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1)
이 논문은 1997년도 고황의학연구비의 일부 보조에 의하여 작성되었음 접수 : 2002년 12월 3일, 수정 : 2003년 1월 28일, 승인 : 2003년 2월 3일 책임저자 : 조경삼, 경희대학교 의과대학 내과학교실
Tel : 02-958-8201, Fax : 02)959-9594, E-mail : [email protected]
AML1/ETO-양성 급성골수성백혈병에서 역전사중합효소연쇄반응을 이용한
미세잔존질환 연속측정의 의의
경희대학교 의과대학 내과학교실1, 동서의학연구소2
박경분1․이재진1․윤휘중1․김시영1․김영일2․조경삼1
Detection of Residual Leukemia with Reverse
Transcription-polymerase Chain Reaction from Patients with AML1/ETO Positive Acute Myeloid Leukemia in Remission
Kyoung Bun Park, M.D.1, Jae Jin Lee, M.D.1, Hwi-Joong Yoon, M.D.1, Si-Young Kim, M.D.1, Young Il Kim, Ph.D.2, and Kyung Sam Cho, M.D.1
Department of Internal Medicine1, East-West Medical Research Institute2, Kyung Hee University College of Medicine, Seoul, Korea
Background : One of the most frequent cytogenetic abnormality in acute myeloid leukemia (AML) is t(8;21) (q22;q22), with rearrangement of the AML1 gene on chromosome 21q22 and the ETO gene on chromosome 8q22. In adult AML1/ETO-associated leukemia patients, chemotherapy alone results in cure rates that are comparable to or better than those achieved with allogenic bone marrow transplantation. Despite the relatively good prognosis of AML1/ETO fusion transcript, relapse of leukemia remains the most common cause of treatment failure. Monitoring minimal residual disease (MRD) in leukemia has two main aims : to assess the effectiveness of treatment and to detect early signs of relapse. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)- based methods is the rapid and sensitive method in the identification of this molecular abnormality.
The purpose of this study is to ensure the usefulness of the RT-PCR technique for detecting MRD in AML1/ETO-associated leukemia patients in remission and to establish the correlation of the serial detection of AML1/ETO fusion transcripts after complete remission and long-term outcome.
Methods : From the bone marrow aspirates of 25 AML1/ETO positive AML patients, serial detection of AML1/ETO fusion trascripts was performed using RT-PCR.
Results : AML1/ETO fusion transcripts were positive in 14 cases who did not show t(8;21). In serial assay, AML1/ETO fusion transcripts was positive in 9 cases and negative in 13 cases at 10 weeks after complete remission. AML1/ETO fusion transcripts (＋) group has 107.4±18.2 months suvival and AML1/ETO fusion transcripts (-) group has 47.3±18.0 months survival. However, there is no significance (P=0.11).
Conclusion : This study suggests that the early negative conversion of AML1/ETO fusion transcript may be the good prognostic predictor. The RT-PCR technique is useful for detecting minimal residual disease in leukemia patients in remission and it may improve the therapeutic strategy for leukemia. (Korean J Hematol 2003;38:15～23)
