SCGB 1 발효 청국장 추출물에 의한 항염증 활성 및 염증성 질환 억제 효과

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Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 발효 청국장 추출물에 의한 항염증 활성 및 염증성 질환 억제 효과

김소연¹*․이경복^2,3*․조영호⁴․정도연⁵․양희종⁵․류명선⁵․유영춘^1,3

1건양대학교 의학과 미생물학교실, ²건양대학교 의학과 생화학교실

3건양대학교 명곡의과학연구소, ⁴건양대학교 의료공과대학 제약생명공학과

5(재)발효미생물산업진흥원

Inhibitory Effect of the Extract of Cheonggukjang Fermented with Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 on LPS-Induced

Inflammation and Inflammatory Diseases

So Yeon Kim¹^*, Kyung Bok Lee^2,3^*, Young Ho Cho⁴, Do Youn Jeong⁵, Hee Jong Yang⁵, Myeong Seon Ryu⁵, and Yung Choon Yoo^1,3

1Department of Microbiology, College of Medicine, ²Department of Biochemistry, College of Medicine,

3Myunggok Medical Research Institute, and ⁴Department of Pharmaceutics & Biotechnology, College of Medical Engineering, Konyang University

5Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

ABSTRACT Cheonggukjang is a Korean fermented food. Cheonggukjang has many biological activities such as anticancer and antioxidant effects. In this study, we investigated the anti-inflammatory effect of the hot water extract (SCGB 1) of cheonggukjang fermented with Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 (KCCM11964P) on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. We examined the effect of the cheonggukjang extract on septicemia and gastritis induced by LPS and HCl/EtOH, respectively in mice. Treatment of SCGB 1 significantly inhibited inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), tumor-necrosis factor (TNF)-α, and interleukin-6 (IL-6) in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Its anti-inflammatory effect was confirmed by inhibition of the expression of mRNAs of inducible NO synthase, TNF-α, and IL-6. In addition, SCGB 1 inhibited activation of mitogen-activated protein kinases (MAPK) and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB). In an in vivo experiment, oral administration of SCGB 1 significantly suppressed the lethal septic shock induced by LPS injection in mice. Furthermore, mice given SCGB 1 showed significant inhibition of severe gastritis induced by HCl/EtOH in mice. Taken together, SCGB 1 is an excellent material to inhibit inflammation and inflammatory diseases.

Key words: B. amyloliquefaciens SCGB 1, anti-inflammatory activity, sepsis, gastritis, signal transduction

Received 13 April 2020; Accepted 28 May 2020

Corresponding author: Yung Choon Yoo, Department of Microbiol- ogy, College of Medicine, Konyang University, Daejeon 35365, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-42-600-8694

*These authors contributed equally to this work.

Author information: So Yeon Kim (Graduate student), Kyung Bok Lee (Professor), Young Ho Cho (Professor), Yung Choon Yoo (Professor)

서 론

최근 소비자들의 식생활 패턴이 서구화되어 가고 있으며, 이러한 식문화의 급격한 변화는 현대인들에게 영양의 편중 과 영양부족과 같은 영양학적 불균형을 초래할 수 있어 이를 극복하고자 건강에 유익한 기능성 소재와 식품에 대한 관심

이 높아지고 있는 추세이다(Lyn 등, 2007). 건강문제에 대 한 관심은 신체 건강에 유익한 천연소재 및 식품에 대한 관 심으로 확대되고 있으며, 특히 식물성 한약재와 약용식물 유래 생리활성 및 면역 기능성 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Jang 등, 2004).

면역 기능을 조절하는 면역계는 외부에서 항원이 침입했 을 때 우리 몸을 보호하는 방어 수단으로 작용한다. 이때 주로 관여하는 세포는 대식세포인데 이러한 대식세포는 항 원이 침입하는 초반에 작용하여 항원을 제시하는 등 선천면 역을 담당한다(Iontcheva 등, 2004). 활성화된 대식세포는 nitric oxide(NO)와 각종 사이토카인을 생성함으로써 병원 체나 유해균 등의 활성을 억제하는 생체방어 기능을 담당한 다(Yoon 등, 2009). NO는 박테리아, 바이러스, 진균 및 기 생충과 같은 병원균에 대한 숙주의 자연 면역 반응에 필수적

