The Inhibitory Effects of Chrthami Semen Oil Pharmacopuncture (CSOP) on Synovial Membranes in
Type Ⅱ Collagen-Induced Arthritis Mice
Back Seong-wook, Kim Eun-jung, Hwang Ji-hoo, Yoon Jong-hwa, Lee Seung-deok and Kim Kap-sung
Department of Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Dongguk University
Objectives : The purpose of this study is to observe the inhibitory effects of Chrthami semen oil pharmacopuncture(CSOP) on CIA (collagen-induced arthritis) mice.
Materials and Methods : Two types of experiments were conducted: in vitro assay, inhibition of MIF mRNA and TNF-α mRNA expressions in synovial membranes was observed, and in vivo assay, 1 ㎕/㎏
CSOP was injected every day to the left Weizhong (BL40) from day 3 to 21 after induction of CIA, and changes in paw edema, apical surface morphology, neovascularization in synovial membranes, fibrosis, pro-inflammatory cytokines production, Th-1 differentiation, and anti-inflammatory effect were investigated.
Results : 1. In synoviocytes of the CIA mice treated with CSOP, MIF mRNA and TNF-α mRNA expressions were down-regulated in a dose-dependent manner.
2. Paw edema of the CIA mice treated with CSOP was diminished.
3. Tissue injury in the synovial membranes, capillary distribution and fibrosis were reduced in CSOP-treated mice.
4. MIF, TNF-α, IL-6, MMP-9 expressions were repressed in CSOP-treated mice during the experiment to observe the inhibitory effect on cytokines production in early stage RA.
5. IL-12 and CD28 were reduced in CSOP-treated mice during the observation of inhibitory effect on Th
1)
홍화자유약침이 CIA 모델 생쥐의 윤활관절막 손상 억제에 미치는 영향
백성욱ㆍ김은정ㆍ황지후ㆍ윤종화ㆍ이승덕ㆍ김갑성
동국대학교 한의과대학 침구학교실
․접수 : 2012. 2. 6. ․수정 : 2012. 2. 13. ․채택 : 2012. 2. 13.
․교신저자 : 김갑성, 경기도 고양시 일산동구 식사동 814 동국대학교 부속한방병원 침구과 Tel. 031-961-9121 E-mail : [email protected]
원 저
Abstract
1 differentiation.
6. PPAR-γ was increased during the experiment to observe the anti-inflammatory effect of CSOP.
Conclusions : The results may suggest that administration treatment using Chrthami semen oil pharmacopuncture decreases the inflammatory response on an Animal Model with CIA.
Key words : Chrthami semen oil, pharmacopuncture, type Ⅱ collagen-Induced arthritis, synovial membrane
Ⅰ. 서 론
류머티스성 관절염은 원인불명의 만성 전신성 다 발성 장기 질환1)으로, 침범된 관절에 활막세포 비후 와 혈관 신생을 특징으로 하는 만성 염증을 일으키며, 궁극적으로는 연골과 뼈의 파괴를 야기하는 자가면역 성 질환의 일종으로 주요 증상들은 한의학적으로 痺 證2), 歷節風3), 白虎歷節風4), 및 痛風5) 등의 범주에 속 한다고 볼 수 있다.
류머티스성 관절염을 대상으로 한 실험적 보고로 는 藿香·牛黃·熊膽 복합제재6), 桂枝7), 鹿茸8), 獨活9), 防己10) 등을 제재로 한 약침요법이 치료 또는 면역학 적 실험에서 효과가 있는 것으로 보고된 바가 있다.
특히 본 실험에서 약침제재로 사용된 紅花子(Chrthami semen)는 국화과 일년생 초목인 잇꽃의 종자로 活血 解毒하는 효과가 있으며11) 최근에는 紅花子 약침요법 으로 골다공증12), 痛風13), 급성 腎不全14), 癌 전이 억 제와 면역 활성화15)에 대한 연구가 보고되고 있다. 또 한 紅花子의 류머티스성 관절염에 대한 치료 효과를 LPS 유발 관절염에 관한 연구16)로 진행되었으나, 사 람의 류머티스성 관절염과 유사한 type Ⅱ collagen유 발 관절염(collagen induced arthritis; CIA)17) 모델을 대상으로 한 동물실험 연구는 확인하기 어려웠다.
