Korean J Clin Lab Sci. 2011, 43(4) : 194 - 204 ISSN 1738-3544
서 론
간섬유화의 진행 기전을 규명하거나 간섬유증 또는 그 후
에 발생하는 간경변증을 정상으로 되돌리기 위한 새로운 치 료제의 효과를 규명하기 위해서는 전임상 실험단계로 간섬 유증 또는 간경변증의 동물실험 모델의 확립이 필수적이다.
실험동물을 이용한 간섬유화 실험에서는 인체에서와 같이 간섬유화를 일으키는 알코올이나 간염바이러스를 주입하는 실험동물 모델을 그대로 적용하기가 쉽지 않아서 그 대신 일 반적으로 간 독성을 일으키는 약물주입이나 담관결찰법에 의 한 간섬유화 유발 실험동물 모델을 사용하고 있다.
간경변증은 간섬유화 과정을 거쳐 진행한다. 간세포가 손상을 받으면 쿠퍼세포가 이를 탐식하고 여러 사이토카인 을 분비하며, 이 사이토카인은 간성상세포(hepatic stellate cells)를 증식 및 활성화시킨다. 활성화된 간성상세포는 콜
Comparison of Histopathological Changes on the Three Drugs of Carbon Tetrachloride, Dimethylnitrosamine, Thioacetamide, and Bile Duct Ligation
used for Induction of Liver Fibrosis in Rat
Jung-Hun Kim, Mi-Jung Park, Yo-El Kim, Jin-Yeong Kim, Jin-Hee Sin, Su-Young Park, and Seung-Joo Jekal
Department of Clinical Laboratory Science. Wonkwang Health Science University, Iksan 570-750, Korea
This study was carried out to compare the histopathological differences of liver lesions in carbon tet- rachloride (CCI4), dimethylnitrosamine (DMN), thioacetamide (TAA) and bile duct ligation (BDL)-in- duced rats. CCl4, DMN and TAA were administered intraperitoneally and conducted bile duct ligation for 4 weeks to induce hepatic fibrosis. Indices of liver cell injury (steatosis, hydropic degeneration, bile duct hyperplasia, hemorrhage & hemosiderin deposition), the extent of liver fibrosis (fibrotic area) and the rate of regeneration (number of PCNA-positive cells) were investigated in each group. Liver tis- sues were stained with hematoxylin-eosin (HE), sirius red, prussian blue and immunostained with α-smooth muscle actin (α-SMA), transforming growth factor-β1 (TGF-β1), proliferative cell nuclear antigen (PCNA), and quantified using a computerized image analysis system. Liver cell steatosis was sig- nificantly increased in CCl4 and TAA groups, and hydropic degeneration and bile duct hyperplasia were significantly increased in TAA and BDL groups when compared with that in normal control, respectively.
Fibrosis area was significantly increased in all four groups, especially in CCl4 group. Correlation between α-SMA and TGF-β1 expressions in four groups was good. Hemorrhage area in liver parenchyma was significantly increased in DMN group only when compared with that in normal control, while hemo- siderin deposition area was significantly increased in TAA and BDL groups as well as DMN group. The Number of PCNA-positive cells was significantly increased in all four groups, especially in TAA group.
These results indicate that the duration and methods of hepatotoxic drug treatment are very important factors to make plans for animal experimentation on the induction of hepatic fibrogenesis in rats.
Key Words : Hepatic fibrosis, Rat, CCl4, DMN, TAA, BDL
Corresponding Author : Jekal, Seung-Joo, Department of Clini- cal laboratory science, Wonkwang Helath Science University, Iksan 570-750, Korea
Tel: 063-840-1215 E-mail: [email protected]
본 연구는 2011년도 원광보건대학교 연구지원에 의하여 연구되었으 며 이에 감사드립니다.
Received : 13 NOV 2011
Return for modification : 28 NOV 2011 Accepted : 1 DEC 2011
라겐을 합성하여 손상 부위에 세포외기질(extracellular ma- trix: ECM)을 축적시키고 이 세포외기질에 지속적으로 축적 된 콜라겐에 의해 간섬유화가 이루어진다(Gressner, 1992;
Li와 Friedman, 1999; Niemela, 1994).