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이다(Diefenbach 등, 1998). 또한 대식세포가 인터루킨-6 (IL-6)와 종양괴사인자(TNF-α) 등을 포함한 전염증성 사이 토카인도 면역반응 초기단계의 생체방어에 중요한 역할을 한다. 하지만 NO, IL-6 및 TNF-α 등 염증매개인자를 과도 하게 생성, 분비할 경우 대식세포는 염증세포로서 염증성 질환을 일으키는 중요한 원인이 된다. 따라서 염증반응에서 이들 염증매개인자의 생산억제는 염증성 질환의 치료에서 매우 중요한 목표가 된다(Heo 등, 2010; Stokes 등, 2002).

패혈증은 그람음성균에서 유래하는 LPS와 같은 세균 내 독소 혹은 그람양성균 유래 세포벽 성분들에 의해 야기되는 전신 반응으로, toll-like receptor 분자와 같은 다양한 숙주 세포 수용체와 상호작용하고 IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증 성 사이토카인의 생성을 유도하여 빠른 시간 내에 장기부전 또는 사망에 이르게 하는 질병이다(Carrillo-Vico 등, 2005).

또한 위염은 위부에서 다양한 증상을 초래하는 염증성 질환 으로 위 점막에 형성되는 염증반응이 중요한 원인이 된다 (Oh 등, 2012).

2001년 세계보건기구(WHO)와 국제식량기구(FAO)의 합 동전문가위원회에서 probiotics를 ‘살아있는 미생물로서 적 당한 양을 섭취하면 건강에 유익한 세균을 포함한 식이보충 제’라고 정의하였으며(Ganguly 등, 2011), 대두에는 oligo- saccharide, lactitol, lactulose 등과 같은 유용성분이 함유 되어 있어 건강에 유익한 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2005;

Yang 등, 2013).

한편 청국장은 대두 발효 식품류로서 영양적 및 경제적 가치가 높은 전통식품이다(Roberfroid, 2000). 또한 청국장 은 원료인 대두가 가지는 영양기능 외에도 항암 효과, 항산 화 효과, 면역 기능 등과 같은 다양한 생리학적 기능을 가지 고 있는 것으로 알려져 있다(Shon 등, 2000; Hwang 등, 2009; Okamoto 등, 1995). 청국장은 발효할 때 사용하는 균주의 종류와 특성에 따라 다양한 생리활성이 발현되는 것 으로 보고되어 있다(Choo 등, 2017). 본 연구에서는 발효 고추장에서 분리한 Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 (KCCM 11964P)으로 발효한 청국장의 생리활성을 조사하 기 위하여 청국장 추출물의 항염증 활성과 염증성 질환에 대한 억제 효과를 측정하였다.

재료 및 방법

시약 및 항체

RAW 264.7 세포 배양배지는 Dulbecco’s modified Ea- gle’s minimum essential medium(DMEM, Welgene, Se- oul, Korea)을 사용하였다. Fetal bovine serum(FBS)과 penicillin/streptomycin은 Gibco BRL Life Technolo- gies(Grand Island, New York, USA)에서, LPS(Escher- ichia coli O111:B4)와 methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) 은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구매한 제품을 사용하였다. MAPK(MAP kinases) 경로 활성화 측

정을 위해 사용한 항체 phospho-p38(P-p38), p38, phospho-ERK(extracellular signal-regulated kinase; P- ERK), ERK, phospho-JNK(c-Jun-terminal kinase; P- JNK), JNK 및 NF-κB 활성화 측정을 위한 항체 phospho-I κB(inhibitor of kappa B, P-IκB) 및 IκB는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA) 제품을 사용하였다. House keeping 단백질 β-actin의 항체는 Santa Cruz Biotech- nology(Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였다.

SCGB 1의 제조

청국장 제조에 사용된 대두는 전북 순창군에서 수확되는 백태를 구입하여 사용하였으며, 균주는 (재)발효미생물산업 진흥원(Sunchang, Korea)이 보유하고 있는 전통발효 고추 장에서 분리된 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 가지는 Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 균주를 사용하였다.

