Establishment of Optimum Extraction Conditions and Wrinkle Improvement Evaluation of Glycosaminoglycans in Styela plicata

(1)

717

서 론

우리나라의기능성원료개발은최근지역의자원을활용하 여고부가가치소재를개발하기위한노력으로집중되고있다

(Kim and Byun, 2018).

이와같은과정을통한기능성효능을 가진원료의개발은주로육상식물자원에서추출및분리되어 왔다

.

육상동물을이용한원료는최근에발생한광우병

,

조류독 감

,

^구제역^등의^발생으로^인한^문제로^그^이용이^매우^제한적 인상황이다

.

이러한자원수급문제를해결하기위해서는해양 자원을이용한원료개발이매우절실한때이다

.

육상자원에비 해훨씬많은생물을보유한해양자원에대한고부가가치소재 의개발에관한연구는이제까지상대적으로덜진행되어왔으 나

,

^{육상생물자원의}^{고갈문제로}^인한^수요한계^해결^및^이를^대

체할수있는생물자원으로써최근많은관심속에연구가진행 되고있다

(Oh and Jung, 2015).

해양에생존하고있는

30,000

종이상의어류를포함한해양자원은다양한신규생리활성물 질의탐색자원으로서잠재적인가치를지니기때문에식품산업 뿐만아니라화장품및의약산업분야의자원으로서그중요성 이점점높아지고있다

(Jung, 2017).

피부는신체의외부를덮고있는하나의막으로여러가지외 부의자극

,

^장애

,

^건조^등의^환경^{요소로부터}^신체를^보호해^주 는다양한생리적기능을수행하여내부장기와그밖의체내기 관을보호조절하는역할을한다

(Lim et al., 2012).

진피층의섬 유아세포는진피층의섬유상단백질인

collagen

과

elastin

의발 현을담당하고있는데

,

나이가증가함에따라진피층에존재하 는섬유아세포의작용과그수가감소하여

collagen

^과

elastin

^등

오만둥이(Styela plicata)에서 글리코스아미노글리칸의 최적 추출조건 설정 및 주름개선 효능

네리 테리스 아리안·최병대*

경상대학교 해양식품공학과/해양산업연구소

Establishment of Optimum Extraction Conditions and Wrinkle Improve- ment Evaluation of Glycosaminoglycans in Styela plicata

Therese Ariane N. Neri and Byeong-Dae Choi*

Department of Seafood Science and Technology/Institute of Marine Industry, Gyeongsang National University, Tongyeong 53064, Korea

Styela plicata are naturally-occurring marine resources easily found along the coastlines that have established their niche as functional food and nutraceuticals ingredient along with their increasing consumer demand. Ascidian con- tain a large amount of dietary fiber but only the meat has been utilized and consumed while the rest of its parts are discarded. Also, various studies have been conducted on the meat of ascidians while studies on the functionality of the ascidian tunics, which were mostly undervalued, were scarce. In this study, we investigated and explored the glycosaminoglycans (GAGs) contents in the tunics of S. plicata , and their potential use as functional ingredient in pharmaceutical and nutraceutical applications. Sulfated GAGs and uronic acids contents were 8.9-10.7 g/100 g and 9.4-11.3 g/100 g, respectively. Highest GAGs content was extracted with optimum Brix at 7-9. Extraction efficiency using hot water at 121°C was 4.22% while enzyme extraction using Protamex was more efficient at 5.91%. GAGs extracted from S. plicata tunics exhibited collagenase inhibitory activity of 75.2% at 100 µg/mL and procollagen synthesis activity of 80.1% at 100 µg/mL.

Keywords: Collagenase inhibition, Extraction efficiency, Glycosaminoglycans, Procollagen synthesis, Styela plicata

*Corresponding author: Tel: +82. 55. 772. 9142 Fax: +82. 55. 772. 9149 E-mail address: [email protected]

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Received 6 July 2020; Revised 30 July 2020; Accepted 21 August 2020 저자 직위: 네리 테리스 아리안(대학원생), 최병대(교수) https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0717

Korean J Fish Aquat Sci 53(5), 717-724, October 2020

(2)

구조단백질의합성이감소되고

,

^피부^세포^내^수분이^손실되면 각질층의구조가변화된다

(Jeon and Yi, 2014). Collagen

은신 체곳곳에존재하는대표적인섬유상단백질로서

14

개의

type

이존재하며이중피부에는

type I collagen

이주로존재한다

.

