약학회 지 제 48 권 제 5 호 261〜 265 (2004)
Yakhak Hoeji Vol. 48, No. 5 藥學舍확
큰눈물버 섯(Psaf/iyreWa velutina) 균사배 양물로부터 분리 한 단백다당체 PVMP의 면역활성
정 경 수 # . 이지선
충 남 대 학 교 약학대 학 미 생 물면 역 학 교 실 (Received August 27，2004; Revised September 23, 2004)
Immunoactivities of PVMF； a Protein-polysaccharide Fraction Isolated from Mycelial Culture of
Psathyrella velutina
K yeong-Soo C hun g# and Ji-Seon L ee
Laboratory of Microbiology and Immunology, College of Pharmacy, Chung-Nam N ational University, Daejon 305-764
Abstract - In the previous report, we described the marked antitumor and immunomodulatory activities of PVR a protein- polysaccharide fraction of a Korean wild mushroom Psathyrella velutina. In this study, a protein-polysaccharide fraction, PVMR was prepared from the shake-cultured mycelia of the same mushroom and its immunoactivities as well as chemical compositions were investigated. At 200 PVMP weakly stimulated the BALB/c mouse splenic lymphocytes to form lymphoblasts and upregulated the expression of CD25 molecules, but failed to stimulate peritoneal macrophages. In chem
ical analysis these two protein-polysaccharide fractions were found to be quite different in that the carbohydrate contents of PVMP and PVR respectively, was 85.3% and 41.2%. These results reveals that PVMR unlike PVR is a moderate immu- nostimulator on the immune system.
Keywords □ Psathyrella velutina, mycelium, PVMR protein-polysaccharide, lymphoblast, CD25, immunostimulation
담자균류(basidiomycetes)의다당체/단백다당체가숙주의면역
기능을활성화시켜항암효과를나타낸다는사실은잘알려진바
와같다.1-71 본연구자들은야생담자균류즉야생버섯류로부터
새로운항암면역활성단백다당체를개발하기위한연구를수행 해오고있으며8_14) 최근에는큰눈물버섯(PsathyreHa velutina)으
로부터 분리한단백다당체 PV P의항암면역 활성을보고한바
있다.1® PVP는야생큰눈물버섯자실체를채집하여그로부터열
수추출및알콜침전, 투석등을거쳐제조한단백다당체분획으 로서 IC R 생쥐 복강에 이식한 sarcoma 180 암세포의 증식을
92.8% 억제하였고 BALB/c 생쥐의 비장 백혈구에 대해
lymphoblast 생성증가효기를나타내었으며 T lym phocytei：활 성화시켜 Interleukin-2 receptor a-chain(CD25)의발현을증가 시키는등현저한항암 • 면역활성을나타내었다.1M 그러나큰눈 물버섯은아직까지 재배방법이개발되지않았을뿐만아니라버
#본논문에 관한문의는 저자에게로
(전화) 042-821-5927 (팩스) 042-823-6566 (E-mail) [email protected]
섯의크기도작아 그 자실체를이용한의약품 또 는 기능성식품
등의 생산은어려움이 예상된다. 이처럼 자실체를대량확보하 기어려운경우에는균사체를분리하여 액체배양함으로써유효
성분을대량생산할수있다.12J4) 다만, 자실체(버섯)에서확인된
약리활성성분이균사체에서도그대로얻어진다는보장미 없기 때문에균사배양물을대상으로한별도의 연구가반드시 수행되 어야 한다. 구름버섯( H Coriolus t»mfco/or)5)이나상황버섯
(Phellinus ftwtews)®은균사체를액체배양히■여항암면역요법제로
사용하고있는좋은예이다. 따라서본 연구자들은큰눈물버섯 으로부터 균사체를무균적으로분리한후 액체배지내에 진탕배 양하고그균사배양물로부터 단백다당체를분리하여그의 면역 활성을규명코자하였다.