청국장은 백태 3.5 kg을 24시간 동안 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거하고 autoclave에서 121°C로 30 분간 증자하였다. 증자된 백태는 40°C 이하로 냉각시킨 후 Luria-Bertani(LB, KisanBio, Seoul, Korea) 배지(tryp- tone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%)에서 30°C, 24시간 배양한 배양액을 백태 전 무게의 0.5%(v/w) 로 접종 및 혼합하였다. 발효 조건은 37°C에서 80% 습도로 36시간 동안 진행하였다. 제조된 청국장을 추출하기 위하여 발효가 끝난 청국장을 60°C에서 48시간 건조한 후 파쇄하 여 청국장 분말 시료로 사용하였다. 청국장 분말시료의 10 배수 증류수를 이용하여 80°C에서 3시간 열수 추출을 진행 하였고, 저온 감압농축 하여 동결건조 후 분말화하여 열수 추출물 시료(SCGB 1으로 명명함)로 사용하였다. 열수 추출 물의 수율은 39%임을 확인하였다.

세포배양

마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양을 받아 사용하였고, DMEM에 10%

FBS, 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 배양배지에서 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 계대배양은 세포가 80~90% 정도의 밀도가 되었을 때 실시하였다.

세포독성 측정

세포독성은 MTT assay를 통해 측정하였다. RAW 264.7 세포(1×10⁴ cells/well)를 96-well plate에 100 μL씩 넣고 8시간 안정화시킨 후 SCGB 1을 여러 농도(31.25, 62.5, 125 μg/mL)로 처리하여 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 15시간 배양하였다. 그 후 LPS를 100 ng/mL의 농도로 첨 가 후 24시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 각 well당 10 μL씩 첨가하여 2시간 추가 배양하고 원심분리 하여 상등액을 제거하였다. 그 후 각 well에 di- methyl sulfoxide를 100 μL씩 첨가하여 생성된 formazan 을 녹이고 20분간 교반하여 microplate reader(ELx 800-

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Table 1. Sequences of the primers for PCR

Primer Sequence

iNOS Sense Anti-sense

5′-GTAGTGACAAGCACATTTGG-3′

5′-GGCTCCACTTTTCACTCTGC-3′

TNF-α Sense Anti-sense

5′-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3′

5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′

IL-6 Sense Anti-sense

5′-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3′

5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′

β-Actin Sense Anti-sense

5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′

5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′

PC, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군에 대한 처리군의 흡 광도 비를 백분율로 표시하여 계산하였다.

NO 및 사이토카인 정량

세포 배양액 내의 NO 농도는 Griess 시약으로 측정하였 다. RAW 264.7 세포를 5×10⁴cells/well로 48-well plate 에 분주하고 37°C, 5% CO2 조건에서 8시간 안정화시켰다.

그 후 SCGB 1을 여러 농도로 첨가하여 15시간 배양하였고, LPS(100 ng/mL) 처리 후 24시간 배양하였다. 이후 원심분 리 하여 상등액을 얻은 후 Griess 시약을 40 mg/mL의 농도 로 well당 50 μg씩 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 다 음, microplate reader(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 표 준곡선을 이용해 정량하였다. 상등액 내의 TNF-α와 IL-6 의 분비량은 ELISA kit(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)을 이용하여 정량하였고, microplate reader를 이용 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

iNOS, IL-6 및 TNF-α mRNA 분석

6-well plate에 RAW 264.7 세포(5×10⁵ cells/well)를 분주하고 앞선 실험들과 동일한 조건에서 배양하였다.

SCGB 1을 12시간 전처리한 세포에 LPS(100 ng/mL)를 6 시간 처리 후 원심분리기를 통해 상등액을 제거하고 RNA를 TRIzol reagent(iNtRON Biotechnology, Lynnwood, WA, USA)를 사용하여 분리하였다. 정량한 RNA로부터 cDNA synthesis kit(Power cDNA synthesis kit, iNtRON Bio- technology, Kirkland, WA, USA)을 이용하여 cDNA를 합 성하였다. iNOS, IL-6, TNF-α, β-actin에 대한 PCR pri- mer는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에서 구매하여 사 용하였다. 각각에 대한 primer sequence는 Table 1과 같으 며, 각 밴드는 Chemiluminescence Imaging System(BD Bioscience)을 사용하여 분석하였다.