특히최근화장품연구에서가장중요한기능성분중의하나인 항주름효과의연구에서항산화활성물질이자연노화또는광노 화피부의노화를보호하며

,

이로인해감소할수있는

procol-

lagen type I

단백질의양을증가시킴으로항산화작용으로인

한노화피부에효과적임을확인할수있었다

(Cui et al., 2019).

Collagen I

을분해하는

MMP-1 (matrix metalloproteinase I, collagenase)

^의^{효소활성을}^억제하여

collagen

^을^{보호함으로써} 피부조직의기계적특성을유지시켜피부의탄력을증가시키고 주름생성을예방하는데글리코스아미노글리칸의역할이중요 하다고하였다

(Campo et al., 2009).

일반적으로다당류는각각고유의기능을갖고있지만대체 로미용이나관절염

,

^혈류^개선

,

^눈의^피로^완화

,

^면역력^강화^및 자양강장에대한효과와관계가있다고알려져있으며

,

천연물 소재를기반으로하는건강기능식품및기능성화장품등에대 한일반인들의인식도높아지고있다

(Lee and Hong, 2014).

미 색류껍질에는여러종류의황산다당이존재하고종에따라그

함량및화학적특성에차이가있다고보고되어있으며

(Pavão

et al., 1989),

관련연구로는껍질성분및색소를이용한양식소 재개발연구

(Hong et al., 2002),

글리코스아미노글리칸의특성

(Jeong, 2003)

및조다당의면역활성

(Park et al., 2013)

등이진 행되어왔다

.

이와같이수산물의성분들이피부의역할을강 화하는여러연구들이진행되면서수산물에함유된특정성분 에대한상호작용을연구하는노력이이루어지고있다

.

해양무 척추동물유래의추출물은다량의글리코스아미노글리칸뿐만

아니라

30-50%

에달하는펩티드와각종아미노산등이함유되

어있다

.

따라서본실험에서는해양무척추동물오만둥이에함 유된글리코스아미노글리칸의최적추출조건을찾아내고그활 성을평가하고자하였다

.

재료 및 방법

재료

본실험에사용된미색류

[

멍게

(Halocynthia roretzi),

^미더덕

(Styela clava),

^오만둥이

(Styela plicata)]

^는

2017

년

3

월경남통 영시수산시장에서판매되는미색류의껍질을실험실로즉시 운반하여표면의이물질을제거하고깨끗이수세한후표면의 물기를털어내고분쇄기

(CR-100, Kyungseo E&P Co. LTD., Incheon, Korea)

에서

4-5 mm

로파쇄한후해수를제거하기위 하여수돗물에하루밤방치한다음

-70°C

의심온동결고

(Ilshin Biobase Co. LTD., Dongducheon, Korea)

에 저장하면서 실 험에사용하였다

.

실험에사용된효소로는

Protamex 1.5MG (Bacillus protease), Flavourzyme 500MG (Aspergillus ory-

zae), Papain (Carica papaya), Alcalase 2.4L (Bacillus licheni- formis)

^등

4

종을사용하였다

.

세포실험에사용된

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)

및

fetal bovine serum (FBS)

시약은

Hyclone Co. (Thermo Scientific Inc., Logan,

UT, USA)

의제품을사용하였고

,

그외에실험에사용된분석

용시약

, penicillin-streptomycin

^혼합용액

, lipopolysaccharide (LPS)

등은

Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)

에서구 입하였다

.

가압추출과 최적

^∘

Brix의 결정

열수추출을위해냉동보관된미색류껍질

100 g

에탈이온수

500 mL

^를^넣고

121°C (15 psi)

^에서

3

^시간^{가열하였다}

.

^이^방 법으로한번더추출한다음여액을모아여과하고진공농축 기에서^∘

Brix 5-13

이되도록농축하였고

, 1.0 N HCl

로단백질 을침전시켜제거하고

, 1.0 N NaOH

로중화한다음

ethanol

을

3

배첨가하여글리코스아미노글리칸을침전시킨후동결건조

(FDU-540, Tokyo Rikakikai Co. LTD., Tokyo, Japan)

^하여^실 험에사용하였다

.