실험 방법
큰눈물버섯 균주 분리
대전광역시계족산지역에서 채집한오염되지않은야생큰눈 물버섯자실체로부터이미보고한바12와 같이균주를분리하였
262 정경수 ■이지선
다. 즉，신선한어린자실체갓부위에서조직절편을무균적으로 떼어내감자-포도당-한천(Potato Dextrose Agar= PDA, Difco사)
배지에올려놓고 250C에서 7일간배양한후조직절편으로부터
성장해나온균사체선단부를잘라내어다시신선한 PDA 평판
배지에이식하고이로부터성장한균사체를 PDA 사면배지에이
식하여 큰눈물버섯균주로시용하였다.
균사체 배양12>
PDA 사면배지상에보존중인큰눈물버섯균주를소량의 담 자균배양용액체배지(배지 11당성분: 포도당 50 g, 펩톤 10 g, yeast extract 10 g, M g S 0 4 • 7H20 0.5 g, CaCl2 0.3 g, Z nS 0 4 • 7H20 0.04 mg, C u S 0 4 • 5H 20 0.01 mg, M nC l2 . 4H 20 0.07 g, FeS04 • 7H20 0.1 mg, 이하 '액체배지’라칭함)와함께미리멸 균한가정용믹서 (Osterizer 12 Speed Blender)로균질화하였다.
이를 액체배지 50m/가담긴 250m/-플라스크에 5 m/씩 접종，
250C에서 180 rpm으로 10일간진탕배양하였다. 얻어진배양물 을재차균질화시킨후액체배지에 10%(v/v)씩접종하여 10일간 진탕배양하여 최종균사배양물(Fig. 1)을획득하였다.
단백다당체 제조9*
균사체배양물를균질화시킨후고압멸균기로 1210C에서 40
분간열수추출하였다. 감압여과하여추출액을분리한후잔사 는재차열수추출을시행하였다. 1, 2차열수추출액을합하여 원심분리하고그상등액을 60oC 수욕상에서 5배감압농축하였 다. 이에 95% 에탄올을 3배량가하고 40C에하룻밤방치하여침 전을생성시켰다. 400게서 2,800rpm으로 15분간원심분리하여 침전물을얻고이를 60oC 정도의증류수에재용해시켜 cellulose
투석막(Sigma, m olecular w eight cut off : 12,000)에넣어증류 수를교체하면서 40C에서 4일간투석하여저분자물질을제거하
고 동결건조하여 단백다당체를 획득하였다. 이를 "PVMP"
Fig. 1 - The shake-cultured mycelia of Psathyrella velutina.
(Psathyrella velutina m ycelium protein-poly saccharide) 라 칭하 였다.
단백다당체 PVMP의 당함량분석
시료중당함량은포도당을표준당으로하고 anthrone 시약을 발색시약으로하여비색법16>으로정량하였다.
비장 백혈구현탁액 제조 및 배양
이미 보고한 방법10>에 의거하여 다음과 같이 비장세포 현탁액 을 제조하였다. 즉，SPF(specific pathogen-free) male BALB/c 생쥐의 비장을 적출한 후 100-mesh의 stainless steel screen를 통과시켜 단세포로 분리하였다. 인산염완충액"(PBS, pH 7.2)으로 2회 세척한 후, red blood cell lysing buffer(Sigma)를 이용, 적 혈구를 용혈시키고 다시 PBS로 2회 세 적한 투 fetal bovine serum(Hyclone)을 10% 첨가한 RPM I 1640 배지 (10mM HEPES buffer, penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 (ig/
ml 첨가)(이후 "10% FBS-RPMI 1640 배지"라 칭함)로 희석하여 2X 1 06 cells/mZ이되도록비장백혈구현탁액을제조하였다. 단 백다당체 시료는 10% FBS-RPMI 1640 배지에 1 mg/mZ로 용해 시킨 후 0.20 |0.m membrane filter로 여과 멸균하고 필요에 따라 희석하여 사용하였다. 비장 백혈구 현탁액을 6 m/ culture tube 에 50010/리 분주하고 배지 또는 시료를 500|j/i• 가하여 5% C 02 대기하에서 48시간 배양하였다. 모든 실험군은 3개씩 중복 실험 하였다.