Key Words : AML1/ETO fusion transcript, RT-PCR, Acute myeloid leukemia, t(8;21)
서 론
급성골수성백혈병은 임상양상, 골수아구의 형태학적인 특징, 치료에 대한 반응이나 장기적인 예후의 면에서 다양 한 이질적인 질환의 복합체로, 병인과 관계된 분자유전학 적인 이상에서의 이질성으로 임상양상이나 치료반응을 예 측할 수 있는 특정한 환자 군으로 구분할 수 있다.1) 따라서 세포유전학적 이상소견은 혈액종양질환의 가장 중요한 예 후인자 중의 하나로서 진단과 병태생리를 이해하는데 뿐 아니라 환자의 치료에 대한 반응을 평가하기 위해서도 이 용될 수 있으며 이는 각 환자에 맞는 치료방법을 선택하여 완치의 기회를 증진시킬 수 있을 것으로 생각된다.1)
급성골수성백혈병 환자에서 가장 흔히 관찰되는 세포유 전학적인 이상은 t(8;21)(q22;q22)로 전체 환자의 약 5∼
10%에서 관찰된다. 특히, FAB분류상 M2환자의 18∼40
%에서 관찰되고 t(8;21)양성 환자의 90%이상이 FAB- M2 형태를 보인다.1,2) 분자생물학적으로 두 염색체간의 전좌로 인해 절단부위인 8번 염색체의 ETO유전자와 21번 염색체의 AML1유전자사이의 재배열을 일으켜 8번 염색체 에 AML1/ETO융합유전자를 형성한다. AML1유전자는 정 상조혈과정에 중요한 조절인자인 AML1/CBFβ 전사복합 체의 DNA 결합부위로 밝혀졌다.3) 급성백혈병의 치료과정 에서, 미세잔존질환(minimal residual disease, MRD)을 측정하여 예후를 추정하는 것이 중요하다. 검출방법으로는 염색체검사, 분자생물학적 방법, interphase-FISH, 유세 포분석 등이 있으며, 유세포분석과 역전사중합효소연쇄반 응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법은 높은 예민도 때문에 많이 이용되고 있 다.4∼7) 이전의 미세잔존질환에 대한 연구에서, t(9;22)- 양성 급성림프구성 및 만성골수성백혈병 환자에서 골수이 식 후,8) 또는 t(15;17)과 연관된 전골수성백혈병환자에서 all-trans retinoic acid와 화학요법으로 유도된 완전관해 후, 연속적으로 측정한 PCR결과가 음성인 경우 장기무병 생존과 연관이 있다.9∼14) 그러나, 관해 상태에 있는 t(8;21) 연관 백혈병 환자에서 미세잔존질환측정의 의의에 대해서는 논란이 있다.4∼6) t(8;21)과 관련된 급성백혈병의 경우, 항암화학요법만으로도 조혈모세포이식의 경우와 비 슷한 60%정도의 완치율을 보일 정도로 예후가 좋다. 그러 나, 치료 실패의 주 요인이 재발이므로 조기에 재발을 예측 하여 조혈모세포이식과 같은 치료전략을 세우는 것이 중요 하다.7) AML1/ETO와 관련된 급성골수성백혈병 환자에서 RT-PCR을 이용하여 연속적인 AML1/ETO를 측정하여 이 의 임상적 의의를 알아보기 위한 여러 연구가 있었으나, 서
로 상반된 결과를 보였고 지역적으로도 AML1/ETO 양성 률에 차이를 보였다.15,16)
국내에서는 급성골수성백혈병에서 AML1/ETO융합유전 자 양성인 환자의 임상적, 세포유전학적인 특징이 보고되
었으나17,18) 이의 미세잔존질환 측정으로서의 의의에 대해
서는 보고된 바가 없기에, 저자들은 RT-PCR을 이용하여 25명의 성인 AML-M2 환자에서 연속적인 AML1/ETO 유 전자 재배열의 변화양상을 알아보고, 각 환자의 재발, 생 존율과 AML1/ETO유전자 재배열의 변화양상 사이의 연관 성을 알아보았다.
대상 및 방법 1. 대 상
1989년 3월부터 2000년 3월까지 FAB AML-M2로 진단 받은 환자 중, RT-PCR 검사 상 AML1/ETO 양성이고 항 암화학요법 후에 완전관해에 도달한 후 추적 골수검사를 시행한 25명을 대상으로 하였다. 관해유도요법 개시 후 28 일째 골수검사를 시행하여 골수소견 상 골수 아세포가 5%
미만이고 세포충실도가 20%보다 큰 경우 완전관해로 판정 하였다.19) 관해 유지 기간은 골수 검사 상 완전관해로 판정 된 날부터 재발이 확인된 날까지로 하였고, 생존기간은 진 단된 날부터 사망까지의 기간으로 계산하였다. 골수조직은 진단 당시와 완전관해 후에 다양한 시간간격을 두고 채취 하였다.
2. 방 법
1) 골수세포의 분리
골수세포는 heparin (50U/mL) 처리된 50mL 원심용 시 험관(Falcon 2070, Oxnard, CA, USA)에 취하여 Ficoll- Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 비중 원심분리법
20)으로 단핵세포를 분리하여 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)용액으로 3회 원심세척하였다. 0.5∼2×
107개 세포에 1mL의 10% DMSO (dimethylsulfoxide)/
90%FBS (fetal bovine serum) 또는 1mL의 RNAzolTMB (Tel-Test, Inc, Friendswood, TX, USA) 용액을 가하여 혼합한 후 -70℃에 보관하였다.