효소 및 산처리를 이용한 추출효율 평가

냉동고에보관된미색류껍질

100 g

에탈이온수

500 mL

를넣 고

121°C

에서

3

시간가열한후실온에서일정시간식힌다음각 종효소를

1%

^및

2% (dry basis, w/w)

^의^농도로^첨가하고

, 1/60 M sodium phosphate buffer 500 mL

를가한다음각효소의최 적활성조건에서가수분해하였다

.

즉

, Protamex 1.5MG (Ba- cillus protease, 60°C, pH 7.0), Flavourzyme 500MG (Asper- gillus oryzae, 50°C, pH 6.5), Papain (Carica papaya, 60°C, pH 5.7)

^및

Alcalase 2.4L (Bacillus licheniformis, 60°C, pH 7.0)

^를 사용하여가수분해를실시하였고

,

가수분해후효소를실활시 키기위하여

90°C

탕욕중에서

10

분간가열하였다

.

산처리구는

1.0 N HCl

로

pH

를

4.5

로조정한후

121°C

에서

3

시간처리하여 미색류껍질에함유된글리코스아미노글리칸을추출하여미색 류추출효율을검정하였다

.

가압 및 Protamex 처리에 의한 추출효율 평가

미색류 껍질

100 g

을 수세한 후 증자용추출기

(DN-1001, DongNam Industrial Co. LTD., Incheon, Korea)

에넣고

121°C

에서

3

시간가열하여시료에함유된글리코스아미노글리칸을 추출한다음

,

^여기에

1/60 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 500 mL

와

Protamex

를

1%

가되도록첨가하고

60°C

에서

3

시 간가수분해시켰다

.

효소활성을비교하기위하여시료의온도 를

60°C

로설정하고

24

시간추출한시료

(No steaming

구

)

와여 기에

Protamex 1%

를첨가하여

3

시간추출한시료로설정하였 다

.

^이^시료들은^{감압농축기를}^사용하여^∘

Brix 9

^가^되도록^농축 한후

90°C

에서

10

분간가열하여효소의활성을실활시킨다음

여과하고

ethanol

을

3

배첨가하여글리코스아미노글리칸을침

전시킨후동결건조하여실험에사용하였다

.

(3)

총당, 황산기, uronic acids 및 hexosamines 함량의 측정

총당함량은

5% phenol 1 mL

와

sulfuric acid 5 mL

를시료

1 mL

와반응시킨후분광광도계

(Spectramax M2, Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)

를 사용하여

470 nm

에서흡 광도를측정하였으며

, glucose

를이용하여작성한표준곡선으 로부터함량을계산하였다

(Saha and Brewer, 1994). Sulfated glycans

함량은

1,9-dimethylmemethylene blue (DMB)

용액을

1.185 g NaCl, 1.52 g glycine, 0.008 g DMB, 0.47 mL HCl

을

500 mL

증류수에녹여서제조하였다

.

제조용액은

525 nm

에서 약

0.34

의흡광도값을가진다

.

분석방법은각시료

0.05 mL

를

1 mL DMB

^용액과^혼합한^후

525 nm

^에서^흡광도를^측정하고

, chondroitin sulfate A

를이용하여작성한표준곡선으로부터함 량을계산하였다

(Farndale et al., 1986).

Uronic acid

함량은

25 mM sodium tetraborate

를진한황산 용액으로제조한후이용액

0.2 mL

와시료

0.05 mL

를

96-well plate

^에^넣고^잘^섞은^후

100°C

^에서

10

^분간^{가열하였다}

.

^그^다 음상온에서

15

분간냉각후

0.125% carbazole 0.05 mL

를가 하고다시

100°C

에서

10

분간가열하였으며

,

상온에서

15

분방 냉한후

ELISA reader (Asys UVM340, Biochrom, Eugendorf, Austria)

로

550 nm

에서 흡광도를 측정하였고

, galacturonic acid

^를^이용하여^작성한^{표준곡선으로부터}^함량을^{계산하였다}

(Cesaretti et al., 2003). Hexosamine

함량은

Blix (1948)

의방 법에준하여시료

100 μL

를

1 M hydrochloric acid

용액으로 가수분해하였고

, 2.5% sodium nitrite 0.4 mL

를넣은후

15

분 간반응한다음

12.5% ammonium sulfamate

를

0.2 mL

넣고

5

분반응시켰다

.

^여기에

0.2 mL 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride monohydrate (MBTH)

를넣고

37°C

에서

30

분반응한후

0.5% ferric chloride 0.2 mL

를넣고

5

분 간방치한다음

650 nm

에서흡광도를측정하였으며

, N-acetyl-

glucosamine

을이용하여작성한표준곡선으로부터함량을계

산하였다

.

