-centrifuge tube)에 담고 균형을 맞출 튜브에 동일한 무게의 물을 측정하여 담은 후 30,000 rpm, 24℃에서 30분간 초고속원심분리 실시함 (Optima. TM. LE-80K Ultracentrifuge, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA;. Rotor type 70 Ti, rmin 39.5 mm, rave 65.7 mm, rmax 91.9 mm, 23° slope) - 원심 분리가 끝나면 튜브 벽면에 붙은 침전물(sediment)과 상등액(supernatant)을 분리한 후 상등액은 추후 분석을 위해 15 mL 코니칼 튜브에 담아 냉장 보관함 (4℃). ▪ 홍삼 추출물 용액에 존재하는 사포닌(Ginsenoside Rb1 및 Rg1)의 양을 HPLC(High-performance liquid chromatography)를 이용하여 정량 분석한 후, 초고속원심분리를 통해 분리한 상등액에 존재하는 사포닌 양을 마찬가지로 정량 분석하면 두 양의 차이에 의한 캡슐화 효율을 측정할 수 있음 - 홍삼 추출물에 존재하는 사포닌 성분 중 Ginsenoside Rb1 및 Rg1을 정량 대상물질로 정한 것은, 홍삼 농축액 중 Ginsenoside Rb1 및 Rg1의 함유량 합이 0.8 ~ 34 mg/g 이상이 되어야만 식품의약품안전처에서 건강기능식품으로 인증을 받을 수 있는 등 홍삼 제품에서의 Ginsenoside Rb1 및 Rg1의 함유량이 중요하기 때문임 - 또한, 키토산/변성 베타락토글로불린 마이크로캡슐의 캡슐화 효율은 Lee, P. S., et. al. (2012)에 의해 “40%”정도 되는 것으로 구명 되었으나, 본 연구에서는 캡슐의 크기가 나노 사이즈로 Lee, P. S., et. al. (2012)의 연구와는 다르고, 또 Coomassie. ®. Blue dye(상품명:. Brilliant Blue)를 코어물질로 하여 각 조건별 방출량의 흡광도 측정에 의해 코어물질의 방출 특성을 구명한 Lee, P. S., et. al. (2012)의 연구와는 달리, 실제 식용으로 허가된 홍삼 제품을 이용하여 그 제품 속에 존재하는 사포닌의 양을 정량함으로써 캡슐화 효율을 측정해 보고자 하였음. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 27.

(26) ▪ 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1)을 이용하여 Standard curve를 작성하기 위해 HPLC를 이용하여 정량 분석한 조건 및 결과는 아래와 같음. ▪ HPLC assay condition (참고: 대한민국 식품공전, 2013) - column : HECTOR-T C18, 5 ㎛, 250 mm × 4.6 mm - column temperature : 30 ℃ - UV absorption wavelength : 203 nm - injection volumn : 50 ㎕ - flow rate : 1.0 mL/min - mobile phase (gradient elution). 28. time (min). A (Phosphoric acid, 0.2% v/v). B (Acetonitrile). 0. 80%. 20%. 5. 80%. 20%. 20. 77%. 23%. 25. 70%. 30%. 30. 60%. 40%. 35. 50%. 50%. 60. 15%. 85%. 62. 15%. 85%. 65. 80%. 20%. 70. 80%. 20%. 2013년 기초연구과제총서.

(27) [표 3-4] HPLC를 이용한 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 및 홍삼 추출물 용액 정량 분석 결과 Item Ginsenoside Rb1 (standard material). Ginsenoside Rg1 (standard material). 홍삼 추출물 Ginsenoside Ginsenoside 초고속원심분리 Ginsenoside Ginsenoside. Rb1 Rg1 후 Rb1 Rg1. concentration (mg/L; ppm) 0.100 1.000 10.000 100.000 500.000 1,000.000 0.100 1.000 10.000 100.000 500.000 1,000.000 2,000.000 20.20145 14.32072. retention time (min) N.A N.A 31.879 31.910 31.899 31.867 N.A N.A 23.559 23.583 23.535 23.543. area (mAU*s) N.A N.A 71.85708 541.78687 2,902.74463 5,772.24805 N.A N.A 36.68747 552.88721 3,119.78223 5,701.97217. 32.443 25.376. 113.06064 103.81265. N.A N.A. N.A 25.169. N.A 13.81227. <Ginsenoside Rb1>. <Ginsenoside Rg1>. [그림 3-10] Ginsenoside Rb1 및 Rg1 표준물질의 Standard curve 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 29.