이에 저자는 紅花子油약침 처치가 CIA 모델 생쥐 의 관절염에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, in vitro 실험에서 CIA 모델 생쥐의 윤활관절세포 내의 CIA 유발 관련 cytokines인 MIF 및 TNF-α의 mRNA의 발현 억제 효과와, in vivo 실험에서 CIA 모델 생쥐의 윤활관절막 손상 완화 여부를 관찰하기 위하여 인체 의 委中(BL40)18)에 상응하는 부위에 紅花子油약침액 (Chrthami semen oil pharmacopuncture, CSOP)을 시술한 후, 발의 두께 변화, 일반적인 형태 변화, 윤활
관절막 내의 혈관 신생성, 섬유화, 초기 유발 관련 cytokines 생성억제, Th 1 분화억제 및 염증억제 효 과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바 이다.
Ⅱ. 실 험
1. 재료
1) 동물
오리엔트(한국)에서 분양받은 태령 4주된 DBA 암 컷 생쥐를 무균사육장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다.
2) 약침액
대한약침학회의 GMP 기준시설하에서 씨앗의 세 정, 분쇄, 껍질 제거, 스크류 프레싱(screw pressing) 과정 후 3단계 여과장치 (0.45 ㎛, 0.2 ㎛)를 거쳐 윤 제를 여과하였고, 최종 윤제를 질소충전 및 포장하는 과정을 통해 紅花子油 약침액을 제조하였으며, 시술 시에는 1 cc 일회용 주사기(Safe1ne/경기의료공업, 한 국)에 30 gauge 1/2" 일회용 주사침[정림의료기산업 (주), 한국]을 사용하였다.
2. 방법
1) 윤활관절 세포주와 세포배양
윤활관절세포는 관절염 유발 후 암컷 DBA 생쥐 무릎관절에서 적출하였다. 우선 관절주변 근육을 제거 하고 윤활관절주머니를 개방한 후 0.1 % collagenase가 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM;
Primer Primer sequences Product(bp) Nos. of cycles
MIF Sense 5'-CACCATGCCTATGTT CATCGTGAACA-3'
404 35
Antisense 5'-GGGCTCAAGGCGAAG GTGGAACCGTT-3' TNF-α Sense 5'-TTGACCTCAGCGCTG AGTTG 3'
364 30
Antisense 5'-CCTGTAGCCCACGTA GTAGC 3'
β-actin Sense 5'-GGAGAAGATCTGGCA CCACACC-3'
840 35
Antisense 5'-CCTGCTTGCTGATCC ACATCTGCTGG-3' PMA : phorbol-12-myristate-13-acetate. MIF : macrophage migration inhibitory factor.
TNF-α : tumor necrosis factor-α. bp : base pairs.
Table 1. The Primer of MIF, TNF-α and β-actin mRNA 웹진, 한국)에 2시간 반응시켜 윤활관절막을 분리하고 세절하였다. 0.1 % collagenase에 37℃에서 1시간 처 리 한 다음 3,000 rpm에 5분간 원심분리하고 37℃, 5 % CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum(FBS;
Sigma, USA)이 함유된 DMEM을 사용하여 배양하였 다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin 과 100 ㎍/㎖ streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨 가하였다. 세포는 flask 내에서 80% 정도 자랐을 때 PBS로 씻어주고, Trypsin-EDTA(Gibco/BRL, USA) 를 처리하여 계대배양하였다. 배지는 2일마다 교환하 여 주었다. 실험에는 3～5회 계대배양 세포를 사용하 였다.
2) 윤활관절세포 내 초기 CIA 유발 관련 cytokines 유전자 발현 변화조사 초기 류머티스성 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor (MIF) mRNA 와 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor (TNF)-α의 mRNA 발현 양상을 조사하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 실시하였다. 윤활관절세 포 -5×105 cells/well을 6 well에 plating하고 12시간 후에 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; Sigma, USA) 1 ng/㎖를 1시간 처리하여 CIA 유발 관련 cytokines mRNA 활성을 유도하였다. 紅花子油 약침 액을 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma, USA)로 용 해시킨 다음 배양액에 10-4, 10-3, 10-2, 10-1의 농도별 로 희석해서 24시간 배양한 후, 수거하여 trizol reagent (Sigma, USA)로 추출하고 fluorometer (Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF, TNF-α primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 1).
PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기 영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확 성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin 의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.2(Optima Co., USA)를 이용한 영상분석(image analysis)을 통해 비교하였다.