2) 세포주 배양
AML1/ETO의 양성대조검체는 Kasumi-1 세포를 사용 하였고 Hiroshima 대학의 Nanao Kamada교수21)로부터 기 증받았다. 음성대조검체는 K562 세포주를 사용하였다. 세 포주 배양은 10% 우태혈청(fetal calf serum, FCS)이 첨
가된 RPMI1640 조직배양액(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에 2mM의 L-glutamine, 100U/mL의 페니실린, 100U/mL의 스트렙토마이신, 0.25µg/mL의 fungizone을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 계대배양하였으며, RNAzolTMB용액에 혼합하여 RNA를 분리하였다.
3) RNA 분리
RNA분리는 RNAzolTMB 분리방법에 의해 세포를 균질 화(homogenization) 시키고 0.1배의 chloroform을 첨가하 여 15초간 흔들어 준 다음 4℃에 5분간 방치한 후 12,000 g (centrifuge 5402, eppendorf, West Germany)에 15분 간 4℃에서 원침하였다. 400µL의 상청액을 1.5mL tube에 옮겨22) 동량의 isopropanol을 넣고 4℃에 5분간 방치한 후 12,000g에 15분간 4℃에서 원침하였다. 상청액을 버리고 75% ethanol을 넣고 세척한 다음 7,500g에 8분간 4℃로 원침한 후 상청액을 버리고 진공건조기(Centra evap- orator, Bioneer, Korea)에 10분간 건조시켰다. 이를 diethyl pyrocarbonate (DEPC)처리된 water에 용해시킨 후 spectrophotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia Bio- tec, UK)를 이용하여 260nm에서 RNA 농도를 측정하였 다. A260/A280의 흡광도비는 1.5∼1.7이었으며 RNA는 -20℃에 보관하였다.
4) Primer 합성
Downing 등1)이 도식한 primer를 (주)바이오니아에 주 문 제작하고 denaturing polyacrylamide gel electro- phoresis (PAGE)와 gel elution으로 고순도 정제한 pri- mer를 사용하였다. Primer의 염기서열은 Table 1과 같다.
5) RT-PCR 방법
cDNA합성방법은 cDNA synthesis reactions kit (Roche, Manheim, Germany)를 이용하였다. AML1/
ETO 1차 PCR반응은 10µL cDNA 반응물, 1×PCR buffer, 0.001%의 gelatin, 2.5µL의 DMSO (dimethyl- sulfoxide), 20pmol의 5'A primer와 3‘A primer, 1unit의 Taq DNA polymerase를 넣고 멸균된 증류수로 50µL가 되
게 조정하였다. PCR 반응은 Thermal cycler (Perkin Elmer 9600, USA)에서 일회 95℃, 5분간 denaturation시 행한 후, 94℃ 1분간, annealing은 55℃ 1분간, extension 은 72℃ 1분간을 35주기 시행하였다. β-actin PCR 반응은 20pmol의 primer외에는 동일한 방법으로 조성하였으며, PCR반응은, denaturation은 94℃, 1분간, annealing은 5 5℃, 1분 30초, extension은 72℃, 1분 30초를 35주기로 시행하였으며 마지막 72℃에 7분간 증폭하였다. 2차 PCR 은 5µL의 1차 PCR 반응물, 1× PCR buffer, 1.5mM의 MgCl2, 200µM의 dNTP, 0.001%의 gelatin, 2.5µL의 DMSO, 20pmol 의 5‘B primer와 3'B primer, 1unit의 Taq DNA polymerase를 혼합하여 최종용량을 50µL로 하 였다. PCR반응은 1차 반응과 동일한 조건으로 시행하였 다. PCR생성물의 확인은 1% agarose gel에서 전기영동하 여 UV transilluminator로 띄(band)를 확인하였다.17,18) DNA size marker는 100bp ladder를 사용하였으며 1차 생 성물 338bp, 2차 생성물 185bp, β-actin은 267bp의 띄를 확인하여 양성을 판정하였다.
6) 민감도 측정
1µg의 Kasumi-1 RNA와 1µg의 K562 RNA를 정량비로 각각 10-2에서 10-6희석하여 RT-PCR과 nested PCR을 동 일조건으로 시행하였다.
7) 통계분석
환자의 생존율은 Kaplan-Meier 방법으로 나타내었고 각 군의 생존율의 차이는 log-rank test로 비교하였다. P값이 0.05미만인 경우를 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.
