제13장 핵산 생물공학 기술장 핵산 생물공학 기술

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제 13 장

핵산 생물공학 기술

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주사전자현미경으로 관찰한 인간 염색체 .

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그림 13.1 젤 전기영동에 의한 올리고뉴클레오타이드의 분리 .

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최근에 죽은 돌리 (Dolly). 클로닝 기술로 만들어진 세계에서 가장 유명한 양 .

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그림 13.2 젤 전기영동을 하는 데 사용하는 실험 장치 .

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전기영동

1) 전기영동이란 ?

박테리오파지 DNA 를 HindIII 제한 효소로 절단 한 후 전기영동한 사진 .

* DNA 와 같이 전하를 띤 고분자 물질을 전기장을 띤 매질 ( 젤 ) 에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법

* 아가로오스 젤 전기영동과 아크릴아마이드 전기영동

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아가로오스 젤 전기영동 장치 (A) 및 젤 상에서의 DNA 이동 모습 (B).

(1) 아가로오스 젤 – 전기영동 장치 및 젤 상에서의 DNA 모습

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(1) 아가로오스 젤 – 아가로오스 젤 전기영동 원리

아가로오스 젤의 현미경 사진 (A) 과

아가로오스 젤 전기영동의 원리 (B).

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그림 13.3 자가방사기록 사진의 예 .

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DNA 의 회문 구조의 한 예 .

제한효소의 작용 메커니즘 - 회문 구조

제한효소의 DNA 인식 및 절단 부위는 회문 구조 (palindrome)

회문으로 된 긴 한 시 그림 4.8 제한효소 Eco RI 의 작용 .

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그림 13.4 DNA 의 메틸화 .

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그림 13.5 제한효소를 이용한 DNA 가수분해 .

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벡터

• 벡터; 유전자의 운반체

• 종류; 바이러스. 플라스미드

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그림 13.6 재조합 DNA 의 생산 .

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그림 13.7 바이러스의 클로닝 .

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그림 13.8 세포의 클로닝 .

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플라스미드 DNA- 박테리아 세포의 자가복제 유전요소로 , 염색체와는 별개이다 .

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그림 13.9 바이러스 벡터를 이용한 인간 DNA 조각의 클로닝 .

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그림 13.10 박테리아 플라스미드 내에 들어 있는 재조합 DNA 의 선별 .

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그림 6.8 열 충격 방법에 의한 형질전환 과정 .

③ 박테리아 형질전환

i. 열충격 방법

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형질전환된 세포의 선발

; 재조합 플라스미드 벡터의 확인

(1) 항생제에 의한 선발

항생제 표지자 ( 이 경우는 앰피실린 ) 에 의한 형질전환체의 선발 과정 .

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그림 13.11 pBR322 플라스미드 .

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그림 13.12 다중 제한효소 부위가 포함되어 있는 벡터 클로닝 부위 .

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그림 13.13 pUC 계열의 플라스미드들은 매우 널리 사용되고 있다 .

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삽입 비활성화에 의한 형질전환체 선발과정 (A) 과 실제로 발색 된 콜로니사진 (B).

* 삽입 비활성화에 의한 형질전환체 선발 과정

X-gal 과 암피실린

*** X-gal 은 β- 갈락토시데이즈에 의

해

가수분해되어 청색을 띠게 됨 .

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그림 13.14

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그림 13.14

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그림 13.14 청 / 백 스크리닝을 통한 클론의 선별 .

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그림 13.15 아노펠리즈 갬비아 (Anopheles gambiae) 모기의 암컷 성체 두 마리 .

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형질전환된 겨자식물이 유익한 포식자를 유인한다 .

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그림 13.16 인간 인슐린의 합성 .

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박테리아에서 인간단백질 생산 시 문제점

• 스플라이싱 기작이 없다 .

• 번역 후 변형이 거의 일어나지 않는다 . 즉 , 이런 가공에 필요한 효소가 없다 .

• 어떻게 인슐린을 박테리아에서 생산할까 ?

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그림 13.17 재조합된 인간 인슐린의 생산 .

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형질전환의 이용

① 단백질 산물 획득

② 기능성 생명체 획득

③ 유전자 클로닝 기능

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Figure 12.1B_s2

대장균

박테리아염색체 플라스미드 분리 .

관심있는 유전자 플라스미드

DNA 분리

DNA

유용한 유전자가를 포함하고 있는 세포

1

3

2

4

효소로 플라스미드를 자름 .

같은 효소로

세포의 DNA 를 자름 관심있는 유전자

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Figure 12.1B_s4

대장균

박테리아염색체 플라스미드 분리 .

관심있는 유전자 플라스미드

세포 DNA 분리 .

DNA

유용한 유전자가를 포함하고 있는 세포

1

3

2

4

5

6

효소로 플라스미드를 자름

같은 효소로

세포의 DNA 를 자름 관심있는 유전자

표적조각과

플라스미드 DNA 를 재조합

DNA 연결효소첨가 .

관심있는 유전자 재조합DNA

플라스미드

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Figure 12.1B_s7

관심있는 유전자 플라스미드를

박테리아에 형질전환한다 .

수확된 단백질은 직접 이용될 수도 박테리아의 증식 있다 .