피부세포 독성 평가

인간 피부 섬유아세포주

(CCD986sk)

를

Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM)

배지로배양하였다

.

각세포주는 배양플레이트에배양하여

1

주일에

2-3

회계대하였으며

,

배지

는

10% FBS

^배지를^함유한^{성장배지를}^{이용하였다}

.

^세포주는

95% humidity, 5% CO

₂와

35°C

로조절된항온기에서배양하 였으며

,

배지는

2

일에한번씩교환하였다

.

섬유아세포에대한독성여부를알아보기위하여세포를

96 well plate

에

1×10

⁴

cells/well

의농도로분주하고

, 24

시간동안 배양하였다

.

^시료는^최종^농도가

1, 10, 50

^및

100 μg/mL

^가^되 도록배지에녹여세포에처리한후

24

시간동안배양하였다

.

세 포의생존율은

CellTiter 96

^®

aqueous one solution cell prolif- eration assay

시약

(Promega Co., Madison, WI, USA)

을이용

하여

Microplate reader (Spectramax M2, Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA)

로

490 nm

에서흡광도를측정하고대조 군에대비한시료처리군의흡광도비를

%

로나타내었다

. Collagenase 활성 저해능의 측정

Collagenase

활성 저해능은

EnZChek Gelatinase/Collage- nase Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)

^시약을 구입하여 사용방법에 준하여측정하였다

.

먼저

1 mg DQ

^TM

gelatin vial

에

1.0 mL

의탈이온수를가해

DQ

^TM

gelatin stock solution (1 mg/mL)

을만들었다

.

그리고

10×reaction buffer (pH 7.5) 2 mL

에탈이온수

18 mL

를가해

reaction buffer

를희 석제조하였다

.

^다음으로

collagenase

^효소^시약을^{제조하였다}

. Working solution

으로최종농도가

0.2 U/mL

이되도록

reac- tion buffer

로희석하였다

.

실험에사용할글리코스아미노글리 칸을

reaction buffer

에시료를녹여시료의농도가

10, 25, 50

및

100 μg/mL

가되도록제조하였다

.

제조한시료를

96 well plate

에

90 μL

^씩

3

^회^{반복실험으로}^하였다

.

^빛을^차단한^실온에서

1

시간동안방치한후형광광도

495 nm/515 nm

에서형광광도

를측정하였다

. Collagenase

활성저해능은아래의식에따라 계산하였다

.

Collagenase inhibitory activity (%)=[1-(B-B

₀

)/(A-A

₀

)]×100

A,

^효소^첨가^증류수의^흡광도

A

₀

,

효소무첨가증류수의흡광도

B,

효소첨가시료의흡광도

B

₀

,

효소무첨가시료의흡광도

Procollagen type-1 생합성 활성의 측정

인간 피부유래 진피세포인 섬유아세포를 미국세포주은행

(ATCC, Rocksville, MD, USA)

에서구입하여실험에사용하 였다

. 48 well plate

에

5×10

⁴

cells/well

농도로분주한후

24

시 간동안

phosphate buffered saline (PBS)

로안정화하고배지에 시료를녹여세포에처리하였다

.

이렇게배양한다음배양상등 액을취해

procollagen type-1 C peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)

로

procollagen

함량을측정하여

colla- gen

의생성정도를비교하였다

(Park et al., 2014).

통계처리

모든실험은

3

회반복실험을거쳤고

,

결과의통계처리는

JMP

(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)

^를^{이용하였으며}

,

^각각의 시료에대해서는평균

±

표준편차로나타냈다

.

각시료에대한 유의차검정은

One-way ANOVA test

를실시하여분산분석한 후

, Duncan's multiple range test

에의해유의차검정

(P<0.05)

을실시하였다

.

(4)

결과 및 고찰

미색류에 함유된 기능성 성분의 특성

해양생물은그독특한생태환경으로인한특유의대사과정을 지니고있으며

,

^생태학적^{특이성으로}^인해^선천적인^면역^및^방 어시스템을가지고있다

.

이와같은특이적인생리활성을가 지기때문에그기능적특성에대한연구가활발히진행되어 왔다

(Lee et al., 2015).

미색류에함유된

sulfated glycans

및

uronic acids

함량을측정하여

Table 1

에나타내었다

.