3) CIA 모델 생쥐에서 MIF 활성 억제를 통한 완화효과조사
(1) 항원제조와 collagen 유도 관절염의 유발 관절염 유발을 위해 우선 native bovine type II collagen (CII; Chondrex, USA)을 10 mM acetic acid 에 4 ㎎/㎖의 농도로 녹인 후 4℃에서 12시간 교반하 였다. CII와 4 ㎎/㎖의 complete Freund’s adjuvant containing mycobacterium tuberculosis strain H37RA (CFA, Chondrex, USA)를 동량으로 섞은 후 균질기 를 이용하여 1,000 rpm의 속도로 혼합하였다. CIA의 유발을 위해 CII와 CFA 혼합액 50 ㎕를 꼬리연결 근 육부위에 피내주사를 통해 1차 접종을 하고, 2주 후에 CII와 CFA 혼합액 25 ㎕를 왼쪽 발바닥에 추가 접종 하여 CIA를 유발하였다. CIA 유발 후 1주일 간격으 로 발의 두께 변화를 dial thickness cage(Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
(2) 실험군 분류 및 紅花子油약침의 시술 무처치한 정상군, 관절염을 유발시킨 대조군 및 관 절염 유발 후 CSOP 시술을 한 실험군으로 나누었으 며, 각 군에 10마리씩 배정하였다.
CIA 유발 제3일부터 제21일까지, 매일 골도분촌법 에 의거하여 인체의 委中(BL40) 에 상응하는 생쥐의 왼쪽 膝窩部 부위에 30 gauge 주사기로 CSOP를 50
㎕/㎏의 비율로 1 ㎕/20g 약침 시술하였다.
(3) 윤활관절 표본제작
CIA 유발 제 21일 후, 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10 % neutral buffered formalin(NBF)용액으로 심장관류고정을 실시 하였다. 적출된 무릎관절을 decalcification solution (BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속 절편을 만들었 다. 만들어진 연속 절편은 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
(4) 윤활관절 조직화학과 면역조직화학
① 윤활관절막 내 혈관 신생성
혈관의 분포 변화를 조사하기 위해 phloxine-tartrazine 염색법을 실시하였다. Mayer’s hematoxylin에 5분간 핵 염색한 다음 phloxine 용액 30분간 반응시킨 후, tartrazine 용액에서 분별하여 광학현미경으로 관찰하였다.
② 윤활관절막 내 섬유화 관찰
윤활관절막 내 collagen섬유의 분포 변화 관찰은 Van Gieson’s picric acid-fuchsin 염색을 통해 이루어졌다.
우선 무릎관절 표본은 Weigert’s iron hematoxylin에 서 20분간 핵 염색한 다음 Van Gieson’s 염색용액에 서 5분간 collagen섬유에 대한 염색을 실시하였다.
③ 윤활관절막내 초기 CIA 유발 관련 cytokines의 변화 관찰
초기 CIA 유도 cytokine인 MIF, pro-inflammatory cytokines인 TNF)-α, IL-6R-α 및 단백분해효소인 MMP-9의 윤활관절막 내 분포변화를 조사하기 위해 면 역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 block- ing serum인 10% normal goat serum (1 : 20, DAKO, Denmark)에서 12시간 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse TNF-α (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse IL-6 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA) 및 mouse anti mouse MMP-9 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃
humidified chamber에서 24시간 link 하였다. Avidin biotin complex (Vector Lab, USA)에 1시간 실온에서 반응시킨 다음 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB;
Sigma, USA)과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl
완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
④ 윤활관절막 내 Th 1 세포분화 변화관찰 CIA 유발 후 윤활관절막 내의 T 세포 분화 변화를 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 CD28 분 자와 interleukin (IL)-12의 생성 변화를 mouse anti mouse CD28 (1 : 2500, Santa Cruz Biotec, USA)항체 와 mouse anti mouse IL-12 (1 : 2500, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적으로 관찰 하였다.
⑤ 윤활관절막 내 염증반응 조절 변화관찰 염증을 조절하는 전사인자 peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)-γ의 분포 변화를 조사하 기 위해 mouse anti mouse PPAR-γ (1 : 2,500, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적 염 색을 실시하였다.
4) 영상분석과 통계처리
mRNA 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2 (Optima Co., USA)를 이 용한 영상분석을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (Spss Inc. USA)을 통해 유의성을 검증하였다.
본 실험의 결과는 ANOVA test (SPSS14KO, SPSS. USA) 를 통해 검증하였으며 신뢰도 95% 이상(p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 윤활관절세포의 초기 CIA 유발 관련 cytokines 유전자 발현억제
1) MIF mRNA 발현억제
PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였는데, 실험군은 CSOP 처리 후 농도 의존적으로 발현이 감소되었다. 즉 PMA 자극 시 발 현되는 MIF mRNA 발현량에 비하여 10-4에서 13.9%, 10-3에서 20.3%, 10-2에서 20.6% 및 10-1에서 52.6%가 각각 감소하였다(Fig. 1).