Table 1. The oligonucleotide primers used for the RT-PCR analysis of AML1/ETO fusion transcripts Oligonucleotide sequences
1st PCR 5'A primer 5'AGCCATGAAGAACCAGG3' 3'A primer 5'AGGCTGTAGGAGAATGG3'
2nd PCR 5'B primer 5'TACCACAGAGCCATCAAA3' 3'B primer 5'GTTGTCGGTGTAAATGAA3'
β-actin PCR 5' primer 5'TACCTCATGAAGATCCTCA3'
3' primer 5'TTCGTGGATGCCACAGGAC3' Fig. 1. Remission duration of patients with or without t(8;21)(q22;q22) (P=0.8204).
months
160 140 120 100 80 60 40 20 0
Proportion of relapse
1.0
.8
.6
.4
.2
0.0
t t(8;21)(q22:q22)
Positive (N=10) Negative(N=14)
결 과 1. 임상적 특성
대상환자들의 중앙 연령은 37세였고 남자환자는 16례, 여자환자는 9례였다. 25례의 AML1/ETO 양성 환자 중 진 단당시 염색체 검사를 시행한 경우는 24례로, 이상을 보인 경우는 10례(42%)였으며 이들 모두가 t(8;21)을 보였고, Y염색체 소실이 6례에서, 9번 염색체 이상이 3례에서 보였 다. 복합적인 염색체 이상을 보인 경우는 1례로 2회의 관해 유도 화학요법 후에 완전관해에 도달하였고 염색체 이상도 소실되었으나, 12개월 후 재발시 이전의 염색체 이상과 함 께 추가적인 염색체이상이 발생하였다. 진단당시 염색체 이상을 보이지 않았던 2번 환자는 재발당시 복합적인 염색
Fig. 2. Overall survival of patients with or without t(8;21) (q22;q22)(P=0.7692).
months
160 140 120 100 80 60 40 20 0
Cumulative Survival
1.0 .9 .8 .7 .6 .5 .4 .3 .2
.1 0.0
Table 2. Clinical and cytogenetic findings in 25 acute myeloid leukemia patients with AML1/ETO fusion transcripts at presentation
Patient AGE SEX Chromosomal study Last status (cause of death) Survival(months)* First CR duration(months)† 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
31 30 34 36 38 37 45 16 37 33 58 61 19 32 51 36 24 61 23 24 63 38 36 57 38
M M F M M M M F M F F M F M F M M M M M F M F F M
46,XY 46,XY‡ 46,XX 46,XY
complex changes§ 46,XY
45,X,-Y,t(8;21):44X,-Y,-9,t(8:21) 46,XX,t(8:21)
46,XY
46,XX,-9(q22),t(8;21) 46,XX
45,X,-Y,t(8:21) 46,XX
45,X,-Y/46XY:46XY, t(8:21) 46,XX
46,XY
46,XY,t(8:21)/45X,-Y 46,XY
46,XY 46,XY,t(8:21) 46,XX
45,X,-Y t(8:21)/46XY 46,XX,t(8:21), -9(q22) not done
46,XY
CCR D (R) D (ICH) D (R) CR CCR CCR CCR CCR D (R) D (R) D (CVA) D (infection) D (R) D (ARF) D (toxic hepatitis) D (CVA) CCR CCR D(R) CCR CCR CCR D(R) CCR
118＋
19 1.5 12 21＋
149＋
113＋
151＋
123＋
18 13 24 11 8 4 16 26 113＋
148＋
16 48＋
55＋
69＋
84 150＋
117＋
8 0.5 11 12 6 112＋
150＋
122＋
11 8 11 9 5 3 8 8 112＋
147＋
10 21 54＋
68＋
8 137
*＋after survival indicates that the patient is alive
†＋after the number of months indicates that the patient is in continuous remission
‡36∼39,X,-X,-7,-18, etc./46,XX in relapse
§39,X,-Y,-2,-5,-8,-21,-22/46,XY; 45,X,-Y,t(8;21)(q22;22); 45,X,-Y,t(8;21)(q22;q22)/46,XY, initially 58,XY,＋X,-5,＋6,t(8;21)(q22;q22),＋11,＋12<17x2＋18,＋19x2＋20,＋21,＋22x2/46,XY in relapse
Abbreviations : CCR, continuous complete remission; D, death; R, relapse; ICH, intracranial hemorrhage; ARF, acute renal failure; CVA, cerebrovascular accident
t(8;21)(q22:q22)
Positive(N=10) Negative(N=14)
체이상을 보였다(Table 2).