Western blot analysis

mRNA 분석실험과 동일한 조건에서 RAW 264.7 세포 (1×10⁶ cells/well)에 SCGB 1을 처리한 후 LPS(100 ng/

mL)를 10분간 자극하였다. 세포 상등액을 제거하고 차가운

PBS로 세척한 다음 50 mM Tris-HCL(pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, protease 및 phosphatase inhibitor cocktail을 포함하는 lysis buffer로 세포를 용해시켰다. BCA protein assay kit(Sigma-Ald- rich Co.)으로 단백질 농도를 정량한 후 30 μg의 lysate를 10% SDS-PAGE에서 전개시켰다. 분리한 단백질을 poly- vinylidene difluoride membrane(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 2시간 동안 전사시켰다. 이후 5%

탈지유 용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고, P- p38, p38, P-ERK, ERK, P-JNK, JNK, P-IκB 및 IκB에 대한 항체인 rabbit monoclonal antibodies(BD Biosci- ence)를 1:5,000으로 희석하여 각각 반응시켰다. 2차 항체 로는 horseradish peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG를 1:5,000으로 희석하여 사용하였고, 상온에서 2시간 반응시 킨 후 TBST(TBS containing 0.05% Tween-20)로 5분씩 총 8회 세척한 다음 ECL 기질과 반응시켜 각각의 단백질 밴드를 Chemiluminescence Imaging System(BD Biosci- ence)을 이용하여 분석하였다.

패혈증 억제실험

패혈증 실험에는 C57BL/6(암컷, 7주령) 마우스(Raon Bio, Yongin, Korea)를 사용하였다. Non-treated 그룹(정 상군)과 LPS만을 주사한 그룹(Control군) 및 SCGB 1을 2 mg 혹은 5 mg/mouse로 1일 1회씩 3일간 경구 투여한 그룹 등 총 4개의 그룹으로 나누어 그룹당 8마리의 마우스를 사 용하였다. SCGB 1 전처리 후 LPS를 500 μg씩 정맥주사 하였다. 주사 2시간 후 그룹당 3마리씩 무작위로 선별하여 혈액을 채취하여 혈중 사이토카인(IL-6, IL-1β, TNF-α) 측정에 사용하였다. 나머지 그룹당 5마리씩의 마우스로는 survival test를 진행하였다. LPS 주사 후 12시간마다 생존 율과 체중을 측정하였다. 동물실험은 건양대학교 동물실험 위원회의 규정에 따라 수행되었다(승인번호 18-05-A-01).

항위염 실험

마우스를 이용한 항위염 실험은 ICR(수컷, 3주령) 마우스 (Raon-Bio)를 사용하였다(Yang 등, 2013). 그룹은 미처리 그룹(정상군)과 위염만 유발시킨 그룹(Control군) 및 SCGB 1을 2 mg 혹은 5 mg/mouse로 7일간 1일 1회 경구 투여한 그룹 등 총 4개의 그룹으로 나누어 그룹당 5마리의 마우스 를 사용하였다. 위염은 150 mM HCl/EtOH을 마우스당 200 mL씩 경구 투여하여 유발하였다. HCl/EtOH 투여 1시간 후 희생시켜 위를 절제한 다음 위의 손상 정도를 확인하였고 1 cm²대비면적을 Image J program(National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)을 통해 그래프로 나타내었 다. 동물실험은 건양대학교 동물실험위원회의 규정에 따라 수행되었다(승인번호 18-07-A-01).

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0 20 40 60 80 100 120 140 160

Control 31.25 62.5 125

SCGB 1 (μg/mL)

Cell viability (%) .

Fig. 1. Effect of the extract of cheonggukjang fermented with Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 on cell viability in RAW 264.7 cells. Cells were treated with the indicated doses of the fermented cheonggukjang for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay.

** ** **

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

Control 31.25 62.5 125

SCGB 1 (μg/mL)

NO (μM) .

A

**

*

0 100 200 300 400 500 600 700

Control 31.25 62.5 125

SCGB 1 (μg/mL)

TNF-α (pg/mL) .

B

**

***

0 200 400 600 800 1000 1200

Control 31.25 62.5 125

SCGB 1 (μg/mL)

IL-6 (pg/mL) .