Fig. 1. Inhibitory effects of CSOP on cytokines production in vitro
A : inhibition of MIF and TNF-α mRNA expression. The synovial cells were treated with PMA for 1 hour prior to the addition of indicated concentrations (10-4 - 10-1) of CSOP, and the cells were further incubated for 24 hours. The PMA-induced MIF and TNF-α mRNA expression were dose-dependantly decreased in CSOP treated synoviocytes.
B : relative intensity for MIF(■) and TNF-α(■) mRNA expression.
PMA : phorbol-12-myristate-13-acetate.
CSOP : Chrthami semen oil pharmacopuncture.
MIF : macrophage migration inhibitory factor.
TNF-α : tumor necrosis factor-α.
2) TNF-α mRNA 발현억제
PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 TNF-α mRNA 발현은 증가하였는데, 실험군은 CSOP 처리 후 농도의존적으로 발현이 감소되었다. 즉 PMA 자극 시 발현되는 TNF-α mRNA 발현량에 비하여 10-4에 서 4%, 10-3에서 15.2%, 10-2에서 17.8% 및 10-1에서 18.5%가 각각 감소하였다(Fig. 1).
2. 윤활관절막 손상완화효과
1) 발의 두께 변화
정상군에 비하여 관절염 유발 대조군에서는 부종 에 의한 발의 두께가 크게 증가하였는데, 특히 CIA 유발 7일 경과 후 정상군 1.85±0.06 mm에 비하여 대 조군이 4.32±0.05 mm로 원래 두께에서 비하여 가장 큰 증가를 보였다. 이후 시간이 경과할수록 발의 두께 는 감소하는 경향을 보였다. CSOP를 시술한 실험군
Experimental Days
Group
NOR CON EXP
1st day 1.84±0.03 1.83±0.06 1.84±0.06 7th day 1.85±0.06 4.32±0.05 3.15±0.06* 14th day 1.84±0.06 3.57±0.05 2.55±0.08* 21th day 1.83±0.03 3.18±0.11 2.13±0.07* M ± SD : mean ± standard deviation.
* : p < 0.05 compared with control (CON) group.
NOR : no-treated mice. CON : CIA induced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA induction.
Table 2. Inhibitory Effects of CSOP on Paw Edema in CIA Mice (mm)
에서도 발의 두께가 증가하였지만 제7일, 제14일 및 제21일군에서 3.15±0.06 mm, 2.55±0.08 mm 및 2.13±0.07 mm로 각각 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다(Table 2, Fig. 2A).
2) 일반적인 형태변화
CIA 유발 후 윤활관절막의 자유면(apical surface) 에서 윤활세포 과형성으로 인한 윤활관절막 자유면의 두께, 윤활강 쪽으로 많은 세포질돌기(filopodia) 및 자유면쪽으로 침윤하는 림프구의 증가가 관찰되었다.
그러나 실험군에서 대조군에 비하여 윤활관절막의 자 유면 두께와 침윤 림프구의 감소 등이 관찰되었다. 또한 윤활강 쪽에서 많은 세포질 돌기를 내는 윤활세포들 의 출현도 감소하여 정상상태에서 나타나는 윤활관절 막과 같은 매끄러운 표면 상태로 관찰되었다(Fig. 2B).
3) 윤활관절막 내 혈관 신생성 감소 CIA 유발 후 윤활관절막의 자유면 아래에서 직경 이 큰 모세혈관의 분포 증가가 관찰되었다. 그러나 실 험군에서 대조군에 비하여 모세혈관의 분포 감소가 관찰되었다(Fig. 2C).
4) 윤활관절막 내 섬유화 감소
CIA 유발 후 섬유화와 섬유화를 주도하는 섬유모 세포 침적 증가가 관찰되었다. 이런 섬유화는 일부 지 방층을 제외한 윤활관절막의 모든 지역에서 일어났으 며, 세포 가장자리가 잘 발달된 섬유모세포 침적 증가 가 확인되었다. 그러나 실험군에서 대조군에 비하여 낮은 섬유화가 관찰되었다. Collagen섬유는 윤활관절 막 자유면 기저부에서만 분포하였으며, 지방층 사이 의 모세혈관 주변부에서 마치 지방세포를 얇게 둘러
Fig. 2. Inhibition of CIA in paw and knee joint of CSOP treated mice
A : paw edema(x4 photo).