(28) ▪ 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 정량 결과 작성된 Standard curve에 의해 실험에 사용된 홍삼 추출물 제품 속에 함유된 사포닌 함량을 측정한 결과, Ginsenoside Rb1은 약 20.20145 ppm, Ginsenoside Rg1은 약 14.32072 ppm 정도 함유된 것으로 판단됨 - 그러나, 실험에 사용된 HPLC 장비(Agilent Technologies 1200 Series HPLC system, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)로 Ginsenoside Rb1 및 Rg1 표준물질을 정량하는 과정에서 물질 함량이 1 ~ 10 ppm 사이의 어떤 지점에 이르면 검출 한계(Limit of detection; LOD)에 도달하는 것으로 판명되어, 초고속원심분리 후 상등액에 남아 있는 Ginsenoside Rb1 및 Rg1의 함량을 정량할 수 없었음. [그림 3-11] 홍삼 추출물 용액 중 Ginsenoside Rb1 및 Rg1 정량 결과 (HPLC). 30. 2013년 기초연구과제총서.

(29) [그림 3-12] 초고속원심분리 후 Ginsenoside Rb1 및 Rg1 정량 결과 (HPLC). ▪ HPLC 장비의 검출 한계로 인한 문제를 해결하기 위하여 홍삼 추출물 용액 중 함유된 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1)의 함량을 농축을 통해 증가시켜서 다시 측정하고자 하였으나, 원래의 홍삼 추출물 용액과 농축액 사이의 비율이 정확하게 맞지 않는 점과 고온 농축 과정 중 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1)의 변형 가능성 등 제한점이 존재하여 캡슐화 효율을 측정하기 위한 정량분석은 더 이상 진행하지 못하였음 - 식용으로 허가된 홍삼 제품 속에 미량으로 함유된 물질을 정량함에 있어 측정 장비로 인한 한계를 극복 또는 해결할 수 있는 방안에 대한 연구가 추후 더 이루어져야 할 것으로 사료됨. • 인공 위장/소장 조건에서 홍삼 추출물의 방출 특성 측정 ▪ 인공 위장/소장 조건(In vitro Gastric/Intestinal)에서 홍삼 추출물의 방출 특성을 측정하는 방법은 아래와 같음 - 인공 위장/소장 조건 배양을 위한 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액을 각각 20 mL 준비하여 삼각 플라스크에 넣고 20 mL의 PBS(Phosphate buffered saline) 용액과 혼합 (전체 시료 2개) - 2 mL의 펩신 용액(4.0 mg/mL)을 혼합한 후 1M HCl 용액을 이용하여 시료의 pH를 pH 2.0으로 조정. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 31.

(30) - 인공 위장 조건 배양 전 시료 3 mL를 채취하여 100℃ 물에 30초간 담구어 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 시료에는 PBS 용액 3 mL를 첨가하여 전체 시료의 양을 40 mL로 조절 - 배양기(shaking water bath)에서 37℃, 105 rpm(stroke)으로 1시간 동안 배양 - 인공 위장 조건 배양 중 1/5/10/30분 경과 후 시료 3 mL를 채취하여 100℃ 물에 30초간 담구어 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 시료에는 PBS 용액 3 mL를 첨가하여 전체 시료의 양을 40 mL로 조절한 후 계속 배양 - 위장 조건 배양이 종료되면, 1개 시료를 중탕기를 이용하여 100℃에서 30초 동안 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 인공 위장 조건 배양 중 채취한 시료 전체를 5,000 rpm, 24℃에서 7분 동안 원심분리(EPPENDORF Centrifuge 5810R, Eppendorf AG., Hamburg, Germany; Rotor F-34-6-38)하여 상등액을 분리, 각각 15 mL 코니칼 튜브에 넣어 추후 분석을 위해 냉장 보관 (4℃) - 나머지 시료 1개는 0.1M NaHCO3 용액을 이용하여 pH 5.3 으로 조정한 후 2 mL의 소장 효소 복합체 용액을 혼합 - 인공 소장 조건 배양 전 시료 3 mL를 채취하여 100℃ 물에 30초간 담구어 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 시료에는 PBS 용액 3 mL를 첨가하여 전체 시료의 양을 40 mL로 조절 - 1M NaOH 용액을 이용하여 시료의 pH를 pH 7.0 으로 조정한 후 배양기(shaking water bath)에서 37℃, 105 rpm(stroke)으로 2시간 동안 배양 - 인공 소장 조건 배양 중 1/5/10/30/60분 경과 후 시료 3 mL를 채취하여 100℃ 물에 30초간 담구어 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 시료에는 PBS 용액 3 mL를 첨가하여 전체 시료의 양을 40 mL로 조절한 후 계속 배양 - 소장 조건 배양이 종료되면, 시료를 중탕기를 이용하여 100℃에서 30초 동안 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후 코니칼 튜브에 담고, 인공 소장 조건 배양 중 채취한 시료 전체를 5,000 rpm, 24℃에서 7분 동안 원심분리(EPPENDORF Centrifuge 5810R, Eppendorf AG., Hamburg, Germany; Rotor F-34-6-38)하여 상등액을 분리, 각각 15 mL 코니칼 튜브에 넣어 추후 분석을 위해 냉장 보관 (4℃). ▪ 인공 위장/소장 조건 배양 후 나노캡슐에서 방출된 홍삼 추출물 코어에 함유된 사포닌 표준물질 (Ginsenoside Rb1 및 Rg1)을 HPLC를 이용하여 정량 분석한 조건은 상기와 동일하며 그 결과는 아래와 같음. 32. 2013년 기초연구과제총서.