세포의 클론 재조합박테리아 재조합DNA 플라스미드

유전자가 다른 생물체에 삽입될 수 있다

9 7

8

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Figure 12.1B_8

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Figure 12.1B_9

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Figure 12.1B_10

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Figure 12.1B_11

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그림 13.18 pET 발현 벡터 .

* 발현벡터의 특징 . 프로모터

. 전사종결신호

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. 벡터란 무엇인가 ?

플라스미드나 박테리오파지와 같은 DNA 로서 , 세포

형질전환을 통해 특정 유전자나 DNA 를 자신에 삽입시

켜 재조합 DNA 를 만든 후 , 이것을 숙주세포로 전달

하여 많은 수로 복제될 수 있도록 하거나 또는 단백질로

발현될 수 있도록 하는 DNA 운반체 .

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플라스미드 벡터의 구조와 특징

pBluscript 벡터를 예로 본 박테리아 플라스미드 DNA 의 구성 .

a. 복제 원점

b. 항생제 저항 유전자

c. 제한효소자리 집단 (MCS)

d. LacZ 유전자 ( 필수는 아

님 )

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재조합 DNA 기술의 전 과정

그림 6.24 유전자 재조합과 그 이용의 전 과정 .

1) 재조합 DNA 분자의 제작 2) 숙주세포로 운반

3) 숙주세포의 분열과

재조합 DNA 분자의 증식 4) 클론을 형성하는 다수의 세포 획득

5) 유용 유전자의 클론 획득 또는 유용 유전자의 산물이나 기능성 생명체 획득

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에포젠 .

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재조합 세포와 동물을 이용해 유전자 산물을 대량 생산할 수 있다 .

 최근 제약회사들은 재조합단백질을 대량으로 생산하기 위해서 배양세포가 아닌

• 동물

• 식물

 유전자 재조합 동물

• 만들기도 어렵고 생산비도 높다 .

• 일단 재조합동물이 생산되면 그것을 복제 !!

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Figure 12.6A

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그림 13.19 유전자전환 토마토 .

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식물세포의 전형성능

식물 형질전환 방법

식물 형질전환과 조직 배양

* 대부분의 식물 형질전환 방법은 식물조직 배양을 수반

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그림 식물 형질전환을 위한 식물 조직배양의 이용 .

* 식물 형질전환을 위한 식물 조직배양의 이용

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유전자변형생물이 농업을 변화시키고 있다

 새로운 유전자를 식물세포에 도입하는데 일반적으로 사용하는 벡터는

• 토양미생물인 Agrobacterium tumefaciens 에서 분리한 플라스미드를 사용함 .

• 이 플라스미드를 Ti 플라스미드하고 부름 .

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그림 토양 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens 의 전자현미경 사진 (A) 과 담배에서의 근두암종 (B).

애그로박테리아를 이용하는 방법

에그로박테리아와 근두암종 (crown gall)

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그림 T-DNA 가 아그로박테리아로부터 이동하여 식물 유전체로 삽입되는 과정 .

읽을 거리

T-DNA 가 식물 유전체 내로 삽입되는 과정

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친화성 크로마토그래피와 융합단백질을 합치면 단백질이 효율적으로 정제된다 .

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유전자 라이브러리 제작

• 유전자 라이브러리 (gene library): 한 생명 체의 조직이나 세포의 모든 유전자를 포함하 는 DNA 클론 집합

• 라이브러리의 종류

• - 유전체 라이브러리

• - cDNA 라이브러리

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그림 13.20 DNA 라이브러리를 구축하는 순서 .

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그림 13.21 콜로니 혼성화 ( 또는 플라크 혼성화 ) 에 의한 유전체 라이브러리의 탐색 ( 스크리닝 , screening).

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그림 13.22 cDNA 합성 .

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캐리 멀리스 (Kary B. Mullis). 중합효소연쇄반응의 발명자이며 1993 년도 노벨화학 상 수상자이다 .

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그림 13.23 중합효소연쇄반응 (PCR).

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그림 PCR 은 매우 민감하다 .

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중합효소 연쇄반응법

(polymerase chain reaction, PCR)

• 프라이머와 내열성 DNA 중합효소를 이용 짧은 시간 내에 DNA 를 증폭

• DNA 를 변성 (denaturation),

• 프라이머를 표적 DNA 에 결합 (annealing),

• DNA 사슬을 신장 (extension)

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PCR 을 위한 DNA 주형 .

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그림 PCR 을 위한 프라이머 .

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그림 17-7 50~60℃ 에서 프라이머 결합 .

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10 억개

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그림 PCR 진단 .

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PCR

https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

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친자확인 (paternity test) 용 DNA 핑거프린트 .

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그림 13.24 서던 블롯 .

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그림 13.25 제한효소 - 절편 길이 다형성 (RFLP) 의 원리 .

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그림 13.26 친자확인 .

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그림 13.27 인간의 7 번 염색체에 있는 낭포성 섬유증 관련 유전자 (CF) 의 위치 결정 .

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392 쪽

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RNA 간섭 .

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그림 13.28 DNA 염기서열을 결정하는 데 사용되는 생어 - 쿨슨법 .

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그림 13.29 DNA 의 형광 표지와 자동화된 염기서열 결정에 사용된 방법론을 나타낸 그림 .

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그림 13.30 어레이의 작용 방식 .

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그림 13.30 ( 계속 )

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그림 13.31 발현 분석도 .

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그림 13.32 작동 중인 단백질 어레이 .