우렁쉥이

(Halocynthia roretzi),

^미더덕

(Styela clava)

^및^오만둥이

(Styela plicata)

^껍질에^함유되어^있는

sulfated glycan

과

uronic acid

함 량을측정한결과각각

8.9

및

9.4 g/100 g, 10.2

및

10.8 g/100 g, 10.7

및

11.3 g/100 g

으로나타나시료에따른차이는크지않은 것으로나타났다

.

그러나

Lee and Hong (2014)

등에의하면같 은재료를사용하더라도추출방법을달리하면추출되는수율과 당의함량에서도차이가나는것으로보고하고있다

. Sulfated glycans

의함량은오만둥이열수추출물에서

17.71 g/100 g

으 로가장낮았고

,

우렁쉥이껍질효소추출물에서

39.72 g/100 g

으로가장많은함량이나타났었다고하였다

.

산성당인

uronic acid

^함량은^오만둥이^{열수추출에서}

3.12 g/100 g

^으로^가장^낮 았으나

,

오만둥이효소추출에서는

10.86 g/100 g

으로가장많 이함유되어있었다고하였다

(Lee and Hong, 2014).

따라서많 은연구가이루어진우렁쉥이와미더덕보다실험결과의발표 가적은오만둥이를시료로사용하였다

(Shin et al., 2014; Lee and Hong, 2015; Lee et al., 2015; Kim et al., 2016; Park and Yang, 2018).

∘

Brix에 따른 다당 및 아미노당 함량의 변화

글리코스아미노글리칸은세포의점막과점액으로유출되기 때문에점막다당류라고불리어지기도한다

.

글리코스아미노 글리칸이결합된각단량체의종류

,

^각^단량체의^연계

,

^황산염의

위치

,

^황산화^정도에^따라^서로^구별된다

.

^이러한^특징을^바탕으 로글리코스아미노글리칸은크게

4

가지종류인콘드로이틴황 산

/

더마탄황산

(chondroitin sulfate, CS/dermatan sulfate, DS),

헤파린

/

헤파란황산

(heparin, H/heparan sulfate, HS),

히알루론 산

(hyaluronic acid, HA),

케라탄황산

(keratan sulfate, KS)

으로 분류된다

(Lindahl et al., 2009).

^중심^단백질에^음으로^하전^된

carboxylic acid

에기인한나뭇가지형태의구조로공유결합되 어있으며

,

충격흡수

,

수분의유지및전해질로서생리학적으로 중요한역할을하고있다

. Sulfate-GAGs (chondroitin sulfate

등

)

가

80%

이상을차지하고있고

,

강력한항염증작용이있어 관절염및연골의치료에탁월한효과가있는것으로알려져있 어이들소재를확보하려는노력이다양하게이루어지고있다

(Lee et al., 2009).

오만둥이시료의^∘

Brix

에따른다당의함량과글리코스아미노 글리칸의추출량을측정하여

Table 2

에나타내었다

.

^∘

Brix

를

5

에서

7

^로^{증가시키면}^다당^함량은

10.94%

^에서

16.45%

^로^증가 되었으나

,

^∘

Brix 9

에서도

16.73%

로비슷하여농축할때^∘

Brix

를

7-9

사이로하면최대의추출효과를가져올것이다

.

^∘

Brix

를

11, 13

으로증가시키면추출되는당의함량은도리어감소함과

동시에포함된글리코스아미노글리칸의함량도

4.74%, 3.13%

로감소하는것으로나타났다

.

^이것은^{추출용액에}^함유된^글리 코스아미노글리칸의농도가일정하여상대적으로당의함량이 증가하지않았기때문이다

.

가압 및 Protamex 병행처리 후의 추출효율

오만둥이껍질로부터글리코스아미노글리칸을추출하기위

하여여러가지방법을응용하고그결과를

Table 3

^에^나타내었

다

.

오만둥이껍질에물을첨가한후가압용추출기

(121°C, 15 psi)

내에서

3

시간가열한후얻어진추출액의성상을조사한결

Table 1. Sulfated glycans and uronic acids contents in polysaccharides extracted from Halocynthia roretzi, Styela clava and Styela plicata tunic

Sources Sulfated glycans¹ (g/100 g)

Uronic acids¹ (g/100 g) Halocynthia roretzi 8.9±0.4^b,2 9.4±0.2^b

Styela clava 10.2±0.5^a 10.8±0.6^a

Styela plicata 10.7±0.6^a 11.3±0.4^a

1Sulfated glycans content was determined by Blix method (1948), using chondroitin sulfate A as a standard; Uronic acids content was determined by carbazole assay (Cesaretti et al., 2003), using galacturonic acid as a standard. ²Values are means±standard deviation of triplicates. The same letter superscript within each column are not significantly different according to Duncan's multiple range test (P<0.05).