골수외 종괴형성은 4례(16%)에서 있었고 이중 1례는 종격동에 나머지 3례는 중추신경계에 발생하였고 2례에서 만 염색체 이상을 보였다. 4례 중 3례에서 재발되었으며 나
머지 1례는 관해유도 후 1개월 이내에 조기 사망하여 4례 모두 20개월 이내에 사망하였다. 비장종대나 간종대, 림프 절종대는 6례(25%)에서 있었으며 이 중 3례는 염색체 이 상을 보였다.
Fig. 3. The results of RT-PCR study for 25 AML-M2 patients with AML1/ETO fusion transcripts. ꀻ, chemotherapy; ●, positive by the first-step PCR; , positive by the second-step PCR; ○, negative by the second-step PCR; , morpho- logically detectable disease state; , remission states; D, dead; NED, no evidence of disease. The survival time is indicated in months after start of chemotherapy.
2. 치료에 대한 반응
전체환자의 1차관해유지기간은 중앙치 11개월(2주∼150 개월)이었다. t(8;21)전위가 있는 환자에서는 중앙치 11개 월(5∼150개월), 평균치는 65.7개월이었고 전위가 없는 환자에서는 중앙치는11개월(범위 0.5∼147개월), 평균치 는 65.1개월이었다(Fig. 1). 중앙생존기간은 전체환자에 서는 26개월(1∼151개월)이었으며, t(8;21)이 있는 환자 에서는 26개월(8∼151개월), 평균생존기간은 80.5개월이 었다. t(8;21)이 없는 환자는 19개월(1∼149개월), 평균 생존기간은 80.5개월로 통계학적으로 의미있는 차이는 없 었다(Table 2, Fig. 2, P=0.7692).
3. 연속적인 RT-PCR 추적검사 결과
본 연구에서 1차 PCR에서 융합유전자 검출의 민감도는 10-5이었고 이후 양성대조검체는 10-4농도를 사용하였다.
진단당시와 완전관해 후, 그리고 다양한 기간에 걸쳐 시 행한 추적 RT-PCR 검사결과를 보면 23명의 환자에서는 진 단당시의 골수를 사용할 수 있었으나 환자 6과 24는 재발당 시의 골수로 초기 검사를 시행하였다. 진단당시의 검사상 1차 PCR에서 양성이 된 경우는 15명이었고 2차 PCR에서 양성이 된 경우는 6명이었다. 환자 21과 환자 25는 진단당 시에는 2차 PCR에서 양성이었으나 재발 시에는 모두 음성 이었다. 환자 9는 초기검사에서는 음성이었으나 1개월 후 추적검사 상 2차 PCR에서 양성이었고 환자 16은 초기에는 음성이었으나 재발당시에 양성으로 나타났다. 장기무병생 존을 보인 환자 중 환자 22와 환자 23에서 완전관해 후 48 개월과 61개월에 AML1/ETO 융합유전자 음성이었고 현재 각각 55개월과 69개월 장기무병생존 중이다(Fig. 3).
진단당시의 골수검체가 없는 2례와 관해 후 10주 내에 사망한 1례를 제외하고, 연속적인 RT-PCR검사에서 1차 완전관해 후 10주까지 AML1/ETO 융합유전자가 양성이었 던 경우는 9례로 이 중 7례는 재발 또는 사망하였으며, 1차 관해유지기간은 중앙치 10개월, 평균치는 39.9개월이었고 평균생존기간은 47.3개월이었다. 음성인 경우는 13례로 재 발은 6례, 사망은 4례이었으며 1차 관해유지기간의 중앙치 는 137개월, 평균치는 88.5개월이었고 평균생존기간 107.4개월로, 10주 내에 음성으로 전환된 환자 군에서 더 높은 생존기간을 보였으나 두 군 사이에 의미있는 차이는 없었다(Fig. 4, 5). 10주 내에 AML1/ETO 융합유전자 음 성을 보이고 장기 무병생존한 환자 2례인 환자 6과 환자 7 은 각각 완전관해 후 1주와 4주에 AML1/ETO 융합유전자 음성을 보였고 이후 장기무병생존을 보였으나, 10주 이후 에도 계속 양성을 보이고 재발 후 사망한 2예인 환자 2와 환자 17은 각각 완전관해 후 12주와 14주에도 양성을 보였 으며 재발되어 사망하였다(Fig. 6).