면역형광염색 및유세포분석 (flow cytometric analysis)1117'
세포현탁액 300 야를 FACS tube로옮겨 원심분리하여 상등 액을 제거하고, 10배 희석한 FITC-conjugated anti-mouse CD25 monoclonal antibody(Pharmingen) 용액 2 0 )0/씩을 가하여 빙욕 상에서 3据 간 면역형광염색을 시행하였다. 2회 세척한 후 300|oZ 로 현탁시키고 죽은 세포를 분별하기 위하여 propidium iodide (250 [Lg/ml) 30n/씩을 첨가하여 즉시 유세포 분석하였다. 사용한 유세포분석기는 Becton Dickinson사의 FACSCalibur이며 사용 한 분석 프로그램은 CellQuest였다. FSC/SSC dual parameter dot plot에서 FSC threshold를 설정하고 10,000개의 세포에 대 한자료를취합하였으며이들을다시 FSC/FL3 dual parameter dot plot에나타내어 FL3-negative인세포(viable cell)를분석대 상으로 하고 이들을 FSC histogram 및 FL1(CD25) histogram 에 나타낸 후 분석하였다.
복강대식세포 spreading 실험
BALB/c 생쥐의복강에차가운 PBS(pH 7.2) 5 m/을주사하고 고르게 문질러준후복강세척액을회수하였다. 원심분리하여 상등액을제거하고 10% FBS-RPM I 1640 배지에 1 M 0 6 cells/
J. Pharm. Soc. Korea
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m/로부유시켜 flat-bottomed 96-well culture plate에 200 !a/씩 가하였다. 37°C, 5% C 0 2 대기하에서 1시간배양하여 플라스틱 용기에 부착시킨후 37°(：로 데워 놓은 10% FBS-RPM I 1640
배지로 3회세척, 부착되지 않은세포들을 제거하였다. 여기에
시료용액을 2 0 0씩가하고다시 2시간배양한후현미경 사
진을촬영剩 spreading된세포f t 계수，그백분율을계산하였다.
통계처리
모든실험 data는 Student's t-test를시행하여 유의성을검토 하였으며유의수준은 p< 0.05 이하로하였다.
실 험 결 과 및 고 찰
단백다당체 PVMP의 물리화학적 성상
큰눈물버섯배양균사체로부터 추출한단백다당체 PVM P는 연한회황색 내지담황색무정형 분말로서，증류수나생리식염
수둥에 잠녹으며 anthrone 시약을이용한비색법으로정량한
길과당함량은 85.3%로서 , 큰눈물버섯 자실체로부터 분리한난
백다당체 PVP의당함량(41.2%) 보다 2배이상높았다. 따라서
PVM P와 PVP는서로싱■이한단백다당체임을알수있었다.
PVMP의 Lymphoblast 생성 자극 효과
BALB/c 생쥐비장임파구에 PV M P 등을가하고 48시간배양 한후유세포분석 (flow cytometrical analysis) 기법으로분석한 결과, Table I에나타낸바와 PVM P는 200 [ig/ml농도에서 완만 한 lym phoblast 생성자극효과를나타내었다. 즉세포직경과비
례하는 유세포 분석 param eter인 FSC 값이 대조군의 경우
343.41이었으나 PV M P 200 [ig/ml 처리군에서는 387.28로증가
(p<0.001)하였다. 뿐만아니라 lym phoblast 비율이 대조군의 경 우 33.9%였으나 PV M P 200 |ig/m/ 처리군에서는 49.8%
(pcO.O Ol)로증가하였다. 이로써큰눈물버섯배양균사로부터 분
리한단백다당체 PVM P도큰눈물버섯자실체로부터 분리한단 백다당체 PVP와유사하게 lym phoblast 생성자극효과를발휘 함을확인할수있었다. 그러나 PV M P는 100 lig/m l및 50 \xg/ml 농도에서는 lym phoblast 생성자극효과를나타내지못하여 PV P
보다그효과가미약함을알수있었다.