C

Fig. 2. The effect of the extract of cheonggukjang fermented with B. amyloliquefaciens SCGB 1 on the production of NO (A), TNF-α (B), and IL-6 (C). RAW 264.7 cells were pre-treated with the indicated doses of the extract of SCGB 1 for 15 h, then treated with LPS for 24 h. The level of NO and cytokines was determined using Griess reagent and ELISA kit respectively. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with the control (LPS-treated group) by Student’s two-tailed t-test.

통계처리

모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 통계 학적 유의성은 Student’s two-tailed t-test 혹은 Log- rank(Mantel-Cox) test를 이용하여 P<0.05 수준 이상에서 검증하였다.

결과 및 고찰

세포독성 평가

RAW 264.7 세포에 대한 SCGB 1의 세포독성을 MTT

assay를 통해 측정하였다. Fig. 1에서 나타난 결과와 같이 SCGB 1은 125 μg/mL의 농도까지 cell viability에 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 이후의 실험에 서는 독성을 나타내지 않는 125 μg/mL 농도 이하에서 실시 하였다.

NO, TNF-α 및 IL-6 생성량 측정

NO와 TNF-α 및 IL-6는 대식세포가 분비하는 물질로 NO는 정상적인 농도로 분비되면 혈관 확장제로 작용하여 혈관 항상성을 유지하는 기능을 하는 반면, 과도하게 분비되 면 급성 및 만성 염증 반응을 야기한다(Stokes 등, 2002;

Xue 등, 2018). TNF-α와 IL-6는 염증성 사이토카인의 종 류로 LPS 등에 의해 자극되면 분비량이 증가하여 염증성 면역질환과 같은 질병을 일으킨다(Yi 등, 2019). 청국장 추 출물인 SCGB 1의 항염증 활성을 조사하기 위하여 SCGB 1을 세포독성을 유발하지 않는 여러 농도로 전처리한 후, LPS를 자극을 통해 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포의 배양액으로부터 NO, TNF-α 및 IL-6의 분비량을 측정하였 다. 그 결과 SCGB 1을 처리한 세포의 NO 생성량이 control 군과 비교하여 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. TNF-α 와 IL-6 분비량 또한 SCGB 1을 처리하였을 때 control군에 비해 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 2).

iNOS와 TNF-α 및 IL-6 mRNA 발현 측정

SCGB 1을 처리한 세포에서 NO와 사이토카인 분비가 감

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LPS (100 ng/mL) Doses of SCGB 1 (μg/mL) SCGB 1

- - -

+ - -

+ 31.25

+ + 62.5

+ + 12.5

+

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Normal Control 31.25 62.5 125

SCGB 1 (μg/mL)

TNF-α/β-actin .

IL-6 TNF-α iNOS β-actin

⁰

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

SCGB 1 (μg/mL)

IL-6/β-actin .

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

SCGB 1 (μg/mL)

iNOS/β-actin .

Fig. 3. Effect of the extract of cheonggukjang fermented with B. amyloliquefaciens SCGB 1 on the expression of iNOS, TNF-α, and IL-6 mRNA in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were pre-treated with the indicated doses of the extract of SCGB 1 before LPS stimulation. The level of iNOS, TNF-α, and IL-6 mRNA expression was determined by RT-PCR as described in Materials and Methods. The data are the representative of three different experiments showing the similar results.

소하였으므로, SCGB 1에 의한 염증매개인자의 억제 활성 이 iNOS와 TNF-α, IL-6의 mRNA의 발현을 억제하는 과정 에서 유도되는 것인지 확인하였다. 이들 mRNA 유전자는 RT-PCR을 이용해 cDNA를 합성한 후 PCR로 유전자 발현 을 증폭시키는 RT-PCR법을 통해 확인하였다. 그 결과 SCGB 1을 농도별로 처리하였을 때 LPS만을 처리한 con- trol군에 비해 TNF-α와 IL-6의 mRNA 발현이 현저하게 감소하였으며, NO를 생합성하는 iNOS의 mRNA 또한 현저 하게 감소하는 것으로 확인되었다(Fig. 3). 염증 과정에서 세포 내 NO 합성 효소(iNOS)의 활성화에 의해 많은 양의 전염증성 인자인 NO가 생성되며(Kim 등, 2007), 또한 TNF -α나 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 mRNA의 발현이 증가하여 이들 사이토카인의 생성과 분비가 촉진되게 된다 (Yi 등, 2019). Fig. 2와 Fig. 3의 결과로부터 SCGB 1에 의한 염증매개인자 생성의 억제는 NO 합성효소인 iNOS를 비롯하여 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6에 대해 mRNA 수준에서의 억제에 의해 유도된다는 것을 확인하였 다.

