[특별기획(Ⅱ)] 앱타머 및 FET 기반의 multiplexing 진단

을 자동화한 것은 아니었다. 이후 자동화 공정은 점차 발전하여, 최근에는 microfluidic system을 응용한 SELEX prototype이 소개되었다. Hybarger et al은 microfluidic, microline-based assembly라고 하는 소 형 SELEX tool을 개발하고 이 시스템 내에서“start to finish”SELEX(DNA pool →in vitro transcription→

selection →RT-PCR →DNA amplicon)가 가능하도 록 하였다. 만약 이와 같은 시스템이 cloning, sequencing 기술과 연계된다면 앱타머 서열분석에서

구조분석까지 전자동화가 가능할 것으 로 기대된다.

맺음말

SELEX 방법은 nitrocellulose filter binding assay가 1990년 사용된 이래로 현재까지 약 20년 동안 지속적으로 발전 하고 있다. 이런 방법들의 최종 목적은 표적물질과 강한 친화력을 가진 앱타머 를 짧은 시간 내에 정교하게 선별하는 것이다. 이것은 표적 물질의 고정화 방법에 따라 좌우 되는데 최근 보고된 sol-gel microfluidic SELEX는 저분자 유기화합물질에서 고분자 생체물질의 고정화 에 이르기까지 안정한 상태로 표적물질을 고정할 수 있을 뿐만 아니라 microchip으로 응용 가능하였다. 특 히 이들은 자동화 시스템에서 소형 모듈로서 만들어 질 수 있으므로 상용화가 가능한 장점을 가지고 있기 때문에 향후 다양한 분야에서 응용이 이루어질 것으 로 예상된다.

이 장에서는 분자인식물질로 앱타머를 사용하는 전 계효과 트랜지스터(field effect transistor: 이하 FET) 센서 및 이를 이용한 단백질이나 미생물 검출센서에 대해 다루도록 하겠다.

원래 FET는 소스전극과 드레인 전극, 그리고 제 3 의 전극인 게이트 전극으로 구성되며 소스와 드레인 사이에 형성된 채널에 흐르는 전류의 양이 제 3의 전 극인 게이트에 의해 조절되는 장치를 뜻한다. 그런데 이 때 제 3의 전극인 게이트에 전압을 걸어주는 대신,

게이트에서 생기는 화학반응에 의해서도 채널의 전류 를 조절할 수 있다. 즉, 게이트에서 생기는 화학반응에 의해 채널의 전류가 변화할 수 있다. 이와 같은 형태의 FET를 chemical field effect transistor, ChemFET 라고 부르며 화학센서 또는 바이오센서로 주로 이용 된다. 이와 같은 ChemFET는 가스분자나 용액 중의 이온 등을 검출하는데 사용되며 특히 이온을 검출하 는데 사용되는 센서를 ISFET(ion-sensitive field effect transistor), 효소를 인식물질로 사용하여 화학 그림 8. Operational diagram of the microfluidic SELEX prototype device.

FET multiplexing

이 정 오

한국화학연구원 융합바이오기술연구센터 [email protected]

반응을 모니터하는 센서를 EnFET(enzyme-FET) 라고 부르기도 한다. FET가 형광 바이오센서나 ELISA에 대해 갖는 가장 큰 장점은 반응 자체에서 발생하거나 또는 타겟이 갖는 전하를 검출하는 방식 이므로 비표지 방식이라는 것이다. 따라서 FET 센서 를 이용하면 실시간 검출도 가능할 수 있다. 또 소형화 가 가능하며 이미 정립된 반도체 공정을 통해 대규모 집적 및 대량생산이 가능하므로 센서의 단가를 크게 낮출 수 있다는 장점이 있다. 그러나 이와 같은 장점에 도 불구하고 FET 센서의 실용화, 특히 용액 중에서 실시간 검출이 필요한 바이오센서 응용에는 큰 문제 점이 있는데, FET 센서의 신호는 체액과 같은 전해질 용액에서 검출 불가능하다는 것이다.

우리 몸에는 신체를 유지하고 조절하기 위해 많은 양의“소금” (농도로는 약 150mM)을 포함하고 있기 때문에 샘플로 사용되는 혈액이나 소변, 체액 등에도 유사한 농도의 소금이 포함되어 있다. 따라서 FET 센서는 체액을 그대로 이용하는 센서로는 이용될 수 없고, 용액의 이온농도를 낮추는 전처리 과정이 필요 하게 된다. [그림 1]에서 보는 것과 같이, 센서가 용액 속에 들어가게 되면 센서 표면의 전하를 상쇄하기 위 해 용액 속의 전하를 띤 이온들이 센서 표면으로 모여 들면서 소위 전기 이중층이라고 하는 막 구조를 형성 하게 된다. 전기 이중층은 금속 또는 반도체 표면에