고 안
본 연구에서 1차 PCR에서 융합유전자검출의 민감도는 10-5이었고 이전 연구와 비슷한 결과이다.3,11,16) 완전관해 된 AML1/ETO양성이었던 25명을 대상으로 AML-M2환자 에서 AML1/ETO 융합유전자 양성이 86%로 이전의 보고
1,2,21)
에서의 18∼40%보다 높았으나 이는 관해에 도달한 환자를 대상으로 하였기 때문으로 추정된다. 또한 t(8;21) Fig. 5. Overall survival of patients with or without AML1/ETO
fusion transcripts at 10 weeks after complete remission (P=0.1136).
Proportion of SurvivalProportion of Survival
Fig. 4. Disease free survival of patients with or without AML1/ETO fusion transcripts at 10 weeks after complete remission (P=0.1213).
Proportion of SurvivalProportion of Survival
유무에 따른 환자의 생존율에는 의미 있는 차이를 보이지 않아 AML1/ETO 융합유전자 존재여부가 환자의 예후에 더 중요한 것으로 보이고, t(8;21)이 없는 14명의 환자에 서도 AML1/ETO 융합유전자가 양성인 것으로 보아 염색 체이상이 없는 환자라도 진단과정에 분자생물학적인 검사 를 이용해야 할 것으로 보인다.1,12) 환자 9과 16의 진단당 시 RT-PCR 결과가 음성인 것은 이후 추적검사상 양성의 결과를 보아 초기검체의 RNA가 분해되어 검출되지 않았을 가능성이 있다. 미세잔존질환이란, 말초혈액 및 골수의 현 미경 판독 상 완전관해 상태에 있는 백혈병환자에서 검출 할 수 있는 백혈병세포를 말하며, 관해상태에 있는 백혈병 환자의 골수에는 109개 이하의 백혈병세포가 존재한다.7) 미세잔존질환을 측정하는 목적은 항암치료 후 체내에 잔존 하는 암세포의 양을 주기적으로 측정하여 각각의 환자들에 게 맞는 최적의 항암치료를 적용하여 완치율을 높이고, 자 가 조혈모세포이식 시 백혈병세포의 오염정도를 평가하는 데 있다.5∼7) 본 연구에서는 연속적인 RT-PCR검사에서 완 전관해 후 10주까지 AML1/ETO 융합유전자가 양성이었던
경우는 9례로 39.9±19.1개월의 1차관해유지기간과 107.4
±18.2개월의 생존기간을 보였으며, 음성이었던 경우는 13 례로 88.5±19.0개월의 1차관해유지기간과 47.3±19.0개 월의 생존기간을 보여 두 군 사이에는 의미있는 차이는 없 었으나, 대상환자 수가 적은 것이 원인일 것으로 보인다.
미세잔존질환 측정에서 RT-PCR을 적용하는 문제는 논 란이 있다. 동종골수이식을 포함한 장기 관해상태에 있는 환자에서 여전히 AML1/ETO 융합유전자가 검출되었으나
5,6,11)
최근의 연구에서는 장기 관해상태에 있는 환자의 골 수에서 AML1/ETO 융합유전자검출에 실패하였다.12,15) 이 렇게 다른 결과가 도출되는 데에는 치료방법이나 RT-PCR 방법의 민감도 차이 때문이라고 생각되며 장기 무병생존의 경우, 완전관해 후 정성적인 RT-PCR에서 계속 양성을 보 인 경우라도, 정량검사에서는 점차 감소하는 양상을 보이 고 결국에는 검출되지 않는다. 따라서 AML1/ETO 융합유 전자를 가진 백혈병세포는 항암요법이나 골수이식 후에도 일정기간 살아있을 수 있으나 결국에는 면역학적, 또는 다 른 항 백혈병 기전에 의해 제거되는 것으로 보인다. 정량적 Fig. 6. Serial results of RT-PCR of AML1/ETO fusion transcripts for patient 6 (A) and patient 7 (B)
in continuous complete remission, and for patient 2 (C) and 17 (D) in dead: Lane 1 is a size marker. Lane 2 is a positive control using 10-4 diluted RNA isolated from Kasumi-1 cell line. Lane 3 and after that are the serial results of RT-PCR for each patients: The first-step PCR detects 338bp fusion transcript and the second-step PCR detects 185bp fusion transcript and the RT-PCR for β-actin is detected in 267bp size.