(31) [표 3-5] 인공 위장/소장 조건 배양 후 HPLC를 이용한 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 정량 분석 결과 concentration (mg/L; ppm) 2,000.000. Item 홍삼 추출물 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 위장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside 인공 소장 조건 Ginsenoside Ginsenoside. Rb1 Rg1 0분 Rb1 Rg1 1분 Rb1 Rg1 5분 Rb1 Rg1 10분 Rb1 Rg1 30분 Rb1 Rg1 60분 Rb1 Rg1 0분 Rb1 Rg1 1분 Rb1 Rg1 5분 Rb1 Rg1 10분 Rb1 Rg1 30분 Rb1 Rg1 60분 Rb1 Rg1 120분 Rb1 Rg1. retention time (min). area (mAU*s). 32.443 25.376. 113.06064 103.81265. N.A N.A. N.A N.A. N.A N.A. N.A N.A. 32.444 N.A. 50.11745 N.A. N.A N.A. 32.449 N.A. 29.23374 N.A. N.A N.A. N.A N.A. N.A N.A. N.A N.A. 32.457 N.A. 45.55237 N.A. N.A N.A. 32.466 N.A. 76.68164 N.A. N.A N.A. 32.466 N.A. 76.68164 N.A. N.A N.A. N.A 23.113. N.A 62.18512. N.A N.A. N.A 23.215. N.A 48.88425. N.A N.A. N.A 23.156. N.A 43.88704. N.A N.A. N.A 23.099. N.A 58.25373. N.A N.A. N.A 23.100. N.A 37.53657. N.A N.A. N.A 23.103. N.A 43.06535. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 33.

(32) - HPLC를 통하여 검출된 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1)의 area가 처음 홍삼 추출물의 결과와 비교하여 더 작기는 하지만 인공 위장/소장 조건 배양 중 처음에는 검출이 안되다가 일관적으로 증가하는 경향을 보여주고 있지 못하므로 신뢰성 있는 결과라 판단하기는 어려움 - 또한, 203 nm의 UV absorption wavelength는 그 sensitivity가 매우 높은 파장이므로, 실제로 분석하기 원하는 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 뿐만 아니라 인공 위장/소장 조건 배양 중 첨가된 여러 가지 물질(PBS 용액, 각종 소화 효소 및 Bile salt 등)에 의해 영향을 받을 가능성 또한 매우 높으므로, 상기 HPLC 결과는 낮은 농도에서의 검출 한계 뿐만 아니라 이러한 요소들이 복합적으로 작용한 것에 기인한다고 판단됨 - 홍삼 추출물 정량 결과와 마찬가지로, 식용으로 허가된 홍삼 제품 속에 미량으로 함유된 물질의 인공 위장/소장 조건에서의 방출 특성을 구명함에 있어 측정 장비로 인한 한계를 극복 또는 해결할 수 있는 방안에 대한 연구가 추후 더 이루어져야 할 것으로 사료됨. 3.2. 분무건조를 통한 한방소재 나노캡슐분말 제조 3.2.1. 분무건조 조건 최적화 • 분무건조(spray drying) 조건 설정 ▪ Bastos, D. d. S., et. el. (2012)에 의하면 열풍을 이용한 “분무건조의 효율은 atomizing nozzle을 통과한 sprayed material과 건조 실린더 속의 drying air의 접촉 면적(contact area)에 의해 영향을 받음” - 일반적으로 분무건조의 구동 및 효율에 영향을 미치는 변수들은 흡입구 온도(inlet temperature), 배기구 온도(outlet temperature), 건조 시간(drying time), 유속(liquid flow), 공기 유 량(atomizing air flow), 유압(air pressure), 노즐 반경(diameter of the atomizing nozzle) 등이 있으며, 분무건조는 이러한 변수들을 조절해가면서 최적의 조건을 찾아내는 일련의 과정(trial and error)임. ▪ 본 실험에 사용된 분무건조기(EYELA Spray dryer SD-1000, TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD., Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)는 나노분말 제조용으로 특화된 나노분무 건조기가 아니므로 분무건조 후 회수(yield)된 분말은 나노 사이즈의 분말부터 마이크로 사이즈의 분말까지 넓은 범위에 걸친 분말상을 형성하였음. 34. 2013년 기초연구과제총서.