특이적으로 부착하는 Helmholtz, 혹은 Stern 층이라 고 불리는 내층과 비특이적으로 결합하여 유동성을 갖는 바깥층인 diffuse layer로 구성되어 있다. 이 때, diffuse layer의 두께는 용액의 이온농도와 밀접한 관 계를 갖는데, diffuse layer의 두께를 판단하는 기준으 로 드바이 길이 (Debye screening length)라는 개념 을 주로 사용하게 된다. Debye 길이를 이해하기 위해 서 정전역학을 생각해보자. 일정 길이만큼 떨어진 두 전하사이에는 쿨롱(Coulomb) 힘이 존재하게 되는데, 이 힘은 유전율이라고 불리는 주변의 매질에 크게 의 존한다. 예를 들어 물의 유전율은 상온, 상압에서 약 78. 5이므로 물속에서의 쿨롱 상호작용은 진공에서의 값에 비해 1/80로 떨어진다.

kq 1 q 2

(쿨롱에너지U(r) = ---, 여기서 q εr 1 , q 2 는 각 전하의 값, ε은 유전율, r은 두 전하 사이의 거리)

두 전자가 열에너지(k B T) 만큼의 상호작용을 가질 수 있는 거리를 추산해보면 k B T = kq 1 q 2 / εr로부터 r=

ke ² /( εk B T)을 이용하여 약 7Å의 값을 얻게된다(여기 서 k=9× 10 ⁹ N· m ² /C ² , e=1.6× 10 ^-19 C, ε=80, k B T=4×10 ^-21 J). 이 길이를 Bjerrum 길이라고 부르 며 다음 식과 같이 나타낸다.

ke ²

l B = --- 7Å (식 1) εk B T

이제, 이온농도와 드바이 길이와의 상관관계에 대해 생각해보자. 몰 농도(molarity)와 분자 수와의 상관관 계를 생각해보면 농도가 드바이 길이에 미치는 영향 을 쉽게 짐작할 수 있다. 즉 1몰은 1리터에 아보가드 로 수 만큼의 분자가 있다는 뜻이고, 이로부터 농도가 증가함에 따라 분자들 사이의 거리가 가까워진다는 것을 쉽게 알 수 있다. 따라서 이온들이 풍부한 전해 질 용액에서 쿨롱 상호작용은 위에서 단순히 나

kq 1 q 2 k′ q 1 q 2

타낸 U(r) = --- 이 아니라 U(r) = --- e εr εr ^{-r/ λ}

의 형태로 나타나게 되고, 이 때 드바이 길이 λ ^D 는 쿨롱 상호작용이 지수함수로 감소하는 파라미터로 결정된다.

그림 1. 전극 표면에서의 전기이중층.

(식 2)

이 식으로부터, 1M 1:1 전해질 (예를 들어 NaCl) 의 경우 드바이 길이는 0.3nm에 불과하다는 것을 알 수 있다. 즉, 정전 에너지 값이 드바이 길이의 지수함 수로 감소하므로, 드바이 길이 이상 떨어진 전하 또는 하전된 입자로부터는 아무런 상호작용을 느낄 수 없 는데, 1M NaCl에서는 이미 0.3nm 떨어진 두 분자가 서로 아무런 영향을 미치지 못한다는 것을 뜻한다. 이 제 드바이 길이를 우리의 센서와 연관지어 생각해보 자. [그림 2]는 센서 표면에 항체가 고정화되어 있을 때와 앱타머가 고정화되어 있을 때, 용액의 이온농도 에 따른 포텐셜을 도식화한 것이다. 그림에서 보는 바 와 같이, 항체를 인식물질로 사용하였을 때 높은 이온 농도에서 항원-항체가 결합한 반응은 센서 표면에 전 혀 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 일반적인 항체 의 길이는 약 10nm 정도이고 트롬빈 앱타머의 경우

약 2nm이므로, 항체를 사용하는 경우에 센서는 용액 의 이온농도가 수 mM을 넘어서면 이미 검출이 불가 능하고(1mM에서의 드바이 길이는 약 30nm), 앱타 머를 사용한 경우에는 10mM 이상의 1:1 전해질에서 도 센서 반응을 측정할 수 있다.