B : damaged synovial membranes in CIA (arrow, filopodia of synoviocyte; vacant arrow, capillary; H&E; R, x40; L, × 400).
C : capillary (arrow) distribution (Phloxine-tartrazine, x1000).
D : fibrosis (arrow, collagen fiber.
Van Gieson's picric acid-fuchsin, × 400).
CON : CIA induced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA induction.
싸고 있는 형상으로 관찰되었다. 또한 섬유화 주변에 침적하는 섬유모세포의 수도 적었다(Fig. 2D).
5) 윤활관절막 내 초기 CIA 유발 관련 cytokines 생성억제
(1) MIF 생성억제
MIF의 양성반응세포의 분포는 정상군 264±06 particles 에 비하여 대조군 3704±21 particles로 증가하였으며, 실험군은 2216±42 particles로서 대조군에 비하여 유 의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다. 이런 MIF 양 성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. MIF 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1,303% 증 가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 40% 감소하였다 (Table 3, Fig. 3A).
(2) TNF-α 생성억제
TNF-α의 양성반응세포의 분포는 정상군 310±06 particles에 비하여 대조군이 1619±35 particles로 증 가하였으며, 실험군은 909±13 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다. 이 런 TNF-α 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위 에 분포하였고, 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응 을 보였다. TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군 은 정상군에 비하여 442% 증가하였고, 실험군은 대조 군에 비하여 44% 감소하였다(Table 3, Fig. 3B).
Objective Group
NOR CON EXP
MIF 264±06 3,704±21 2,216±42*
TNF-α 310±06 1,619±35 909±13*
IL-6 205±07 3,175±28 1,510±25*
MMP-9 436±06 4,684±41 2,230±40* (image analysis for 200,000 particles / range of intensity :
80-130) M ± S.D : mean ± standard deviation.
* : p < 0.05 compared with control (CON) group.
AMIF : macrophage migration inhibitory factor.
TNF-α : tumor necrosis factor-α. IL-6 : interleukin-6.
MMP-9 : matrix metalloproteinase-9.
NOR : no-treated mice. CON : CIA induced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA induction
Table 3. Analysis for Inhibition of Pro-inflammatory Cytokines Production in CSOP treated Mice
(3) IL-6 생성억제
IL-6의 양성반응세포의 분포는 정상군 205±07 par- ticles에 비하여 대조군이 3175±28 particles로 증가하 였으며, 실험군군은 1510±25 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다. 이 런 IL-6 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. IL-6의 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1449% 증가하였고, 실험군은 대조군 에 비하여 52 % 감소하였다(Table 3, Fig. 3C).
Fig. 3. Inhibition of pro-inflammatory cytokines production in CSOP treated mice
A : MIF (arrow) production (MIF immunohistochemistry, × 1,000).
B : TNF-α (arrow) production (TNF-α immunohistochem- istry, × 1,000).
C : L-6 (arrow) production (IL-6 immunohistochemistry, × 1,000).
D : MMP-9 (arrow) production (MMP-9 immunohistochem- istry, × 1,000).
MIF : macrophage migration inhibitory factor.
TNF-α : tumor necrosis factor-α. IL-6 : interleukin-6.
MMP-9 : matrix metalloproteinase-9.
ON : CIA induced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA induction.
(4) MMP-9 생성억제
MMP-9의 양성반응세포의 분포는 정상군 436±06 particles에 비하여 대조군이 4684±41 particles로 증 가하였으며, 실험군은 2230±40 particles로서 대조군 에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
이런 MMP-9 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부 위에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였 다. MMP-9 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정 상군에 비하여 974% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 52% 감소하였다(Table 3, Fig. 3D).
6) 윤활관절막 내 Th 1 분화억제 (1) IL-12 생성억제
IL-12의 양성반응세포의 분포는 정상군 493±11 particles에 비하여 대조군이 5156±65 particles로 증 가하였으며, 실험군은 3457±55 particles로서 대조군 에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
이런 IL-12 양성반응세포는 윤활 관절막 자유면 부위 에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
IL-12 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 946% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 33% 감소하였다(Table 4, Fig. 4A).