(33) - 나노분말 제조용으로 특화된 나노분무건조기(Nano spray dryer B-90, BUCHI Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)는 나노분말 형성 및 회수율이 일반적인 분무건조기와 비교하여 더 높을 것으로 예상되지만, 조사 결과 현재 우리 나라에는 해당 장비가 1대 판매되었을 뿐이고 또 판매처에서도 샘플 장비를 구비하고 있지 않는 등 장비 사용의 한계점으로 인해 본 실험에서는 해당 장비를 사용하지 못하였음. <EYELA Spray dryer SD-1000>. <Nano spray dryer B-90>. [그림 3-13] 타입별 분무건조기. ▪ 본 실험에 사용된 분무건조기(EYELA Spray dryer SD-1000, TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD., Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)는 장비의 구조상 적정 유속(liquid flow) 및 흡입구 온도(inlet temperature)의 한계가 있으며 atomizing nozzle 또한 조절이 불가능하므로, 이러한 제한 요인을 고려하여 반복 실험을 통해 설정한 분무건조의 최적 조건은 아래와 같음 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 35.

(34) - Inlet temperature : 175.00 ± 5.00 ℃ Outlet temperature : 85.00 ± 5.00 ℃ Liquid flow : 800 mL/h 3. Atomizing air flow : 0.50 ± 0.05 m /min Air pressure : 150 kPa Nozzle cleaning : every 5 min. 3.2.2. 나노캡슐분말 제조 • 나노캡슐분말 제조 ▪ 상기에 기술된 분무건조 조건에 의해 분무건조기를 구동하여 키토산/변성 베타락토글로불린/ 홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액으로부터 나노분말을 제조하였음 - 분무건조기 상단에 시료 용액을 흡입하는 흡입구가 있으며, 이 장치를 통해 시료 용액이 분무건조 실린더 안으로 이동하여 열풍을 이용한 건조를 거치게 됨. [그림 3-14] 분무건조기 및 건조분말 회수 지점. 36. 2013년 기초연구과제총서.

(35) ▪ 분무건조 과정 중 노즐이 위치한 주 실린더(main cylinder) 및 하단의 회수용기에는 분말이 점착되지 않았으며, 부 실린더(cyclone cylinder)로 연결된 통로와 부 실린더 하단 벽에 다량의 분말이 주로 점착되었고 일부 분말은 부 실린더 하단의 회수용기에 낙하하여 회수되었음 - 열풍 건조과정을 거치면서 생성된 분말은 캡슐 벽을 구성하는 성분인 키토산 및 변성 베타락토글로불린 고유의 점착성을 나타내어 실린더 및 회수용기 벽면에 점착된 건조분말을 용이하게 회수하기에 어려움이 있었음 - 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액 1,000 mL (키토산 분말 2.0 g, 베타락토글로불린 분말 1.0 g, 홍삼 분말 2.0 g 함유)를 상기 장비를 통해 분무건조하여 약 0.15 ± 0.05 g의 건조분말을 회수하였으며, 분무건조 전후의 성분 용량 차이는 용기 벽면 및 공기 필터(air cleaning filter)에 점착되어 분말이 소실된 것에 기인함 - 그러나, 이러한 낮은 건조분말 회수율(yield rate)은 장비 사용에 대해 기술적으로 해결하여야 할 문제이며 시료의 본질적 성질(characteristics)에 기인한 것은 아니므로, 기술적 해결책 고안을 통해 회수율을 높일 수 있는 방안을 강구하여야 할 것임. [그림 3-15] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노분말. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 37.

(36) 3.2.3. 나노캡슐분말의 이화학적 특성 평가 • 나노캡슐분말의 크기 및 형태 ▪ 분무건조를 통해 제조한 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노분말의 형태를 주사전자현미경(Scanning electron microscope; SEM) 장비(JSM-6390 SEM, JEOL USA, Inc., Peabody, MA, USA)를 이용하여 촬영한 사진은 아래와 같음. [그림 3-16] SEM 촬영한 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노분말. 38. 2013년 기초연구과제총서.