간성상세포는 전체 간 구성세포 중 약 15% 정도를 차지 하며, 비타민 A의 전구물질인 레티노이드(retinoid)를 저장 하고 있는 세포이다. 간 손상 후 간성상세포가 활성화되면 α-SMA-양성의 근섬유모세포(myofibroblast)로 분화되어 콜라겐의 분비가 증가됨으로써 간섬유화가 진행된다(Fried- man 등, 1993). 간성상세포의 활성화 과정에는 TGF-β1.
PDGF, FGF 등의 사이토카인들이 작용하여 간섬유화에 중 요하게 기여하는 것으로 알려져 있다(Mitsue 등, 1995; De Bleser, 1996).
간염바이러스나 다른 간염 이후에 일어나는 사람의 간섬 유화에 가까운 동물실험 모델로는 흰쥐나 생쥐에 CCl4 (car- bon tetrachloride), DMN (dimethylnitrosamine), TAA (thio- acetamide)의 3가지 독성 약물을 주입하여 간섬유화를 유도 하는 방법이나(Mitsue 등, 1995; De Bleser, 1996; De Bleser 등, 1997; Friedman와 Bissell, 1990; Lieber, 1999), 담관결찰 법(bile duct ligation, BDL)을 이용한 간섬유화 동물실험 모 델(Tarcin 등, 2011)이 자주 사용되고 있다.
그러나 이들 약물들과 담관결찰에 의한 간섬유화 동물실 험 모델들에서 발생하는 형태학적 간손상 지표들과 기간에 따른 간섬유화 정도의 차이가 있어서 실험자들 사이에 사용 방법에 따라 조직병리학적 결과를 해석하는데 서로 다른 견 해를 보이는 경우를 많이 경험하게 된다.
따라서 본 실험의 목적은 이들 3가지 간독성 약물들과 담 관결찰법에 의해 발생하는 간섬유화의 정도와 형태학적 간 손상 지표들을 조사하여 간섬유화 유도방법에 따른 차이를 비교하기 위하여 시도하였다.
재료 및 방법
1. 실험동물 및 약물처리
본 연구 실험동물로는 체중 160-180 g 내외의 건강한 Sprague-Dawley 계통 수컷 흰쥐(주식회사 샘타코, 경기도
오산, 한국) 25마리를 구입하여 동물 사육실에서 표준사료 와 물을 공급하면서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였 다. 흰쥐 25마리를 5마리씩 나누어 정상군, CCl4군, TAA군 DMN군 그리고 BDL군의 다섯 군으로 구분하여 실험에 사 용하였다.
CCl4군은 1주에 2일 간격으로 3회 체중 kg당 1 mL의 CCl4/olive oil (1:1)를 4주간 복강 내 주사하였고, TAA군은 TAA를 생리식염수에 녹여 1주에 2일 간격으로 3회 체중 kg 당 300 mg을 4주간 복강 내 주사하였다. DMN군은 DMN을 생리식염수에 녹여 1주에 3일간 연속하여 3회 체중 kg 당 10 μL를 4주간 복강 내 주사하였다. BDL군은 ketamine hy- drochloride (100 mg/kg)와 xylazine hydrochloride (20 mg/
kg) 혼합액을 복강을 통하여 주입하여 마취한 후, 쥐의 상 복부 정중선에서 3 cm 길이로 절개하여 담관을 노출시킨 후 봉합사로 총담관의 분지부와 췌장 상부에 인접한 총담 관의 두 부위를 결찰하여 4주간 두었다. 비교를 위하여 나 머지 5마리는 1주에 2일 간격으로 3회 생리식염수를 4주간 복강 내 주입하여 정상대조군으로 사용하였다. 동물 실험은 원광보건대학 동물윤리심의위원회에서 정한 동물실험 관리 및 사용에 관한 규정에 따라 수행하였다.