(2) CD28 생성억제
CD28의 양성반응세포의 분포는 정상군 548±08 particles에 비하여 대조군이 4599±63 particles로 증 가하였으며, 실험군은 2286±40으로서 대조군에 비하 여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다. 이런 CD28 양성반응세포는 윤활관절막 전부위에 분포하였 고, 핵 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. C
Objective Group
NOR CON EXP
IL-12 493±11 5,156±65 3,457±55*
CD28 548±08 4,599±63 2,286±40*
PPAR-γ 354±06 1,377±38 3,134±57* (image analysis for 200,000 particles / range of
intensity : 80-130) M ± SD : mean ± standard deviation.
* : p < 0.05 compared with control(CON) group.
IL-12 : interleukin-12.
PPAR-γ : peroxisome proliferator activated receptor-γ.
NOR : no-treated mice. CON : CIA induced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA inductionparticles.
Table 4. Analysis on Inhibitory Effects on Cyto- kines Production in CSOP treated Mice
A B C
Fig. 4. Inhibition of Th 1 cell differentiation &
inflammation in CSOP treated mice
A : IL-12 (arrow) production (IL-6 immunohistochemistry,
× 1,000).
B : CD28 (arrow) production (CD28 immunohistochemistry,
× 1,000).
C : PPAR-γ (arrow) production (PPAR-γ immunohistochem- istry, × 1,000).
IL-12 : interleukin-12.
PPAR-γ : peroxisome proliferator activated receptor-γ.
CON : CIA reduced mice.
EXP : CSOP treated mice after CIA reduction.
D28 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 739% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 508% 감소하였다(Table 4, Fig. 4B).
7) 윤활관절막 내 염증억제
PPAR-γ의 양성반응세포의 분포는 정상군 354±06 particles에 비하여 대조군이 1377±38 particles로 증 가하였으며, 실험군은 3134±57 particles로서 대조군 에 비하여 유의성(p < 0.05)있는 증가를 나타내었다.
PPAR-γ 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. PPAR-γ 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 289% 증가하였고, 실험군은 대조군 에 비하여 128% 증가하였다(Table 4, Fig. 4C).
Ⅳ. 고 찰
류머티스성 관절염은 주로 관절 윤활강에 지속적 인 염증이 야기되어, pannus에 의한 뼈의 파괴, 윤활 관절막염에 의한 각종 cytokine의 영향, 다양한 단백 분해효소, O2 radical과 2차적인 관절연골의 퇴행성 변화에 의해 연골의 소실이 일어나는 전신성 염증성 관절질환19)으로 만성 염증과 점차 진행하는 관절의
파괴가 특징적으로 발생하며20), 활막세포의 비정상적 증식 및 골 파괴인자의 활성화로 인해 관절 파괴가 지속적으로 나타나게 되므로 적절한 초기 치료가 필 요한 질환이다21).
치료는 aspirin, 비스테로이드성 소염제, 단순 소염 제, 부신피질호르몬, 질환 변형 약제(disease modifying antirheumatic drug; DMARD), 항TNF-α제제, 면역 억제제, 세포독성 억제제 등이 광범위하게 사용22)되 고 있으나, 골수기능저하(myelosuppression), 고혈압 (hypertension), 간과 신장의 기능장애(hepatic and renal dysfunction) 등의 심각한 부작용으로 인하여 사용에 제약이 따르는 경우가 많아, 보다 효과적이며 안정성이 입증된 치료제의 개발을 위한 연구가 필요 한 실정이다. 따라서 부작용이 적은 치료한약재의 연 구가 절실히 요구된다.
한의학에서는 류마티스 관절염은 ≪黃帝內經․靈 樞≫23)에서 서술한 痺症 중 여러 관절들이 손상되고 상하 좌우로 이동하며 교체 발작하는 임상 증상과 성 질에 근거하여 周痺 및 衆痺에 속하고, 病程이 길고 관절 腫痛이 오래도록 낫지 않는다는 점에서 頑痺에 속하며, 全身 大關節이 腫痛하고 晝輕夜重하며 그 통 증이 극심하다는 점에서 歷節風, 白虎歷節風, 痛風 등 과 유사하다. 종합해보면 痺證2), 歷節風3), 白虎歷節風
4), 및 痛風5) 등의 범주에 속한다고 볼 수 있다. 歷節 風의 치료는 風寒濕의 원인을 제거하고, 淸熱시키며 鬱滯된 氣血을 소통시키는 것이 중요 관건이라 할 수 있다18).