MAPK 및 NF-κB 활성화 측정

MAPK는 면역세포가 자극되면 활성화되는 세린-트레오 닌 활성화 효소로서 활성화되면 염증성 사이토카인의 생성

을 유도하며, 이 MAPK의 인산화효소 유전자로는 JNK, p38, ERK1/2 등이 존재한다(Lu 등, 2012). NF-κB는 염증반응 에 중요한 역할을 하는 전사 유전자 단백질로서 이 단백질의 활성화는 IκB 키나아제(IKK) 신호 복합체를 통해 두 개의 중 요한 세린 잔기에서 IκB의 인산화를 유도한다(La 등, 2010).

이러한 NF-κB가 과도하게 활성화되면 염증반응이 악화되 고 다양한 자가 면역질환을 유발한다. 평상시에는 IκB와 결 합되어 불활성화된 상태로 존재하는데 LPS 등의 자극에 의 해 세포가 활성화되면 IκB가 인산화되면서 NF-κB는 유리 된 상태가 되고 핵으로 전위되어 표적 유전자의 프로모터 부위에 결합하여 iNOS, COX-2, IL-6, TNF-α와 같은 염증 매개체의 전사를 유도한다(Kim 등, 2007; Lu 등, 2012).

따라서 본 실험에서는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 SCGB 1을 전처리한 후 JNK, p38, ERK1/2의 인산화를 조 사하여 MAPK 신호전달을 억제하는지, 또한 IκB의 인산화 저해를 통해 NF-κB의 활성화가 억제되는가를 조사하였다.

그 결과 JNK와 p38에서 LPS만 처리한 세포에 비해 MAPK 신호전달이 확연하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.

4). 하지만 ERK에서는 신호전달 억제가 확인되지 않았다.

또한 SCGB 1은 IκB의 인산화를 억제하여 NF-κB의 활성화 를 저해하는 기전을 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이 들 결과는 SCGB 1에 의한 항염증 효과는 MAPK 중 JNK와

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- - -

+ - -

+ 31.25

+ + 62.5

+ + 125

+

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

SCGB 1 (μg/mL)

p-ERK/ERK .

p-ERK ERK p-JNK JNK p-P38 P38 β-actin

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

SCGB 1 (μg/mL)

P-JNK/JNK .

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

SCGB 1 (μg/mL)

P-p38/p38 .

Fig. 4. Inhibition of MAPK activation by the extract of cheonggukjang fermented with B. amyloliquefaciens SCGB 1 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were pre-treated with the indicated doses of the extract of SCGB 1 for 15 h and then stimulated with LPS. After 10 min incubation, total cellular proteins were resolved on 10% SDS-PAGE. Quantification of MAPK was measured by western blotting assay. Actin was used as an internal control. The data are the representative of two different experiments showing the similar results.

p38 분자의 인산화와 NF-κB의 활성화 억제를 통해 매개된 다는 것을 시사한다.

패혈증 억제 효과

LPS를 자극한 RAW 264.7 염증세포를 이용한 세포 수준 의 항염증 실험에서 SCGB 1이 높은 항염증 활성을 갖는 것으로 확인되어, 이러한 항염증 활성이 in vivo 실험에서도 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 패혈증과 위염 등 마우 스 염증성 질환모델을 통해 분석하였다. 패혈증은 염증성 사이토카인이 통제되지 않고 과다한 생성으로 인해 유발되 는 치명적인 급성염증이다(Liu 등, 2018). 본 실험에서는 패혈증에 대한 SCGB 1의 억제 효과를 조사하기 위하여 LPS 투여를 통한 마우스 패혈증 모델을 이용하였다. LPS를 500 μg/mouse로 주사하고 12시간마다 생존율을 확인하였 다. LPS 주사 후 12시간까지 그룹당 100%의 생존율을 보였 지만 24시간 후부터 LPS만 주사한 그룹은 생존율이 급격히 감소하였고, 결국 36시간이 지난 시점에서는 모든 마우스가 사망하였다(Fig. 6). 반면 SCGB 1을 2 mg/mouse로 투여한 그룹에서는 12시간마다 한 마리씩 사망하여 최종적으로는