2. 조직학 및 면역조직화학 염색
10% 중성완충포르말린에 고정된 간조직을 일반적인 방 법에 따라 파라핀에 포매한 후 회전식 박절기(Shandon, England)를 이용하여 4 μm 두께로 연속절편을 제작하고 일 반 슬라이드와 POLYSINETM 슬라이드 (Thermo Scientific, USA)에 붙인 다음 60℃의 슬라이드 건조기에서 1시간 건 조시킨 후 자일렌에 탈파라핀, 하강 계열 알코올 단계를 거 쳐 물에 함수한 후 다음 hematoxylin-eosin 염색을 시행하 여 지방변성, 수성변성, 출혈, 담관증식의 일반적인 조직변 화를 관찰하였고, 간섬유화 양상과 콜라겐의 정량을 위해 Sirius red 염색을 하였으며, 혈철소 침착량을 측정하기 위 해 Prussian blue 염색을 하였다. 또한 활성간성상세포의 증 식과 간섬유화에 관여하는 성장인자의 분비 상태 그리고 손 상 후 간세포의 증식능을 평가하기 위해 α-SMA, TGF-ß, PCNA에 대한 면역조직학염색을 하였다. Sirius red와 Prus- sian blue 염색 과정을 간략히 요약하면 다음과 같다. Sirius
red 염색은 Lopez-De Leon와 Rojkind (1985)의 방법을 약 간 수정하여 절편은 0.1% fast green(saturated picric acid에 용해)에 3분, 0.1% sirius red F3B용액(saturated picric acid 에 용해)에 1시간 염색한 후 5% acetic acid에 2회 세척하 고 탈수, 투명 및 봉입하였고, Prussian blue 염색은 Perls 의 방법을 사용하여 2% potassium ferrocyanide와 1% HCl 을 동량 혼합한 용액에 30분간 염색한 후 nuclear fast red 용 액으로 5분간 대조염색하여 수돗물에 헹군 후 탈수, 투명 화하여 permount로 봉입하였다(전국임상병리교수협의회, 2009). Sirius red F3B, fast green, potassium ferrocyanide 및 nuclear fast red는 모두 Sigma (St. Louis, Mo, USA) 제품 을 사용하였다.
α-SMA, TGF-ß, PCNA 면역조직화학염색은 습윤챔버 를 사용하여 수기로 시행하였다. 그 과정을 간단히 요약하 면 절편을 수세 후 조직 내인성 과산화효소의 활성을 차단 하기 위해 Hydrogen Peroxide Block (Thermo Scientific, USA)로 10분간 반응시킨 후, Tris buffer saline (ScyTex lab- oratories, Utah, USA)으로 세척한 다음 비특이적 반응을 차 단하기 위해 Ultra V Block (Thermo Scientific, USA)에 옮겨 20분간 작용시켰다. 이어 일차 항체로 mouse anti-human α-SMA monoclonal antibody (Clone 1A4; 1:400; Dako, A/S; Grostrup, Denmark)와 rabbit anti-human TGF- ß polyclonal antibody (sc-146; 1:50; Santa Cruz, USA), mouse anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen monoclonal antibody (Clone PC10; 1:200; Dako, A/S; Grostrup, Den- mark)를 각각 30분간 반응시킨 다음 Tris buffer saline로 적 당히 세척하고 UltraVision LP Detection System HRP-poly- mer (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 30분간 반응시켰 다. 그 후 DAB로 5분간 발색시킨 후 Gill’s hematoxylin으로 대조염색하고 탈수, 투명을 거쳐 permount로 봉입하였다.
3. 조직병리학적 변화의 정량분석
지방변성, 수성변성, 출혈, 담관증식, 콜라겐 함량, 혈 철소 침착, α-SMA-양성세포와 TGF-ß-양성세포의 면 적 그리고 PCNA-양성세포 수의 9가지 변화를 정량적으 로 비교하기 위해 영상분석 프로그램(Image-Pro® Plus ver 4.5, Media Cyberbetics Inc., Georgia, USA)을 사용하여 분
석하였다. 분석방법은 영상분석기에 부착된 디지털 카메라 를 이용하여 현미경 100배와 400배에서 이미지를 획득한 후 지방변성, 수성변성, 출혈부위, 콜라겐 함량, 혈철소 침착, α-SMA-양성세포와 TGF-ß-양성세포는 면적을 측정하 여 백분율을 산출하였고, 담관 수와 PCNA-양성세포는 1 mm2 당 세포수를 구하였다.