紅花子는 국화과에 속하는 1년생 초본인 잇꽃의 종자로 性은 溫하고 味는 甘하며, 心脾 二經에 歸經하 며, 活血解毒의 효능이 있어 血氣刺痛, 瘡疽不出, 女子 中風 등을 치료한다11). 최근에 紅花子 약침요법으로 황 등12)은 骨多孔症을, 김 등13)은 痛風을, 조14)는 급성 腎不全을, 박15)은 암전이 억제와 면역 활성화에 대한 연구를 보고하였다. 또한 임 등16)은 紅花子의 류머티 스성 관절염에 대한 치료 효과를 LPS 유발 관절염에 관한 연구를 발표하였으나, 본 실험에 사용된 CIA 모델 을 대상으로 한 동물실험 연구는 확인하기 어려웠다.
류머티스성 관절염 유발 시 윤활관절막의 두께 비 후는 자유면에 위치한 윤활분비세포 또는 섬유모세포 유사윤활세포(fibroblast like synoviocyte; FLS)의 세 포 과형성으로 기인된 것으로 MIF 활성에 의한 세포 분열의 촉진과 세포 자기살해 억제의 결과이다. MIF 는 in vitro 와 in vivo 실험을 통해 류머티스성 관절 염을 비롯한 염증성 질환 진행에 강력한 역할을 하며
수동면역과 획득면역에 기본적 참여자로 알려져 있다24). MIF는 최초의 T 세포 유래 cytokine으로 정상적 으로 혈액 내에 일정한 농도로 존재하며, 시상하부 전 엽과 다양한 외부 자극에 의한 반응으로 활성화된 단 핵구 또는 대식구에 의하여 분비된다. MIF는 대식구 의 무작위적인 이동을 억제하며, 대식구 및 림프구의 면 역 기능을 조절하는 중요한 역할을 하고, glucocorticoid 의 면역 억제 및 항염증 작용에 대해 역조절 기능도 갖는다. 면역 및 염증 질환, 예를 들어 류머티스성 관 절염, 패혈증, 지연형 과민반응, 염증성 폐 질환, 악성 종양, 그리고 동맥경화에 이르기까지 다양한 질환에 서 다양한 기능을 수행하는 cytokine으로 알려져 있 다25). 환자에서 MIF의 농도가 혈청, 활액, 활막의 섬 유세포에서 정상과 비교하여 증가되어 있으며, 질병 의 활성도를 나타내는 C 반응 단백 수치와 양(+)의 상관관계를 보이고, 치료 전과 후를 비교하였을 때 MIF가 감소하는 등 MIF가 류머티스성 관절염의 임 상적 발현 및 활성화에 중요한 역할을 한다26).
류머티스성 관절염 윤활막과 혈청에서의 MIF 발 현은 FLS와 macrophage에 의한 TNF-α의 분비 증가 를 일으키게 된다. TNF-α, chemokine 및 growth factor를 포함하여 많은 전염증성 cytokines은 자가면 역 질환의 목표 장기에서 만성적인 염증반응을 일으 킨다. Feldmann 등27)은 항TNF-α 항체가 류머티스성 관절염을 앓고 있는 환자의 관절에서 IL-1 과 다른 전염증성 cytokines의 자발적인 생성을 억제할 수 있 다고 하여, 종양괴사인자를 이용한 치료방법에 대한 이론적 설명을 제시하였다. 관절염 실험동물 모델에 게 anti-TNF-α mAb나 sTNF-R fusion protein을 전 신적으로 투여했을 때 항염증과 관절 보호 작용을 나 타낸 바 있다28).
MIF의 활성은 synovial B cell에서 IL-6의 분비 증 가를 유도하는데, 전염증 cytokine인 IL-6는 류머티스 성 관절염과 같은 만성적 염증 질환에서 병적인 역할 을 하는 것으로 보인다29).
또한 MIF의 활성은 FLS와 대식세포에서 MMP 생성 을 유도하는데, MMP-9은 laminin과 type IV collagen 을 선택적으로 분해하여 기저막을 파괴하여 염증관련 세포 이주를 용이하게 한다30).
면역반응 유도는 상당부분이 분화된 도움 T 세포 가 분비하는 cytokines에 의해서 결정된다. 즉 IL-12 등에 의한 Th 1 cell 분화는 지연성과민반응(delayed type hypersensitivity)이나 세포독성 T 세포 반응과 같은 세포성 면역반응(cell mediated immunity)을 유
도하고, Ig G의 생산을 통한 opsonization를 촉진하는 반면, IL-4 등에 의한 Th 2 cell 분화는 급성 과민반응 (acute type hypersensitivity)이나 호산구(eosinophi)l 의 활성, B cell 활성을 통한 Ig E 생산 촉진과 같은 체액성 면역반응(humoral immunity)을 유도한다. 또 한 Th 1 cell은 INF-γ를 통해 Th 2형 반응을, Th 2 cell은 IL-4를 통해서 Th 1형 반응을 억제한다. 평상 시 Th 1과 Th 2 cell은 상호작용을 통해 면역균형이 유지되며, Th 1 / Th 2 cell 분화의 불균형은 면역 질 환을 일으킨다. IL-1β, IL-2, IL-12, IL-18의 자극에 의한 Th 1 cell의 과도한 분화는 INF-γ 분비 증가로 류머티스성 관절염을 일으킨다.