(37) - 분무건조 과정 중 용액 속에 분산되어 있던 나노캡슐이 뭉치면서(aggregation) 분말화 되는 과정을 거칠 것으로 예상하였는데, SEM 촬영 결과 이러한 가정대로 입자들이 대부분 뭉쳐져 있는 형태를 관찰할 수 있음 - 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 형성시 캡슐 크기는 199.20 ± 34.59 nm 정도로 측정이 되었고, TEM 촬영 결과 50 ~ 100 nm 크기의 타원형에 가까운 구형 입자임을 관찰하였는데, 분무건조 과정을 거친 후 SEM 사진을 보면 1 ㎛ 이상의 주름이 많이 잡힌 분말 입자화 된 것을 관찰할 수 있음 - 위 사진 중 형태가 잘 잡힌 타원형 입자의 경우도 약 800 ㎚ ~ 1 ㎛ 크기의 입자로 추정되며, 코팅 물질로 인한 직경 증가를 감안하더라도 최초 형성 당시보다는 크기가 더 커진 것을 알 수 있음 - 그러나, 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 형성시 측정한 크기도 측정 장비의 한계점은 분명히 존재하며, 특히 개별 단일 나노캡슐(primary particle)을 분리하여 정확히 크기를 측정할 수 있는 방법이 현재의 기술 수준으로는 한계가 있다는 점, 본 실험에 사용한 분무건조 장비가 나노분무건조 장비가 아니었다는 점 등을 감안하면 분무건조 과정을 거친 분말 입자 중 나노 사이즈의 분말이 전혀 없었다고 결론을 내릴 수 없음. [그림 3-17] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노캡슐 형성시 크기측정 자료. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 39.

(38) - 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노캡슐 형성시 크기측정 장비의 자료를 보더라도 약 100 ~ 200 ㎚ 범위에 대부분의 입자들이 분포하고 있음을 알 수 있지만, 정확히 어떤 값이 단일 나노캡슐(primary particle)의 크기인지 혹은 형성된 나노캡슐이 모두 같은 크기인지 아닌지 등을 구명할 수 있는 기술적 방법의 한계로 인해 현재로서는 평균적으로 어느 크기 범위의 입자들이 존재한다고 결론을 내리는 것이 가장 타당할 것임 - 이러한 관점에서, “분무건조 후 회수된 나노분말을 SEM으로 관찰한 결과 약 800 ㎚ ~ 2 ㎛ 범위의 입자들이 관찰되었다”라고 결론 내릴 수 있음. • 나노캡슐분말 재분산 후 크기 및 정전기적 안정성 측정 ▪ 분무건조를 통해 제조한 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노분말을 버퍼 용액에 재분산 시킨 후 나노캡슐의 크기 및 정전기적 안정성을 측정함 - 처음 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 생성시의 농도를 계산하여 나노분말 50 mg을 10 mL의 3차 증류수(deionized water)에 Magnetic stirrer를 이용하여 500 rpm으로 25℃에서 1시간 동안 용해 - 용해 후 pH 측정 결과, 25℃에서 pH 7.65 였으며 이 pH는 키토산 나노캡슐의 coacervation이 발생하는 영역으로, 실제 재분산 된 나노분말 용액을 관찰한 결과, 용기 하단에 침전 (sediments)이 발생하였으며 intensity가 매우 낮아 나노캡슐의 크기 및 정전기적 안정성을 측정할 수 없었음. [그림 3-18] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노분말 재분산 형태. 40. 2013년 기초연구과제총서.

(39) - 1M HCl 용액을 이용하여 시료 용액의 pH를 처음 형성시와 유사한 pH 4.90 으로 조절한 후 다시 나노캡슐의 크기 및 정전기적 안정성 측정을 시도하였음. [그림 3-19] pH 조절 후 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노분말 재분산 형태. - pH를 조절한 후 관찰한 결과, 처음 나노분말을 용액에 분산했을 때보다 혼탁도는 약간 감소했으며 용기 하단에 완전히 용해되지 않은 침전 물질(sediments)이 약간 남아 있기는 했으나 처음 보다는 많이 감소하였으며 외관상으로는 coacervation에 의한 침전이라기보다는 용액의 농도가 포화 상태에 이르러 더 이상 용해되지 않는 용질이 존재하는 것에 가까웠음. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 41.

(40) [그림 3-20] 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 나노분말 재분산 후 크기측정 자료. - 또한, pH를 조절한 후 크기를 측정한 결과 1,772.03 ± 130.80 nm 로 측정이 되었지만, 상기 자료에서 볼 수 있듯이 용액 속에는 190 nm 근처의 입자들도 분명히 존재하고 있는 것으로 미루어 보아 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노분말의 재분산 용액 속에는 완전히 분리되지 않고 뭉쳐져 있는(aggregated) 나노캡슐들이 많이 존재하는 것으로 추정됨 - 상기 용액의 정전기적 안정성은 30.94 ± 0.93 mV로 측정이 되어, pH 4.90 범위에서 처음 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐이 형성되었을 때와 마찬가지로 매우 안정된 상태로 분산되어 있음을 알 수 있음. 42. 2013년 기초연구과제총서.