4. 통계분석
각 군 사이의 차이를 비교하기 위하여 일원분산분석 (one-Way ANOVA test)를 하였으며, 사후검정을 위해 터 어키 다중 검사(Turkey multiple test)를 시행하였다. 모든 결과는 평균과 표준오차로 표현하였으며, p 값이 0.05 이하 이면 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다. 분석에는 SPSS ver 10.1 패키지 프로그램을 사용하였다.
실험 결과
1. 지방변성, 수성변성 면적 및 담관 수의 비교
4군에서의 지방변성 면적을 조사한 바 정상대조군(Fig.
1A)에 비해 CCl4군이 가장 많이 증가하였지만 그 증가면적 이 2%를 넘지 않았으며, 그 다음으로 TAA군, BDL군 DMN 군 순으로 증가하였으나 정상대조군에 비해 CCl4군과 TAA 군만 각각 통계학적으로 의의 있게 증가하였다(p<0.001, p<0.01) (Fig. 1B). 특히 TAA군에서는 5마리 중 1마리에서 는 지방변성세포들과 융합되면서 세포의 괴사가 함께 진행 되어 매우 커다란 공포를 형성하고 있는 경우도 관찰되었 다. 수성변성의 경우 정상대조군에 비해 TAA군만 통계학 적으로 의의 있게 증가하였으며(p<0.001), CCl4, DMN, BDL 군은 정상대조군에 비해 약간의 증가는 있었으나 통계학적 의의가 없었다(Fig. 1C). 담관 수는 정상대조군에 비해 BDL 군이 가장 많이 증가하였고 통계학적으로 의의가 있었으며 (p<0.001), CCl4, DMN, TAA군도 정상대조군에 비해 약간씩 증가하였으나 통계학적인 의의는 없었다(Fig. 1D).
2. 섬유화 면적, α-SMA-양성 및 TGF-ß1-양성 면 적의 비교
4군에서 sirius red염색을 한 결과 CCl4군의 경우 섬유화
면적이 확장되어 뚜렷한 섬유사이막(fibrous septa)을 만들 면서 문맥과 문맥 사이의 섬유성 가교(portal-portal bridg- ing fibrosis)와 문맥과 중심정맥 사이의 섬유성 가교(por- tal-central bridging fibrosis)를 형성하였다. DMN군에서는 문맥부위의 확장과 함께 섬유화가 진행되어 부분적으로 섬 유사이막을 만들고 있지만 문맥과 문맥 사이와 문맥과 중심 정맥 사이에 뚜렷한 섬유성 가교를 만들지 못하였으나 동굴 모세혈관벽을 따라 콜라겐이 증가되고 있는 것이 관찰되었 다. TAA군은 문맥부위의 확장과 함께 콜라겐이 증가되어
문맥주변으로 뻗어나가 있으나 섬유화 정도가 약하고 섬유 사이막이 뚜렷하지 않아 섬유성 가교의 형성도 미약하였다.
BDL군에서는 문맥과 문맥주변부로부터 담관 수의 뚜렷한 증가와 함께 주로 담관을 따라 섬유화가 일어났으나 뚜렷한 섬유성 가교는 만들지 못하였다(Fig. 2A).
섬유화 면적은 정상대조군에 비해 4군 모두에서 증가 하였는데 CCl4군이 가장 많이 증가하였고 다음으로 DMN, BDL, TAA군 순으로 증가하였으며 4군 모두 통계학적으 로 매우 의의 있게 나타났다(p<0.001, p<0.001, p<0.001, FIG. 1. Histopathological changes and morphometric quantitiative analysis results of liver sections stained with hematoxylin and eosin. (×100). Liver samples were taken from rats treated with CCl4 (i.p., 1 mL/kg three times weekly), DMN (i.p., 10 μL/kg three times weekly), TAA (i.p., 200 mg/kg twice weekly) and BDL for 4 weeks. Each value represents the mean ± SE (n=5). **p <0.01 and ***p <0.001 compared with normal control rats.
FIG. 2. Histopathological changes and morphometric quantitiative analysis results of liver sections stained with sirius red and immunostained with α-SMA and TGF-β1. (×100). Liver samples were taken from rats treated with CCl4, DMN, TAA and BDL for 4 weeks. Each value represents the mean ± SE (n=5). **p <0.01 and ***p <0.001 compared with normal control rats.
p<0.01)(Fig. 2B).