Table 2. Optimum ^∘Brix setting for extraction of glycosaminoglycans (GAGs) from Styela plicata tunics

Samples Type¹ Crude polysaccharides

(%) GAGs yield

(%) Mean

5 ^∘Brix A 10.94 3.52 3.49

B 10.72 3.45

7 ^∘Brix A 16.45 5.29 5.26

B 16.43 5.23

9 ^∘Brix A 16.36 5.19 5.28

B 16.73 5.37

11 ^∘Brix A 14.64 4.68 4.74

B 14.81 4.80

13 ^∘Brix A 10.83 3.47 3.13

B 8.74 2.79

1A, 1st extracted crude polysaccharide from ascidian tunic; B, 2nd extracted crude polysaccharide from ascidian tunic.

(5)

과

pH 6.1-6.2,

염도

5-8 psi,

^∘

Brix 1.0-1.2,

수율은

4.22-5.91%

로효소를첨가하여추출하였을때수율이약

1.4

배높아지는것

으로나타났다

.

그러나가압없이

60°C

의온화한조건에서추출

하였을때는

pH 6.2,

염도

4-6 psi,

^∘

Brix 0.8-1.0,

수율은

1.19-

3.72%

^로^{추출효율이}^매우^낮아져^{추출온도를}^높이는^것이^글

리코사미노글리칸의추출에효과적인것으로나타났다

.

오만둥이

(Styela plicata)

^에^함유된^기능성^물질을^추출하기 위하여

methanol

을용매로사용하였을때

1.17 g

이추출되었 으며

, ethanol

과

acetone

을이용한경우에각각

1.04 g

이추출

되었고

,

^물을^이용한^경우에는

0.67 g

^으로^낮게^{추출되었다고}

하였다

(Kim et al., 2005).

그러나동결건조한후용매로추출 한경우

methanol

을이용한경우에는

1.64 g

이추출되어추출 효율이

47%

증가되었고

,

물을활용한경우

0.96 g

이추출되어 절대량및상대량도크게증가되어시료를가공하는방법에따 라추출효율도변화된다고하였다

(Kim et al., 2005).

^글리코스 아미노글리칸의효능에대한연구로는항혈관신생

,

항암작용

,

항염증작용에서글리코스아미노글리칸의발현이이들종양의 진행을억제하는중요한작용을한다는연구들이보고되었다

(Kim et al., 2005; Kwak, 2014).

또한

,

관절염쥐에게글리코스 아미노글리칸을처리했을때치료효과가있었으며

(Campo et al., 2003), sulfated glycan

은미생물발육을억제하여미생물의 인식

,

부착

,

침범등의과정을조절하는것으로밝혀졌다

(Wang et al., 2012).

그외에도글리코스아미노글리칸이지단백의일 종인

VLDL (very low density lipoprotein)

의

apolipoprotein

의산화변화와지질과산화에영향을미친다는보고도있었다

(Albertini et al., 2000).

각종 효소 및 산 분해에 의한 각 성분의 함량변화

가압후효소를처리하는방법이추출효율을높였음을

Table 3

의결과로알수있었으므로어떤효소가더효과적인가를파

악하기위하여

Table 4

^와^같이^여러^종류의^효소를^활용하여^오

만둥이껍질에존재하는글리코스아미노글리칸의추출량을조 사하였다

.

실험에사용한효소는

Alcalase, Flavourzyme, Pa- pain, Protamex

각각

1%

및

2%

였고

,

이들과비교하기위하여 산가수분해법을적용하여총당

, sulfated glycans, uronic acids,

hexosamines

^함량을^{측정하였다}

.

^총당^함량은^효소

1%

^보다

2%

를사용하였을때약간높았고

,

가장높은함량을나타낸실험구 는

Flavourzyme

및

Protamex 2%

첨가구였으며

,

산가수분해의 경우가장낮은값을보여

22.7%

이었다

.

그외

sulfated glycans, uronic acids, hexosamines

함량을비교하였을때

Protamex 1%

구가경제성이가장높을것으로추정되었다

.