PVMP의 T cell 활성화효과
전항에서 확인한 lymphoblast 생성 자극효과가어떤면역세
포를 활성화시킴으로써 나타난 결과인지를 확인하기 위하여
BALB/c 생쥐비장임피구에 PV M P 등을가하고 48시간배양한
Table 1 - In vitro Lymphoblastogenic effect of PVMP on the splenic lymphocytes of a BALB/c mouse
Stimulant Con. (|xg/m/) FSCa % Lymphoblastb
Mean±SD % Increase Mean±SD % Increase
Medium - 343.41 ±2.97 - 33.9±0.84 -
ConAc 5 458.94±4.53*** 33.64 73.0±0.3*** 115.1
PVMPd 200 387.28±2.80*** 12.78 49.8±1.4*** 46.7
100 348.46±4.78 1.47 33.3±2.6 -1.91
50 349.09±2.85 1.66 34.9±1.3 2.77
PVP6 100 376.55±3.67*** 9.65 42.0±1.6*** 23.75
aFSC is an abbreviation of forward scatter, a flow cytometric parameter, which corresponds to the size of a cell.
bThe cells satisfying a marker set on a FSC histogram to include larger cells were taken as lymphoblasts.
cCon A : concanabalin A.
dPVMP : the protein-poly saccharide fraction prepared from the shake-cultured my celia of Psathyrella velutina.
ePVP : the protein-poly saccharide fraction prepared from the carpophores of P velutina.
^S ignificant at p < 0.001.
Table II - Effect of PVMP on the expression of CD25 on the splenic lymphocytes of a BALB/c mouse
Stimulant FL1 (CD25) % CD25+ cells
liiL)
Mean±SD % Increase Mean±SD % Increase
Medium - 8.20±0.66 - 13.37±0.63 -
ConAa 5 92.24±0.56*** 1024.49 8 7 .8 4 ± 0 .4 4 *** 557.14
PVMPb 200 9.92 ±0.41* 20.90 19.26±0.68*** 44.08
100 7.83 ±0.31 -4.58 12.78 ±0.64 -4.37
50 8.20±0.24 -0.07 12.98±0.46 -2.90
PVpc 100 11.61 ±1.13** 41.58 25.74±1.56*** 92.53
aCon A : concanabalin A.
bPVMP : the protein-polysaccharide fraction prepared from the shake-cultured mycelia of Psathyrella velutina.
CPVP : the protein-polysaccharide fraction prepared from the carpophores of E velutina.
Significant at p<0.05, **significant at p < 0 .()i, ***significant at pcO.OOl.
264 정경수 • 이지선
후유세포분석(flow cytometrical analysis) 기법을이용하여 세 포매개성면역(cell-mediated immunity)의근간이 되는 T cell의 활성화정도를분석하였다. 즉, T cell 활성화지표분자(activation maker molecule)로 널리 알려져 있는 CD25(interleukin-2 receptor a chain, p55)의발현정도를분석한결과Table II에나 타낸바와같이PVMP는200 ng/ml농도에서 CD25 발현을유 의적으로증가시킴으로써 T cell 활성화효과가입중되었다. 즉 배지 대조군의 CD25에의한평균 형광광도(Mean FL1) 값이 8.20이었으나 PVMP 200|ig/m/ 처리군에서는9.92(p<0.05)로 20.9% 증가하였고，배지대조군의 CD25+ 세포비율이 13.37%
였으나PVMP 200ng/m/ 처리군은19.26%(p<0.001)로서 대조 군에비해 CD25+ 세포가약44% 증가한것으로해석된다. 이 로써 큰눈물버섯 배양균사로부터 분리한단백다당체 PVMP도 그자실체로부터분리한단백다당체PVP와유사하게 T cell 활 성화효과를발휘함을확인할수있었다. 그러나그효과는PVP 보다매우약한것으로나타났다. 즉 10(Hig/m/ 농도에서 PVP 는CD25 발현을41.6% 유의적으로증가시켰으나PVMP는효 과를발휘하지 못하였다.
PVMP의복강 대식세포 spreading 효과
Fig. 2 패널C에서볼수있드시 PVP는많은복강대식세포 를자극하여 2시간만에배기용기바닥에불규칙한형태로퍼지 도록하였다. 그러나PVMP(Fig. 2 패널B)는대조군(Fig. 2 패 널C)과비교할때별다른차이를나타내지 않았다. 이를육안 판별하여 spreading을일으킨비율을산출한결과, Fig. 3에나 타낸바와같이PVP는복강대식세포의 spreading을현저중가 시킨반면에 PVMP는거의효과가없음을알수있었다.