(41) 3.3. 한방소재 나노분말의 대량생산 방안 탐색 • 분무건조(spray drying) 시스템 설계 ▪ 현재 일반적으로 사용되고 있는 분무건조 시스템은 아래와 같이 구성되어 있음. [그림 3-21] 분무건조 시스템 개요 출처 : BUCHI Labortechnik AG. (2012). Laboratory spray drying by BUCHI. Education material.. - Inlet에 흡입된 drying gas가 atomizing 및 가열된 후 nozzle을 통과한 sprayed material과 main cylinder에서 만나면 liquid solvent를 1차로 건조시키고, connector를 통과한 시료 (liquid droplet)는 다시 cyclone cylinder에서 회전하며 건조된 입자들(solute particles)을 떨어뜨린 후 outlet 으로 빠져나가는 구조임. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 43.

(42) - 그러나 이 구조는 시료 용액의 점도가 높을 경우 nozzle 조절이 어려울 수 있다는 점과 건조된 입자들의 점착성이 높을 경우 cylinder wall 및 product vessel에 점착된 yield products를 회수하기 어렵다는 단점 또한 지니고 있음 (낮은 yield rate 문제). ▪ 이에 비해 나노분말 제조를 위해 특화된 나노분무건조 시스템은 몇 가지 특징적인 요소들을 구비하고 있음. [그림 3-22] 나노분무건조 시스템 개요 출처 : BUCHI Labortechnik AG. (2012). Laboratory spray drying by BUCHI. Education material.. 44. 2013년 기초연구과제총서.

(43) - 우선, sprayed material을 분무하는 nozzle 및 spray head에서 liquid droplet을 마이크로 사이즈(㎛)로 조절하여 drying chamber로 내려 보내고, 일반적인 분무건조 시스템과는 달리 강한 air flow를 만들지 않고 drying gas를 laminar layer 형태로 구성함으로써 입자들의 뭉침(aggregation) 현상을 최소화 하며, drying chamber 하단에 collecting electrode를 배치하여 정전기적 유인(electrostatic charging)에 의해 분말을 고정시켜 회수하게 되므로 yield rate를 최대 90%까지 증가시킬 수 있음 - 나노분무건조 시스템의 효율성 및 활용(application)에 대해서는 주로 약물전달체(drug delivery system), 특히 코로 흡입(nasal inhalation)하거나 피부에 접촉(transdermal)하는 약제의 제조에 대해 많은 연구가 이루어졌고, 이외에도 나노 에멀션 및 나노결정체 (nanocrystals)의 캡슐화, 나노화 된 새로운 약제 첨가물(excipient), 나노 중합체 제조 등이 활용 가능한 분야로 전망되고 있음 (출처: Cordin Arpagaus. Nano Spray Dryer B-90: Literature review and applications. BUCHI Labortechnik AG) - 나노분무건조 시스템의 식품 분야에의 활용에 대해서는 아직 활발한 연구 및 진행이 이루어지지 않고 있으며, 이것은 우리 나라 뿐만 아니라 세계적으로도 나노기술 적용식품 분야가 이제 막 개념을 정립해 가는 태동기이기 때문인 것으로 사료됨. 그러나, 우리나라 식품의약품안전처에서 2015년까지 식품나노소재의 분류 및 검증방법에 대한 기준을 마련하여 나노기술 적용식품을 관리할 계획을 갖고 있는 등 향후 나노 기능성식품을 필두로 하여 나노기술 적용식품 분야가 새롭게 각광받는 분야로 부상할 가능성이 매우 크기 때문에, 식품소재 개발 및 제조기술의 일환으로서 나노분무건조 시스템에 대해 연구하고 적용 분야를 구상하는 것은 나름대로 큰 의미를 가진다고 할 수 있음. • 한방소재 나노분말의 대량생산 방안 ▪ 새로운 기술을 실제 산업 현장에 적용시켜 공정화 하고 시스템을 구축하는 것은 존재하는 수요에 부응하거나 혹은 새로운 수요를 창출해내는 과정과 밀접하게 연관되어 있음 - 특히 새로운 시설/장비 구축 및 도입에는 막대한 초기 자본투자가 필요하므로 비용 효율성 (cost efficiency) 측면 외에도 해당 기술 적용에 대한 지속가능성(sustainability), 수요의 예측(for product & technology), 제품 생산 공정 적용의 단가(unit cost) 등 여러 가지 요소들에 대한 검토가 필요함 - 나노분무건조 시스템 개발 및 생산 업체(BUCHI Labortechnik AG.)의 담당자 면담을 통해 조사한 바에 의하면, 해당 업체도 아직까지 식품 분야에의 적용에 대해 의뢰를 받거나 활발하게 검토한 적은 없으며 따라서 구체적인 적용 사례와 시스템 구성에 대한 모델은 없는 상황임. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 45.