60시간 후에 40%의 생존율을 보이며 유의한 억제 효과를 나타내었고, 5 mg/mouse로 처리한 그룹에서는 최종 60%

의 생존율로 보다 높은 유의성을 나타내었다. 이 결과는 SCGB 1 청국장 추출물은 투여량에 의존하여 패혈증을 예방 하는 효과가 있는 것을 의미한다. 한편 패혈증에 의한 치명 적인 염증반응은 LPS 투여에 의해 생성되는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인의 폭발적인 혈중 농 도 증가가 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Liu 등, 2018).

본 실험에서는 SCGB 1에 의한 패혈증 억제 효과가 이들 사이토카인 혈중 농도의 폭발적 상승 억제와 연관이 있는가 를 확인하였다. 마우스에 LPS를 처리한 2시간 후의 TNF- α, IL-6 및 IL-1β 혈중 농도를 정량하여 SCGB 1 투여에 의한 사이토카인 생성 억제 효과를 측정한 결과, 이들 사이 토카인 모두 LPS만 처리한 control군에 비해 SCGB 1 투여 군에서 농도 의존적으로 현저히 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 7). 이 결과는 SCGB 1 청국장 추출물은 LPS 처리에 의해 폭발적으로 증가하는 염증성 사이토카인의 분비를 저 해하여 치명적인 패혈증을 억제하는 것으로 판단되었다. 또 한 이들 사이토카인은 모두 대식세포로부터 생성되는 사이

(7)

- - -

+ - -

+ 31.25

+ + 62.5

+ + 125

+ P-IκB

IκB β-actin

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2

SCGB 1 (μg/mL)

p-IκB/β-actin .

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

SCGB 1 (μg/mL)

IκB/β-actin .

Fig. 5. Inhibition of NF-κB activation by the extract of cheonggukjang fermented with B. amyloliquefaciens SCGB 1 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were treated with the extract of SCGB 1 prior to LPS similarly with the experiment of Fig. 4. Total cellular proteins of the cells were harvested 10 min after LPS stimulation, and resolved on 10% SDS-PAGE as described in Materials and Methods. Actin was used as an internal control. The data are the representative of two different experiments showing the similar results.

0 20 40 60 80 100 120

0 12 24 36 48 60

Times after LPS challenge (h)

Survival rate (%) .

LPS only SCGB 1 (2 mg) SCGB 1 (5 mg)

**

*

Fig. 6. Inhibitory effect of the extract of cheonggukjang fer- mented with B. amyloliquefaciens SCGB 1 on LPS-induced le- thal sepsis in mice. Groups of five mice were orally fed with the extract of SCGB 1 (2 or 5 mg/mouse) for 3 days prior to LPS injection. Survival rates were monitored for 60 h after LPS challenge. ^*P<0.05, ^**P<0.01, compared with the control (LPS- treated group) by Log-rank (Mantel-Cox) test.

토카인으로 RAW 264.7 대식세포를 이용한 세포 수준에서 의 항염증 활성 실험 결과와 일치하며, SCGB 1은 패혈증 모델에서 LPS 자극에 의해 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등 염증 성 사이토카인의 폭발적 분비를 초래하는 대식세포의 활성 화를 억제하여 패혈증에 의한 치명적 사망을 억제하는 것으 로 추정되었다.

항위염 효과

패혈증 외의 또 다른 염증성 질환에 대한 SCGB 1의 in vivo에서의 억제 효과를 조사하기 위하여 마우스 위염모델 을 이용하여 검토하였다. 위염은 패혈증과 유사하게 염증반 응에 의해 유발되는 위 조직에서의 염증반응으로, 알코올과 같은 자극원에 의해 급성위염이 발생하면 위 점막에 염증이 생기고 혈반이 형성되어 스크레치와 같은 병변을 만들게 된 다(Yang 등, 2013). In vivo 위염모델은 ICR 마우스에 HCl/