동일한버섯으로부터제조된단백다당체들이 면역활성에있어 서큰차이를보인가장큰이유는이들두단백다당체 시료가
Fig. 2 - In vitro spreading of BALB/c mouse peritoneal macrophages by PVMP and PVR the protein-polysaccharide fractions isolated respectively from the carpophores and the shake- cultured mycelia of Psathyrella velutina. Each data point is the mean of three experiments. The numbers shown are the concentration of the protein-polysaccharides in pg/m/.
40
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20
Fig. 3 -In vitro spreading of BALB/c mouse peritoneal macrophages by PVMP and PVR the protein-polysaccharide fractions isolated respectively from the carpophores and the shake- cultured mycelia of Psathyrella velutina. A: medium control, B: PVMP (200 C: PVP (200 [ig/ml).
기원생물만같을뿐실제로는서로상미한단백다당체일수있 기때문이다. 즉PVP는야생큰눈물버섯자실체 즉야생버섯으 로부터제조한단백다당체로서그중다당체 함량이 41.2%에불 과하나，PVMP는큰눈물버섯으로부터 균시를분리하여 액체배 지에진탕배양한후그로부터 제조한단백다당체로서그다당
체함량이85.3%에달하는등두시료간에화학적조성부터크
게다름에유념할필요가있다. 자실체와균사체간에성분의차 이가나는이유는버섯의 생활사를살펴봄으로써이해가가능 하다.1® 즉자실체에서유래한포자가발아하면균사로자라며 이들균사체는영양흡수및성장을주요기능으로갖고몇달 동안눈에띄지않게꾸준히성장하며영양을축적하게된다. 그 러다자실체발생에적합한최적조건이 갖추어지는몇일정 도의짧은기간에균사체로부터 자실체가자라나와포자를생 성하며퍼뜨리게된다. 이때균사체에서 발현되지않고있던다 양한유전자가발현되어다양한 2차대사물을생성하는데그대 표적인예가색소，독성분，항균성분등을들수있다. 그 결과 백색내지미황색정도의균사체에서 저마다다양한색상과형 태를지닌버섯이발생하는것이다. 따라서 균사체와자실체는 성분에큰차이가있을수있으며실제로버섯과균사체에성분 상의현저한차시가있는좋은예는버섯류의 렉틴에관한연구
들에서찾아볼수있다.19) 많은렉틴들이팽이버섯을포함한다
양한버섯자실체에서 발견되고있지만인공적으로배양한팽이
버섯XMammidim velutipes)균사체에서는전혀발견되지않거나 또는지실체와전혀다른렉틴이발견되기도하는것이다.20)
Control PVMP PVMP PVP PVP
100 200 100 200
J. Pharm. Soc. Korea
큰눈물버섯 균사때！양물의 면역활성 265
결 론
한국산야생담자균인큰눈물버섯 wMz'wa)으로부터
균사체를분리하여 액체배지에 진탕배양하고그로부터 단백다당
체 PVM P를분리하였다. PVMP는수용성다백다당체로그중 당
함량은 85_3% 였으며 20(Hig/m/ 농도에서 BALB/c 생쥐 비장 백 혈구에대하여 lymphoblast 생성자극효과를나타내었으며，T cell 활성화효과도발 휘 剩 CD25 발현을증가시켰다. 그러나 lOO ng/
ml이하의농도에서는효과가관찰되지 않았으며 BALB/c 생쥐복
강대식세포에 대하여도활성화효과가인정되지 않았다. 이러한
결괴들은큰눈물버섯균사배잉물로부터분리한 PVMP의면역활
성이자실체로부터 분리한 단백다당체 PVP 보다 미약함을의미
하며 따라서큰눈물버섯균사배양！：로부터 보다강력한면역활성
을 갖는단백다당체를얻기 위해서는배지의 조성을달리하거나
배양조건을달리하는등추가적인연구가필요함을밀해주고있다.
감사의 말씀
본연구는2 0 0 2년도 충남대학교 학술연구비의 지원으로 수행
되었으며 이에 감사드립니다.
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