(44) - 따라서, 본 연구를 통해 한방소재 나노분말의 대량생산 방안을 설계하고 확립하는 것에는 한계가 있으며, 지금 상황에서는 식품나노소재의 기술적 이점 및 향후 수요 예측에 대한 부분부터 접근해 나가는 것이 바람직할 것으로 사료됨 - 그러나, 앞서 언급했던 바와 같이 향후 나노기술 적용식품 및 식품나노소재에 대한 관심 및 이에 따른 수요가 증가할 가능성이 매우 높기 때문에, 기초 연구로서 식품나노소재 개발 및 활용에 대한 부분을 탐색하고 이를 실제 산업에 적용시키는 방안에 대해 연구하는 것 은 미래를 대비하는 선제적 대응으로서 큰 의미를 지니고 있음. 3.4. 시제품 생산 • 시제품 생산 ▪ 본 연구에서는 활용도가 높은 한방소재의 나노캡슐화 및 분말화 가능성에 대한 부분까지 구명하는 데 성공하였으나, 장비 활용의 한계로 인하여 시제품을 생산하는 과정은 진행하지 못하였으며, 향후 이 과정에 대한 더욱 활발한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료됨. 4. 요약 • 키토산 나노캡슐은 키토산의 (+) charged amino group과 삼인산 나트륨의 (-) charged phosphate group 사이의 ionic gelation (extensive intermolecular crosslinking)에 의해 형성되며, 생성에 있어서의 결정 요인은 키토산 용액의 농도, 용액의 pH, 삼인산 나트륨과의 혼합 비율 등임. • 처음 키토산 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 키토산 : 삼인산 나트륨 = 2 : 1의 비율로 pH 4.7, 24℃에서 142.47 ± 1.12 nm의 Blank 나노캡슐이 생성되며 pH 2.0 ~ 5.0 범위에서 +30 mV 근처의 매우 안정된 분산 상태를 보임. • 키토산 나노캡슐은 pH 5.8 ~ 6.0 사이에서 coacervation이 발생하여 침전하며 이러한 경향은 변성 베타락토글로불린 이중 코팅 나노캡슐의 경우에도 동일하였음. • 처음 키토산/변성 베타락토글로불린 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 키토산 : 변성 베타락토글로불린 = 1 : 2 비율로 pH 4.7, 23℃에서 149.00 ± 3.76 nm의 Blank 나노캡슐이 생성되며 pH 2.0 ~ 5.0 범위에서 +30 mV 근처의 매우 안정된 분산 상태를 보임. 46. 2013년 기초연구과제총서.

(45) • 처음 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐이 생성될 때의 조건은 키토산 : 홍삼 추출물 : 변성 베타락토글로불린 = 1 : 1 : 2 비율로 pH 4.7, 24℃에서 199.20 ± 34.59 nm의 나노캡슐이 생성되며 pH 2.0 ~ 5.0 범위에서 +17 ~ 29 mV 범위의 비교적 안정된 분산 상태를 보임. • 투과전자현미경을 통해 분석한 코어 물질이 포집된 나노캡슐은 타원형에 가까운 구형 입자이고, 100 nm 보다 작다고 추정되는 개별 나노캡슐(primary particle)이 약간 뭉쳐져(aggregated) 있는 형태이며, In vitro 위장 조건을 통과한 나노캡슐은 처음 생성시 보다 약간 더 구별이 가능하도록 서로 떨어진 형태이고 TEM 사진으로 포착된 입자들은 50 nm 보다 더 작은 나노캡슐들로 추정되며, In vitro 소장 조건을 통과한 나노캡슐은 홍삼 추출물 코어 물질이 빠져 나가 외곽 껍질만 남은 형태이고, 크기 또한 위장 조건 통과시와 마찬가지로 50 nm 보다 더 작은 나노캡슐들의 잔재로 추정됨. • 캡슐화 효율을 측정하기 위하여 실험에 사용된 HPLC 장비(Agilent Technologies 1200 Series HPLC system, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)로 Ginsenoside Rb1 및 Rg1 표준물질을 정량하는 과정에서 물질 함량이 1 ~ 10 ppm 사이의 어떤 지점에 이르면 검출 한계(Limit of detection; LOD)에 도달하는 것으로 판명되어, 나노캡슐 용액 초고속원심분리 후 상등액에 남아 있는 Ginsenoside Rb1 및 Rg1의 함량을 정량할 수 없었고, 이에 따라 캡슐화 효율을 측정하지 못하였음. • 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐의 인공 위장/소장 조건에서의 방출 특성 구명 또한 사포닌 표준물질(Ginsenoside Rb1 및 Rg1) 정량 한계의 문제로 신뢰성 있는 데이터를 얻지 못하였음. • 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐 용액을 최적 조건으로 설정된 분무건조 과정을 거친 후 주사전자현미경을 통해 관찰한 결과, 1 ㎛ 이상의 주름이 많이 잡힌 분말 입자화 된 것을 알 수 있었고, 비교적 형태가 잘 잡힌 타원형 입자의 경우도 약 800 ㎚ ~ 1 ㎛ 크기의 입자로 추정되며, 코팅 물질로 인한 직경 증가를 감안하더라도 최초 형성 당시보다는 크기가 더 커진 것을 알 수 있었음. • 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노분말을 버퍼 용액에 재분산시키고 pH를 4.90으로 조절한 후 크기를 측정한 결과 1,772.03 ± 130.80 nm 로 측정이 되었지만, 용액 속에는 190 nm 근처의 입자들도 분명히 존재하고 있는 것으로 측정된 결과로 미루어 보아 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노분말의 재분산 용액 속에는 완전히 분리되지 않고 뭉쳐져 있는(aggregated) 나노캡슐들이 많이 존재하는 것으로 추정되며, 용액의 정전기적 안정성은 30.94 ± 0.93 mV로 처음 키토산/변성 베타락토글로불린/홍삼 추출물 코어 나노캡슐이. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 47.