앱타머 기반 FET 센서

앱타머가 FET 센서에 처음 적용된 것은 2005년으 로, 탄소 나노튜브 트랜지스터에 링커 분자로 CDI- Tween 20을 고정화하여 3’말단을 NH 2 로 기능화한 트롬빈 앱타머를 고정화하고 트롬빈의 반응을 실시간 으로 측정하였다. 이와 같은 실험을 수행하기 위해, 연 구진은 실리콘/실리콘 옥사이드 웨이퍼에 PMMA (poly(methylmeta crylate))로 카탈리스트가 담지될 패턴을 만든 후, 액상의 카탈리스트를 도포하여 원하 는 위치에만 카탈리스트가 생기도록 하여 900도의 퍼 니스에서 수소, 메탄을 이용하여 탄소 나노튜브를 성 장시켰다. 이와 같이 성장된 탄소 나노튜브를 FET 로 만들기 위하여 포토 리소그라피를 이용, 전극 패턴을 만든 후 Ti과 Au를 증착하여 전극을 생성하고, 용액에 서의 누설전류가 발생하지 않도록 탄소 나노튜브 채널 을 제외한 나머지 부분을 SU8-2002 레지스트를 이용 하여 절연시켰다. [그림 3]은 이렇게 만들어진 탄소 나 노튜브 트랜지스터의 사진을 보여준다. 현재 사용되고 있는 탄소 나노튜브 트랜지스터의 집적도는 대략 1cm ² 당 50개 정도이지만 검출시간 및 감도의 개선 등 을 위해 mircofluidic 채널이나 기타 시료 전달 장치가 포함되어야 하므로 더 이상의 소형화는 크게 의미가

없을 수도 있다.

이와 같이 제작된 앱타머-탄소 나노튜 브 센서는 PDMS 또 는 아크릴 재질의 셀 을 이용하여 버퍼용 액 또는 DI water에 잠기게 되고, 여기에 εk

T

λ

= [ --- ]

= --- 1 4 πkeΣρ

z

i

(4 πl

Σz

ρ

)

i i

그림 2. FET 센서에서의 앱타머와 항체의 크기에 따른 영향.

그림 3. 탄소 나노튜브 트랜지스터의 현미경 및 AFM 사진.

기준전극을 삽입하여 이온농도 및 기타 외부 환경의 변화에 따른 요인을 최소화시켰다. 센서의 성능은 여 기에 정확히 농도를 알고 있는 트롬빈 용액을 떨어뜨 려 실시간으로 전기 전도도를 측정함으로서 이루어진 다. 보통 트롬빈 용액을 떨어뜨리면 즉시 전기 전도도 가 감소하지만 점차 그 변화 폭이 늦어지는 것을 볼 수 있다. 저자들은 가역적으로 변화하는 앱타머의 특 성을 이용하여 센서를 재사용하는데 성공하였다. 즉, 한번 트롬빈과 반응한 센서를 높은 이온농도의 용액 (6M Guanidine hydrochloride)에서 씻어주게 되면, 앱타머와 결합한 트롬빈이 떨어져 나가면서 센서의 전기 전도도가 원래의 상태를 회복하는 것을 볼 수 있 다. [그림 4]는 트롬빈을 떨어뜨리면서 앱타머가 고정 화된 탄소 나노튜브의 전기 전도도를 실시간으로 측 정한 그래프를 보여준다. 이와 같은 탄소 나노튜브 앱 타머 센서의 감도는 약 10nM인 것으로 보고되었으며 신호처리 및 측정법 등을 개선하여 보다 높은 감도를 얻을 것으로 기대되고 있다. 2007년에는 앱타머와 항 체를 각각 탄소 나노튜브 트랜지스터에 고정화시켜 용액의 이온농도에 대한 반응을 관찰한 논문이 Maehashi 등에 의해 발표되었다. 그들은 IgE 앱타머 와 IgE 항체를 각각 탄소 나노튜브 표면에 고정화시 키고 10mM의 버퍼용액에서 IgE 항원에 대한 센서의 반응을 관찰하였다. 항체를 사용한 탄소 나노튜브 센 서의 경우 IgE의 농도를 140nM까지 증가시켜도 전 기 전도도에 거의 변화가 보이지 않는 반면, 앱타머를

사용한 센서에서는 250pM의 IgE 용액에서도 전기 전도도가 민감하게 변화하는 것을 관찰하여 FET 방 식 센서에서 앱타머의 우수성을 증명하였다.

앱타머-FET 어레이를 이용한 대장균 검출센서 다음으로, 앱타머-FET를 이용한 FET 어레이에 대해, 특히 최근 보고된 앱타머를 고정화한 탄소 나노 튜브 대장균 센서의 예를 들어 설명하도록 하겠다. 탄 소 나노튜브 또는 실리콘 나노선이나 기타 반도체 나 노선을 이용한 나노바이오센서는 단일 분자도 검출할 수 있을 만큼 감도가 높은 것으로 알려져 있다. 그러 나, 나노바이오센서의 검출한계는 단순히 센서의 감 도에 의해 결정되는 것이 아니라, 타겟분자의 확산 (diffusion)속도에 의존한다는 것이 최근 연구결과를 통해 밝혀지고 있다. 예를 들어 1fM 용액 1nl(10 µm