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B 1 2 3 4 5 6 7
β-actin
1st PCR
2nd PCR
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 D 1 2 3 4 5 6 7
β-actin
1st PCR
2nd PCR
RT-PCR을 이용하여 혈액학적, 세포유전학적 관해상태인 환자에서 형태학적 진단보다 2∼4개월 선행하여 재발을 진 단할 수 있어 향후 재발의 위험성이 있는 환자에게 조기에 추가적인 화학요법을 시행하거나 골수이식과 같은 다른 치 료법을 적용하여 재발을 방지하는데 도움을 줄 수 있다.6∼
11,25)
관해상태에 있는 환자에서 재발 전에 융합유전자의 증가를 확인하기 위해 RT-PCR 검사는 처음 몇 년간은 3개 월 간격으로 하는 것이 제안되었는데 이는 장기관해를 예 측할 수 있는 1.5×103 AML1-MTG8 molecule/µg of RNA 미만의 결과를 보이는 마지막 관해와 임상적인 재발 사이에 6개월의 기간을 보였기 때문이다.7) 본 연구에서는 AML1/ETO 양성 급성백혈병 환자에서 치료 후 AML1/
ETO의 변화양상을 연속적으로 관찰하여, 이 변화양상과 환자의 재발 및 생존이 연관성이 있는지 관찰한 결과, 조기 에 AML1/ETO융합유전자가 검출되지 않는 경우에 재발과 사망이 적음을 확인하였다. 따라서 정량검사든 아니든 간 에 AML1/ETO와 연관된 급성골수성백혈병 환자를 대상으 로 연속적인 RT-PCR검사를 시행하여 각 개인에 맞는 치료 전략을 세워야 할 것이다.
요 약
배 경 : t(8;21)과 관련된 급성골수성백혈병의 경우, 항 암화학요법만으로도 조혈모세포이식의 경우와 비슷한 60
%정도의 완치율을 보일 정도로 예후가 좋다. 그러나, 치 료 실패의 주요인이 재발이므로 조기에 재발을 예측하여 조혈모세포이식과 같은 치료전략을 세우는 것이 중요하다.
미세잔존질환측정은 치료효과를 판정하고 재발을 조기에 발견하기 위한 것으로 역전사중합효소연쇄반응방법은 빠르 고 예민도가 높아 많이 이용되고 있다. 본 연구의 목적은 관해상태에 있는 AML1/ETO 양성 급성백혈병환자에서 미 세잔존질환을 측정하는데 있어서 역전사중합효소연쇄반응 의 유용성과 AML1/ETO융합유전자의 연속측정과 장기예 후와의 연관성을 알아보기 위한 것이다.
방 법 : 진단당시와 관해 후 다양한 시간 간격을 두고 연 속적으로 골수 또는 말초혈액에서의 AML1/ETO 융합유전 자를 측정하였다.
결 과 : 25례의 AML1/ETO양성백혈병 환자 중 14례에 서 t(8;21)을 보이지 않았다. AML1/ETO 융합유전자를 연속 측정한 결과, 1차 완전관해 후 10주까지 AML1/ETO 융합유전자가 양성이었던 경우는 9례로 이 중 7례는 재발 또는 사망하였으며, 평균생존기간은 47.3개월이었다. 음 성인 경우는 13례로 재발은 6례에서 사망은 4례에서 보였 으며 평균생존기간은 107.4±18.2개월로, 10주 내에 음성
으로 전환된 환자 군에서 더 높은 생존기간을 보였으나 두 군 사이에는 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다 (P=0.11).
결 론 : 관해상태의 급성백혈병환자에서 미세잔존질환을 측정하는데 역전사중합효소연쇄반응이 유용하고 조기에 AML1/ETO융합유전자가 검출되지 않는 경우에 재발과 사 망이 적음을 확인하였다. 따라서 AML1/ETO양성 급성골 수성백혈병 환자를 대상으로 하는 연속적인 역전사중합효 소연쇄반응을 시행하여 각 개인에 맞는 치료전략을 세우는 데 기초를 제공하리라 생각된다.
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