EtOH을 경구 투여하여 급성위염을 유발시키는 프로토콜로 진행했으며, HCl/EtOH 투여 한 시간 후에 위를 절제하여 위 점막의 손상 정도를 면적으로 계산하였다. SCGB 1의 투여 는 HCl/EtOH을 처리하기 전에 7일 동안 2 mg 혹은 5 mg씩 경구 투여하였다. 그 결과 SCGB 1을 전처리한 그룹에서는 HCl/EtOH만 투여한 급성위염 그룹에 비해 유의하게 위 손 상을 억제하였으며, SCGB 1에 의한 항위염 효과는 투여량 에 의존하는 것으로 관찰되었다(Fig. 8). 따라서 SCGB 1은 치명적인 패혈증뿐만 아니라 급성 위염에 대해서도 매우 높 은 억제 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

요 약

청국장은 한국 고유의 발효식품이다. 이러한 청국장은 항암, 항산화 효과 등 많은 효능을 가지고 있다. 본 연구에서는 전통 발효 고추장에서 분리되어 항균 활성과 프로바이오틱

(8)

*

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Control 2 5

SCGB 1 (mg/mouse)

IL-6 (pg/mL) .

A

0 **

100 200 300 400 500 600 700 800

Control 2 5

SCGB 1 (mg/mouse)

IL-1β (pg/mL) .

B

0 **

200 400 600 800 1000 1200

Control 2 5

SCGB 1 (mg/mouse)

TNF-α (pg/mL) .

C

Fig. 7. Determination of IL-6, IL-1β, and TNF-α in serum of LPS-injected mice. Two hours after LPS injection, serum speci- mens were obtained from three mice of each group, and the level of the indicated cytokines were determined by ELISA kits.

*P<0.05, ^**P<0.01 compared with the control (LPS-treated group) by Student’s two-tailed t-test.

*

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000

Normal Control 2 5

SCGB 1 (mg/mouse)

Size of blood spots (% of control) .

Fig. 8. Inhibitory effect of the extract of cheonggukjang fermen- ted with B. amyloliquefaciens SCGB 1 on HCl/EtOH-induced gastritis in mice. Groups of five mice were administered orally with the extract of SCGB 1 (2 or 5 mg/mouse) for 7 days prior to HCl/EtOH treatment. The size of blood spots was calculated by Image J program. The photographs show the representative of each group. ^*P<0.01 compared with the control (HCl/EtOH- treated group) by Student’s two-tailed t-test.

스 작용을 가지는 Bacillus amyloliquefaciens SCGB 1 균 주를 사용하여 발효한 청국장의 열수 추출물을 이용하여 대 식세포 RAW 264.7에 대한 항염증 효과와 LPS로 유발시킨

마우스 패혈증 모델 및 HCl/EtOH로 유발시킨 급성 위염모 델에서 항염증 효과를 조사하였다. 그 결과 SCGB 1 청국장 열수 추출물은 독성이 없는 농도에서 염증유발인자 NO는 물론 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6를 현저하게 억 제하였으며, 이들 염증매개인자의 생성과 관련된 iNOS 효 소와 TNF-α 및 IL-6 사이토카인의 mRNA 발현을 현저하 게 억제하는 것으로 관찰되었다. 또한 세포 내 신호전달 기 전을 해석하기 위한 실험에서 SCGB 1 추출물은 MAPK 중 JNK와 p38 분자의 인산화를 억제하였으며, IκB의 인산화를 차단하여 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 확인할 수 있었 다. 패혈증 마우스 모델에서 SCGB 1 추출물 투여군은 TNF- α, IL-6 및 IL-1β 등 염증성 사이토카인의 혈중 농도를 유의 하게 억제하여 유의한 생존율 상승 효과를 나타내었다. 한편 위염 모델에서도 SCGB 1 추출물은 HCl/EtOH에 의한 급성 위염에 대해 위점막의 염증반응을 현저하게 억제하는 것으 로 확인되었다. 이들 결과를 종합해보면 SCGB 1 청국장 열수 추출물은 높은 항염증 활성을 지니며, 염증관련 면역질 환의 예방 및 증상개선에 유효한 식소재인 것으로 사료된다.

감사의 글

이 논문은 2018년도 미래창조과학부(과제번호 2018003 119) 한국연구재단-전통문화융합연구사업과 건양대학교 명곡학술연구비(명곡 2017-08) 지원에 의해 수행되었음.

(9)

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