활성간성상세포 의 관찰을 위해 α-SMA 면역염색한 결 과 정상대조군의 경우 α-SMA 양성반응이 혈관의 평활근 세포, 문맥부위 혈관의 혈관벽에서만 관찰되었으나 4군의 실험군에서는 혈관의 평활근세포, 문맥부위 혈관의 혈관벽 이외에 동굴모양혈관벽과 섬유사이막 부위에서 α-SMA 양 성세포가 출현하였고, 주로 문맥 주변으로 뻗어 나간 섬유 사이막을 따라 분포하였으며, 이들 세포들은 세포질로부터 길고 가는 돌기를 내어 같은 종류의 주변 세포들과 연결 구 조를 형성하였다 (Fig. 2A). α-SMA 염색표본에서 α-SMA 양성반응 부위 및 세포의 분포 면적을 화상 분석한 결과 정상대조군에 비해 4군 모두에서 α-SMA-양성세포 면적 이 증가하였는데 CCl4군이 가장 많이 증가하였고 다음으로 DMN, BDL, TAA군 순으로 증가하였으며 4군 모두 정상대 조군에 비해 통계학적으로 매우 의의 있는 결과를 나타내 었다(p<0.001, p<0.001, p<0.001, p<0.001)(Fig. 2C). 또한 α-SMA-양성세포의 출현 부위는 섬유화 부위와 일치하였 고, 4군의 α-SMA-양성세포의 면적 증가 순서도 섬유화 면 적의 증가와 일치하는 결과를 나타내었다. 뿐만 아니라 활 성간성상세포의 콜라겐 생성을 촉진하는 성장인자인 TGF- ß1 면역염색결과 정상대조군에 비해 4군 모두에서 TGF- ß1-양성세포의 면적이 증가하였으며 통계학적으로 정상 대조군에 비해 CCl4군과 BDL군만 매우 의의 있는 차이를 나 타내었고(p<0.001, p<0.001), DMN군과 BDL군은 통계학 적으로 차이가 없었다(Fig. 2D).
3. 출혈부위와 혈철소 침착 면적의 비교
4군에서의 출혈부위 면적은 CCl4군과 BDL군의 경우 정 상대조군과 차이가 없었고 TAA군은 정상대조군에 비해 다 소 증가하였으나 통계학적인 차이가 없었으며, 정상대조군 에 비해 DMN군만 통계학적으로 매우 의의 있게 증가하 였다(p<0.001)(Fig. 1E). 혈철소 검출을 위한 Prussian blue 염색결과 HE염색에서 섬유사이막을 따라 출현하는 흑갈 색 침착부위 일치하여 청색의 양성부위가 나타났고 대부분 세포밖에 침착되어 있었으며 확장된 섬유사이막에 존재하 는 일부 활성간성상세포들 그리고 소수의 간세포 또 쿠퍼 세포(kupffer cells) 내에서도 관찰되었다(Fig. 3A). Prussian
blue-양성부위 면적을 영상분석한 결과 정상대조군에 비 해 CCl4군에서 혈철소-양성 침착의 면적이 약간 증가하였 으나 통계학적인 의의가 없었고, DMN, TAA, BDL군은 정 상대조군에 비해 통계학적으로 매우 의의 있게 증가하였으 며(p<0.001, p<0.001, p<0.001). 3군 중 DMN군에서 혈철 소-양성 침착부위가 가장 높게 증가하였다(Fig. 3B).
4. 증식세포(PCNA-양성세포) 수의 비교
간 손상 후 세포 재생능을 보기 위해 PCNA 면역염색을 한 결과 PCNA-양성세포는 간세포와 문맥부위나 섬유사 이막에 출현하는 난원형세포와 방추형세포 그리고 담관상 피세포에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 4A). 영상분석 결 과 정상대조군에 비해 4군 모두에서 통계학적으로 의의 있 게 증가하였으며(p<0.01, p<0.05, p<0.001, p<0.01), 4군 중 TAA이 가장 많이 증가하였고 다음으로 BDL, DMN, CCl4군 의 순서로 증가하였다(Fig. 4B).