×10 µm×10µm의 부피에 해당함)에는 0.5개의 분자 만이 들어있고, 채널길이가 5 µm이고 직경이 1nm인 하나의 탄소 나노튜브 FET를 센서로 할 때, 센싱 면 적은 0.005 µm ² 에 불과하다. 확률적으로 볼 때, 단백질 의 확산속도를 10 µm/s라고 가정하더라도, 이 단백질 이 단순 확산에 의해 센서 표면에 도달할 확률은 극히 낮아진다. 따라서, 나노바이오 센서의 감도한계를 극 복하기 위해서는 센서의 표면적을 늘리거나, 타겟을 능동적으로 센서 표면으로 끌어당길 수 있는 기술이 필요해진다. 타겟을 능동적으로 센서 표면으로 끌어 당기기 위해 미세채널이 적용될 수 있고, 센서의 표면 그림 4. 트롬빈 앱타머가 고정화된 탄소 나노튜브의 실시

간 측정곡선. 화살표 부분에서 트롬빈 용액을 떨 어뜨림. 오른쪽은 트롬빈 농도에 따른 전기 전도 도의 변화 폭을 보여준다.

그림 5. 배양법을 이용한 MPN과 탄소 나노튜브 트랜지스터

어레이를 이용한 MPN 방법.

적을 늘리는 것은 센서를 어레이화함으로서 가능해진 다. 매우 농도가 낮은 타겟물질의 농도를 추산하는 방 법은 이미 미생물을 연구하는 분야에서 MPN(most probable number)이라는 방법으로 이용되어 왔다.

[그림 5]는 기존의 배양법에서 사용되는 MPN 법과 탄소 나노튜브 트랜지스터 어레이를 이용한 MPN 법 을 비교한 것이다. 통상적인 MPN 방법에서는 시료 를 원액, 1/10, 1/100 등으로 희석하고, 각 희석단위 별로 최하 3개씩의 배양접시에 반응시켜 콜로니 생성 여부, 또는 생화학적 방법을 통한 미생물의 존재여부 를 분석한다. 이 희석 및 배양과정을 더 이상 미생물 이 존재하지 않는 범위까지 실시하고, 마지막 3개(3 tube MPN인 경우)의 희석단위에서(예를 들어 10 ^-4 희석액에서 더 이상 미생물이 자라지 않았다면 10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 세 집단) 양성을 보인 배양접시의 수를 MPN 표와 비교하여 원액에 들어있는 미생물의 수를 추산하게 된다. 탄소 나노튜브 트랜지스터로 대장균 을 검출할 수 있게 하기 위하여 탄소 나노튜브 트랜지

스터 어레이를 제작하고, 탄 소 나노튜브에 비공유결합 링커를 이용하여 대장균의 표면에 특이적으로 결합하는 앱타머를 고정화시켰다. 이 와 같이 대장균 앱타머가 고 정화된 탄소 나노튜브 트랜지스터에 높은 농도의 대 장균(~10 ⁷ cfu/ml)을 반응시켰을 때, 탄소 나노튜브 트랜지스터는 50% 이상 전기 전도도의 감소를 나타 내며, 추후 AFM 이미지에서도 전극 사이에 대장균 이 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 이 앱타머 센서 는 농도가 10 ⁹ cfu/ml의 살모넬라균 용액에 대해서도 별 반응을 보이지 않아 선택성을 보유하고 있음을 알 수 있다. 그러나 센서 하나에 보통 ~5 µl의 시료가 사 용되므로, 농도가 10 ³ cfu/ml인 용액 5 µl에는 5마리의 대장균만이 존재하게 되고 검출시간(20분) 이내에 대 장균이 센서 표면에 도달할 확률은 매우 낮아지게 된 다. 이 때문에, 농도가 낮은 대장균을 검출하기 위해서 는 센서 표면을 늘려야 하고, 이에 따라 대장균 앱타 머가 고정화된 하나의 트랜지스터가 아닌 트랜지스터 어레이가 적용되어야 한다.

센서의 정확도는 어레이 수가 늘어날수록 개선될 것으로 보이며 실제 기존 배양법의 경우에서도 테스 트 튜브의 수를 증가시키면 보다 높은 정확도로 미생 물의 개체 수를 추정할 수 있다.

맺음말

지금까지, 앱타머를 고정화한 탄소 나노튜브 트랜 지스터를 이용한 단백질 검출센서 및 탄소 나노튜브 트랜지스터 어레이를 이용한 고감도 대장균 검출센서 에 대해 알아보았다. 현재까지는 하나의 타겟을 검출 하는 앱타머-FET 센서만이 소개되었지만 곧 [그림 7]과 같이 다양한 인식 앱타머를 고정화한 multiplex 형 센서가 선보일 수 있을 것으로 기대된다.

그림 7. Ultra-long nanotube에 다양한 앱타머를 고정화한 다중검출센서 플랫폼.

그림 6. 탄소나노튜브 트랜지스터 어레이의 전극 사이에 포획된 단일 대장균.