해조류인불등풀가사리에주로함유되어있는다당은자연에 널리분포하고있으며

,

해양생물에의해생산되기도하고식물 과해조류로부터파생되기도한다

.

이러한다당은

sulfate

함량

,

분자량

,

당골격의

sulfate

위치

,

당성분및

glycosidic branching

에의존적으로항산화및항암등을나타내고있다고알려져있 다

(Wang et al., 2010).

해조류다당류중기능성다당인

fucoi- dan

은함황산성다당으로써조체내에서

uronic acid

와

acetyl

group

및단백질을포함하기도하며

,

각기다른복잡한구조의

fucoidan

으로존재하고있다

(Lee, 2011).

따라서황산기를함유 한

fucose, rhamnose, xylose, glucuronic acid

^등의^당분석을^통 해산성다당의존재및함량을예측할수있다

(Jee et al., 2006).

또한

uronic acid

는단당류분자의말단에있는제

1

급알콜기가 산화되어

carboxyl

기가된것으로

6

탄당에서유도되는

uronic acid

가중요하다

. Uronic acid

의경우초고압추출물이

5.04%

로높은함량을보였으며가압가열

,

^{열수추출물의}^순으로^나타 나압력공정을통해톳의세포벽성분다당체및이의결합을 붕괴하여추출이높아진것으로나타나고온과고압일수록추 출효율이좋아지는것으로평가하였다

(Lee and Hong, 2015).

추출물 농도에 따른 세포독성

오만둥이가압열수추출물의피부세포에대한주름개선효능 을확인하기위하여먼저인간피부섬유아세포인

CCD986sk

를통해독성시험을실시하였다

(Table 5).

먼저세포를

2×10

³

Table 3. Steaming and enzyme hydrolyzation conditions of glycosaminoglycans (GAGs) extraction from Styela plicata tunic

Sample treatments Components

pH Salinity (psu) ^∘Brix Yield (%)

Steaming (121°C) 6.1 8 1.0 4.22±0.03

Steaming (121°C)+Enzyme¹ 6.2 5 1.2 5.91±0.05

No steaming 6.2 6 0.8 1.19±0.01

No steaming+Enzyme 6.2 4 1.0 3.72±0.06

1Protamex 1% (pH 7.0; Temp. 60°C; 3 h). Values are means±standard deviation of triplicates.

Table 4. Composition of glycosaminoglycans (GAGs) from Styela plicata tunics by enzyme hydrolysis and acidic extraction

Enzyme

Components (%) Total

sugars Sulfated

glycans Uronic

acids Hexos- amines Alcalase 1% 33.5±0.1â 11.6±0.1â 11.3±0.2â 8.8±0.1â 2% 34.7±0.3â 11.9±0.1â 11.5±0.4â 9.3±0.1â Flavourzyme 1% 34.2±0.4â 11.0±0.1â 11.1±0.2â 9.1±0.1â 2% 35.2±0.5â 10.8±0.2â 11.8±0.1â 9.5±0.1â Papain 1% 33.4±0.3â 10.5±0.3â 12.1±0.2â 8.3±0.2â 2% 34.9±0.4â 10.9±0.3â 12.5±0.2â 8.8±0.1â Protamex 1% 34.1±0.3â 12.3±0.2â 12.2±0.1â 9.3±0.3â 2% 35.6±0.2â 12.8±0.3â 12.6±0.3â 9.6±0.2â Acidic extraction 22.7±1.6^b 9.4±0.8^b 9.6±0.6^b 7.3±0.4^b Values are means±standard deviation of triplicates. The same letter superscript within each column are not significantly different according to Duncan's multiple range test (P<0.05).

(6)

cells/well

^농도로

96 well plate

^에^분주하고

, 24

^시간^동안^안정 화한후오만둥이열수추출물은최종농도가각각

1, 10, 50

및

100 μg/mL

의농도가되도록배지에혼합하여배양하였다

.

세

포의생존율은무처리군에대비한시료처리군의흡광도의비 를

%

로표시한결과

,

모든농도에서독성이나타나지않았다

. Collagenase 활성저해

Collagen

의주된기능으로는피부의기계적견고성

,

결합조직 의저항력과조직의결합력

,

세포접착의지탱

,

세포분할과분 화의유도등이알려져있다

(Perlish et al., 1988).