고 찰
간경변증이나 간섬유증 유도를 위해서는 쥐를 이용한 CCl4-처치가 가장 흔한 실험동물 모델로 사용되고 있다 (Diaz-Gil 등, 1999; Laleman 등, 2006). CCl4는 체내로 들 어가면 간세포 CYP450에 의해 CCl3를 형성하고 산소와 결 합하여 CCl3O2를 형성하게 되는데, CCl3는 세포막의 지질과 산화를 유발하여 세포손상을 주게 되어 보통 2개월 내지 수 개월 후에 간경변증으로 발전한다(McCay 등, 1993). CCl4에 의해 유발된 간경변증은 개체차가 크며 동물 종에 따라 치 사율이 30∼60%까지 다르게 발생한다(Iwamoto 등, 1985).
또한 CCl4에 의한 간섬유증은 CCl4를 투여하지 않으면 곧 소 멸되는 단점도 있다. 그러므로 좀 더 이상적인 간경변증 실 험동물 모델은 사람의 간 병변에서 나타나는 형태학적 현상 들을 재현할 수 있어야 하고 조직병리학적으로 처치기간에 따라서 점차적이고 확실한 변화가 있어야 하며 치사율이 낮 아야 하고 마지막으로 약물 처치가 끝난 뒤에도 변화가 지 속되어야 한다(Lieber 등, 1975). 우리의 실험결과 CCl4-투 여군이 다른 3군에 비해 지방변성과 섬유화가 가장 높게 나
Fig. 3. Iron deposition and morphometric quantitiative analysis results of liver sections stained with prussian blue in rats induced by CCl4, DMN, TAA and BDL (×200). In all four groups, the iron depositions of deep blue in color were mainly along the fibrous septa and located extracellularly or in the Kupffer cells. Each value represents the mean ± SE (n=5). ***p <0.001 compared with normal control rats.
FIG. 4. PCNA-positive cells and morphometric quantitiative analysis results of liver sections immunostained with PCNA antibody in rats induced by CCl4, DMN, TAA and BDL. (×200). PCNA-positivity was observed in the nuclei of liver cells, bile duct epithelial cells, and oval & spindle-type cells in expanded portal area and fibrous septa. Each value represents the mean ± SE (n=5).
*p <0.05 and **p <0.01, ***p <0.001 compared with normal control rats.
타났으며 섬유화와 함께 α-SMA-양성의 활성간성상세포 와 TGF-ß1 발현이 가장 많이 증가한 반면 수성변성, 담 관 증식, 출혈은 거의 발생하지 않았고 혈철소 침착은 정상 대조군보다 약간 증가하였으나 통계학적인 차이가 없는 것 으로 나타났다. 또한 4주의 실험과정 중에 5마리 중 한 마 리도 죽지 않아 안정적으로 실험을 수해 할 수 있었다. 이 결과는 흰쥐에 CCl4를 복강내주입하여 6주간 실험한 예에 서도 DMN이나 TAA-투여군에 비해 높은 섬유화와 지방변 성을 나타내므로(제갈, 2001) 짧은 기간의 실험 결과를 얻 을 수 있을 수 있는 간경변증 실험모델로서는 가치가 있다 고 생각된다.