(46) 형성되었을 때와 마찬가지로 매우 안정된 상태로 분산되어 있음을 알 수 있었음. • 나노분무건조 시스템의 식품 분야에의 활용에 대해서는 아직 활발한 연구 및 진행이 이루어지지 않고 있으며, 이것은 우리 나라 뿐만 아니라 세계적으로도 나노기술 적용식품 분야가 이제 막 개념을 정립해 가는 태동기이기 때문인 것으로 사료됨. 그러나, 향후 나노 기능성식품을 필두로 하여 나노기술 적용식품 분야가 새롭게 각광받는 분야로 부상할 가능성이 매우 크기 때문에, 식품소재 개발 및 제조기술의 일환으로서 나노분무건조 시스템에 대해 연구하고 적용 분야를 구상하는 것은 나름대로 큰 의미를 가진다고 할 수 있음. • 본 연구를 통해 한방소재 나노분말의 대량생산 방안을 설계하고 확립하는 것에는 한계가 있었으며, 지금 상황에서는 식품나노소재의 기술적 이점 및 향후 수요 예측에 대한 부분부터 접근해 나가는 것이 바람직할 것으로 사료됨. 5. 참고문헌 Bastos, D. d. S., Gonçalves, M. d. P., Andrade, C. T. d., Araújo, K. G. d. L., & Rocha Leão, M. H. M. d. (2012). Microencapsulation of cashew apple (Anacardium occidentale, L.) juice using a new chitosan–commercial bovine whey protein isolate system in spray drying. Food and Bioproducts Processing, 90(4), 683-692. Chen, L., & Subirade, M. (2005). Chitosan/β-lactoglobulin core–shell nanoparticles as nutraceutical carriers. Biomaterials, 26(30), 6041-6053. Janes, K. A., & Alonso, M. J. (2003). Depolymerized chitosan nanoparticles for protein delivery: Preparation and characterization. Journal of Applied Polymer Science,. 88(12), 2769-2776. Janes, K. A., Fresneau, M. P., Marazuela, A., Fabra, A., & Alonso, M. a. J. (2001). Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin. Journal of Controlled. Release, 73(2–3), 255-267. Kaloti, M., & Bohidar, H. B. (2010). Kinetics of coacervation transition versus nanoparticle formation in chitosan–sodium tripolyphosphate solutions. Colloids. and Surfaces B: Biointerfaces, 81(1), 165-173.. 48. 2013년 기초연구과제총서.

(47) Lee, P. S., Yim, S. G., Choi, Y., Van Anh Ha, T., & Ko, S. (2012). Physiochemical properties and prolonged release behaviours of chitosan-denatured β-lactoglobulin microcapsules for potential food applications. Food Chemistry, 134(2), 992-998. Lefevre, T., & Subirade, M. (2000). Molecular differences in the formation and structure of fine-stranded and particulate beta-lactoglobulin gels. Biopolymers, 54(7), 578-586. Li, L., Zhang, J.-l., Sheng, Y.-x., Guo, D.-a., Wang, Q., & Guo, H.-z. (2005). Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high-performance liquid chromatography-UV method. Journal of Pharmaceutical. and Biomedical Analysis, 38(1), 45-51. Mao, H.-Q., Roy, K., Troung-Le, V. L., Janes, K. A., Lin, K. Y., Wang, Y., August, J. T., & Leong, K. W. (2001). Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency. Journal of Controlled Release, 70(3), 399-421. Rejinold, N. S., Muthunarayanan, M., Muthuchelian, K., Chennazhi, K. P., Nair, S. V., & Jayakumar, R. (2011). Saponin-loaded chitosan nanoparticles and their cytotoxicity to cancer cell lines in vitro. Carbohydrate Polymers, 84(1), 407-416.. 나노기술을 이용한 고미제어/기능성 향상 한방소재 개발 연구 및 대량생산 방안 탐색. 49.

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