피부의진피 는주로

collagen

으로이루어져있으며

,

자외선이나노화현상 에의해

collagen

^을^분해하는^효소인

collagenase

^에^의해^피부 의주름이형성되고

,

피부의탄력이떨어진다고한다

(Wlaschek et al., 2001).

오만둥이글리코스아미노글리칸의농도를

10, 25, 50, 100 μg/mL

의농도로하여

collagenase

저해활성을측정하 여

Table 6

에나타내었다

.

그결과레티닐아세테이트는

10 μg/

mL

^의^농도에서^약

42.0%

^의^{저해활성을}^{보여주었고}

,

^오만둥이

글리코스아미노글리칸추출물도

10 μg/mL

에서

44.9%,

고농 도인

100 μg/mL

에서는

75.2%

의높은활성저해능을보여주 었다

.

불가사리 유래의저분자

collagen

펩타이드

(24-116 kDa)

의

collagenase-1

^저해활성^값이

40-60%

^이었으며

,

^홍어^껍질에서

유래된

pepsin

가수분해물의저해활성값과유사하였다

(Kwon

et al., 2007).

단백질가수분해물및저분자펩타이드는체내의 흡수율이높으며

,

추출물에비해독성이낮으므로단백질가수 분해물및저분자의펩타이드가

collagenase-1

저해물질로활 용가능성이높다고하였다

(Park et al., 2011). Collagen

^은^피부 전체건조중량의약

70-80%

를차지하며

,

피부진피교원질중 주단백질이다

.

이러한진피층의

collagen

은활성산소등으로 인한광노화에의해감소하여주름과탄력저하의원인이된다

(El-Domyati et al., 2002).

잔가시모자반추출물의

collagenase

저해활성을측정한결과에탄올추출물이물추출물보다높아 에탄올추출물

1 mg/mL

농도에서

80%

이상으로높은효소저 해능을보였다

(Pak et al., 2016).

또한

Kim et al. (2010)

은헛개

나무열매열수추출물및뿌리에탄올추출물의경우

0.25 mg/

mL

에서

68.1%

및

68.3%

의

collagenase

저해활성을가진다고 보고하였다

.

Procollagen type-1 생합성 활성

글리코스아미노글리칸의다양한노화방지효과는화장품및 의약품의소재로광범위하게활용되도록하는데기여했다

(Lee et al., 2016).

히알루론산

,

콘드로이틴황산

,

더마탄황산

,

케라탄 황산등글리코스아미노글리칸은세포외구조를구성하는성 분이며진피와표피세포의성장

,

이동

,

분화

,

접착

,

지질합성을 포함한많은생물학적과정을조절한다

(Anderegg et al., 2014).

베르시칸

,

데코린

,

비글리칸을갖는프로테오글리칸을포함한 글리코스아미노글리칸도

collagen

과

elastin

의합성및유지에 중요한역할을한다

(Carrino et al., 2000). Collagen

^이^부착된 글리코스아미노글리칸의제거는카텝신

K

를통한

collagen

분 해에영향을미친다는것이입증되었다

(Panwar et al., 2017).

Table 5. Cell proliferation activity of glycosaminoglycans (GAGs) extracts from Styela plicata tunics

Samples (μg/mL) Cell proliferation (%)

Control 100.0±4.6

Glycosaminoglycans

1 109.8±6.7^b

10 106.5±6.7^b

50 112.3±5.5^a

100 115.1±3.7^a

Values are means±standard deviation of triplicates. The same letter superscript within each column are not significantly different according to Duncan's multiple range test (P<0.05).

Table 7. Procollagen synthesis activity of glycosaminoglycans (GAGs) extracts from Styela plicata tunics on fibroblast cell (CCD986sk)

Samples (μg/mL) Procollagen synthesis activity (%)

Control 100.0±5.7

Glycosaminoglycans

10 60.4±1.5^c

25 63.2±2.6^c

50 75.3±4.1^b

100 80.1±3.9^a

Table 6. Collagenase inhibition activity of glycosaminoglycans (GAGs) extracts from Styela plicata tunics on fibroblast cell (CCD986sk)

Samples (μg/mL) Collagenase inhibition activity (%)

Control 100.0±5.7

Retinyl acetate

1 29.6±3.2^d

10 42.0±1.4^c

Glycosaminoglycans

10 44.9±2.6^c

25 59.9±1.9^b

50 71.1±0.4^a

100 75.2±5.9^a