DMN과 TAA는 대표적인 간암유발물질인데, 이런 간암유 발물질들은 소량으로 장기간 투여 할 때는 간의 종양 발생 을 유도하지만 대량으로 단기간 투여 할 때는 괴사와 이차 적 섬유증을 유발한다(Khanna와 Puri, 1966). 이런 간암유 발물질들에 의한 간섬유증의 장점은 다른 모델과는 달리 유 발물질을 투여하지 않아도 수개월 이상 간섬유증이 지속된 다는 것이다(Ala-kokko 등, 1989). 간경변증 실험에서 고 농도의 DMN은 치사율이 높아 사용하기 어렵고, 낮은 농도 의 경우 간섬유증을 일으키려면 오랜 기간을 주입해야 한 다. 또한 간경변증도 쉽게 유발되지 않으며, 대부분 사람이 나 동물에서 관찰되는 간경변증에 출현하는 괴사나 심한 염 증이나 지방증도 나타나지 않는 대신 출혈이 심한 것으로 알려져 있다(Tewdt, 1985; Jezequel 등, 1987; Sato 등, 2000;
Watson, 2004). 우리의 실험에서도 DMN을 주입한 후 4주 에서 지방증은 거의 관찰되지 않았고 섬유화 정도는 4군의 실험군 중 CCl4군 다음으로 가장 높게 발생하였다. 또한 a- SMA-양성의 활성간성상세포와 TGF-ß1 발현도 섬유화 정도와 유사한 결과를 보였으며, 섬유화와 함께 부분적으 로 문맥과 문맥사이에 섬유사이막이 형성되었지만 뚜렷한 섬유성가교는 형성되지 않아 결절을 관찰할 수 없었다. 특 히 DMN-군은 다른 3군에 비해 뚜렷한 출혈 소견을 보였 으며 Prussian blue-염색 결과에서도 혈철소 침착률도 가 장 높았으며 확장된 섬유사이막을 따라 주로 세포밖에 침착 되었으며 일부는 쿠퍼세포에서도 출현하였다. He 등(2007) 도 DMN-유도 간섬유증 유발실험에서 간 조직 내 섬유화 와 출혈에 의한 적혈구 수의 증가와 함께 문맥부위로부터
뻗어나간 섬유화 부위를 따라 혈철소 침착이 뚜렷하게 나타 나며 이 혈철소는 주로 세포밖과 쿠퍼세포 내에 침착한다 고 보고하였다. 이러한 혈철소의 침착은 간세포 사이 또는 소엽사이에서 이루어지는 영양분이나 정보 전달을 방해할 것으로 생각된다. 뿐만 아니라 간 조직 내 철의 과잉축적은 간세포 손상을 일으켜 활성산소종(reactive oxygen species) 과 지질과산화를 자극하여 마침내 간섬유증, 간경변증, 기 타 다른 질환을 유발할 것으로 사료된다(Ioannou와 Kowd- ley, 2003; Corradini 등, 2004; Mueller 등, 2006).
TAA-유도 간경변증은 다른 약물들에 비해 유도가 쉽고, 독성이 비교적 약하며 치사율이 낮고, 재현성이 좋으며, 사 람에서 관찰되는 바이러스성 간염에 의해 발생하는 병변과 유사하다(Akahoshi 등, 2002; Dekel 등, 2003; Pawa와 Akli, 2004; Constantinou 등, 2007). 그러나 다른 실험동물에 비 해 간경변증 유도 기간이 길다는 것이 단점으로 지적되고 있다(Seong 등, 2003). TAA-유도된 병변의 특징은 세포 괴사, 섬유증, 간실질의 미소결절성 재구성, 담관증식 및 대 결절성 간경변증 등을 나타낸다(Trey와 Davidson, 1970;
Hatakeyama 등, 2002; Constantinou 등, 2007; Karantonis 등, 2009). 우리의 TAA-유도 간섬유증 실험결과 다른 3군 에 비해 수성변성이 정상대조군에 비해 가장 높게 발생하 였고, 지방변성도 CCl4군 다음으로 높았다. 그러나 섬유화 는 정상대조군보다 의미 있게 증가하였으나 다른 3군의 실 험군보다 낮았고 α-SMA-양성의 활성간성상세포와 TGF- ß1 발현 역시 3군 중 가장 낮은 발현율을 나타내었다. 출혈 은 정상대조군에 비해 약간 증가하였으나 통계학적 의의는 없는 반면 혈철소 침착은 정상대조군에 비해 의미 있게 증 가하였다. 박과 서(2003)도 TAA에 의한 간섬유화 실험에서 는 다른 약제들과 비교했을 때 염증반응과 조각괴사(piece- meal necrosis)가 심하고 지방변성도 시간에 따라 증가하며 담관 수가 증가하여 14주에는 샘종(adenoma)이 발생하였 으며 섬유사이막이 비교적 얇고 디세강(Disse’s space)을 따 라 소엽에 많이 퍼져 있다고 보고하였다. 따라서 간섬유증 및 간경변증 실험을 위해서는 실험기간을 더 연장해야 할 것으로 생각된다.
한편 BDL-처치군에 대한 우리의 실험결과 지방변성과 수성변성이 거의 발생하지 않았지만 다른 군과 달리 담관
수가 뚜렷하게 많이 증가하였고 넓은 범위의 괴사부위가 산 발적으로 출현하는 것이 관찰되었다. 섬유화 정도는 CCl4와 DMN군 다음으로 α-SMA-양성의 활성간성상세포 면적이 3번째로 낮았지만 TGF-ß1 발현은 CCl4군에 이어 2번째로 높게 나타났다. Georgiev 등(2008)도 생쥐를 사용한 간섬 유증 실험에서 담관결찰 후 8시간에서 6주까지의 결과 큰 담관의 경우 2-3일에 담관세포 증식이 발생하고 작은 담 관의 경우 결찰 후 5일에 담관세포 증식이 발생한다고 하였 다. 또한 결찰 후 8시간 안에 호중구 침윤이 일어나고 3일까 지 지속적으로 조직수복과 림프구 및 쿠퍼세포의 침윤이 일 어나며, 2주 동안 콜라겐이 축적된다. 그 후 α-SMA-양성 세포, TGF-β1 그리고 metalloproteinase I과 procollagen (I)의 tissue inhibitor가 감소하여 간섬유증이 안정화한다고 하였다. 그러나 BDL-모델에서 가장 논쟁이 많은 것은 섬유 화의 정도와 양이다. Kountouras 등(1984)은 담관결찰 후 5 일부터 지속적으로 간 변화를 조사한 결과 28일 째에 모든 실험쥐에서 간경변증이 나타났다고 한 반면, 다른 연구자 들은 담관결찰 후 40일이 지나도 간경변증이 발생하지 않 았다고 보고하여 실험자에 따라 섬유화 발생 기간이 차이 가 있었다(Franco 등, 1979; Tarcin 등, 2011). 우리의 실험 에서도 4주에서는 섬유화 정도가 다른 군에 비해 비교적 약 하게 발생하였고, 약물 투여와 달리 결찰을 해야 하는 기술 적인 문제점이 있어서 실험자간의 기술적 숙련의 차이에 따 라 상당한 차이가 발생 할 수 있을 것으로 예상되므로 실험 시 기간과 더불어 기술적 측면을 고려하여 선택해야 할 것 으로 판단된다.
마지막으로 PCNA에 대한 면역염색으로 4군의 실험군에 대한 세포 증식률을 조사한 바 TAA군이 가장 높고 CCl4군과 BDL군이 비슷하였으며 DMN군이 가장 낮게 나와 간섬유 증-유도 방법에 따라 조직 손상 후 세포 증식에 차이가 있 음을 확인 할 수 있었다. 또한 PCNA 면역염색결과 간세포 와 문맥부위나 섬유사이막에 출현하는 난원형세포와 방추형 세포 그리고 담관상피세포에서 양성반응이 관찰되었다.
간손상 후 간재생과정은 원래 존재하는 휴지기 간세포 들이 재생에 참여하는 기전과 미분화 간줄기세포(hepatic stem cell)들이 재생에 참여하는 두 기전으로 이루어진다고 알려져 있으며, 이 중 간줄기세포는 타원세포(oval cells)로
서 담관상피세포, 간세포, 장관상피세포 및 외분비 췌장상 피세포 등으로 분화한다고 보고되어 있다(Potten과 Loef- fler, 1990). 박과 서(2003)도 간부분절제술에 의한 간 손상 모델에서 처음 PCNA-양성을 보이는 증식하는 세포는 난 원형의 타원세포와 방추형세포의 두 종류가 있는데, PCNA 에 양성인 방추형세포들은 증식하는 간성상세포로 추정하 였다. 그 이유로는 전자현미경검사에서 이 방추형세포의 세 포질에 지방방울이 출현하는 것을 증거로 제시하였다. 실 제적으로 타원세포의 증식과 분화는 동반된 간성상세포의 증식과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고도 있다(Evarts 등, 1993).
이를 종합해 볼 때 4군 쥐의 간경변증 실험모델은 섬유 화 과정이 약물이나 방법에 따라 기간에 차이가 있고 나타 나는 간손상지수와 간재생률도 다르므로 간경변증 관련 실 험의 유형에 따라 각각의 동물실험모델을 선택하는 것이 매 우 중요하며 실험계획을 세우는 과정에서부터 세심한 주의 를 기울여야 좋은 실험결과를 도출해 낼 수 있을 것으로 생 각된다.
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