류머티스성 관절염 환자의 경우 Th 1 활성의 우세 와 Th 2 활성의 부족이 나타나고 이러한 불균형이 염 증성 대식세포와 B-cell의 활성화에 기여하게 된다.
CD28 costimulatory signa31)과 IL-12는 Th 1 세포 분 화에 관여하고, IL-4는 Th 1 cell의 활성을 억제하여 IL-1 및 TNF-α의 생산을 감소시키고 IL-1 receptor antagonist의 발현을 증가시켜 염증반응을 감소시킨다.
이와 같은 이론적 근거를 토대로 하여 본 연구에서 생쥐에 type Ⅱ collagen으로 관절염을 유발(CIA)시 킨 후 in vitro 실험에서 in vivo 실험에 사용된 동일 한 생쥐의 무릎 윤활관절세포를 적출 및 배양하여 CIA 유발 관련 cytokines인 MIF, TNF-α의 mRNA 발현량을 측정한 결과 紅花子油약침액을 처리하지 않 은 윤활관절세포에 비하여 紅花子油약침액을 처리한 윤활관절세포에서 MIF mRNA는 10-4에서 13.9%, 10-3에서 20.3%, 10-2에서 20.6% 및 10-1에서 52.6%가, TNF-α mRNA는 10-4에서 4%, 10-3에서 15.2%, 10-2 에서 17.8 % 및 10-1에서 18.5%가 감소하여 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현량 모두 농도 의존적으로 감소 하였다. 이는 紅花子油약침액이 윤활관절세포의 초기 CIA 유발 관련 cytokines의 활성을 억제시키는 효과 가 있는 것으로 사료된다.
In vivo 실험에서 type Ⅱ collagen 유발 생쥐의 관 절염을 대상으로 슬관절 근위에 있고, 문헌적으로 痺 證에 다용되는 인체의 委中(BL40)18) 상응하는 부위에 紅花子油약침을 주입한 후, 발의 두께 변화를 조사한 결과 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되 어 염증이 완화된 것을 확인하였고, 조직화학 실험으 로 윤활관절막 내의 형태학적 변화에서 대조군에 비 하여 실험군은 윤활관절막의 자유면 두께 증가와 유 활강 쪽에서 많은 세포질 돌기를 내는 윤활세포들의 출현도 감소한 것으로 관찰되며, 또한 림프구 침윤도
적었다. 대조군의 윤활관절막 내 지방조직 사이에서 적은 수로 분포한 혈관은 대조군에서 증가되었는데 특히 윤활관절막의 자유면 기저부의 윤활세포 주변에 서 모세혈관후세정맥의 출현이 증가하였으나 실험군 은 일부 윤활관절막의 자유면에서만 모세혈관의 출현 증가가 관찰되었고, 류머티스성 관절염의 특징인 섬 유화 또한 대조군에 비하여 감소하였고 섬유화 주변 에 침적하는 섬유모세포의 수도 적었다.
면역조직화학 실험으로 윤활관절막 내 초기 CIA 유발 관련 cytokines 생성 억제에 미치는 영향을 조사 하기 위해 CIA 유도 cytokine인 MIF 양성반응의 영 상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1,303% 증가 하였고, 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소 하였다. pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 양성반 응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 422%
증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, IL-6 양성반응의 영상분석 결과 대조 군이 정상군에 비하여 1,449% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 단백분해 효소인 MMP-9 양성 반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 974% 증가하였고 실험군은 대조군 에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 윤활관절막 내 Th 1 분화 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 cytokine인 IL-12 양성반응 의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 946%
증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. Th 1세포 분화 신호기전에 관여하는 CD28 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 739% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 윤활관절막 내 염증 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 염증 억제에 관여하는 PPAR-γ 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군 에 비하여 289% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하 여 유의성 있게 증가하였다. 이는 紅花子油약침액이 윤활관절세포에서 MIF 활성을 억제하여 관절의 손상 을 완화시키는 효과가 있는 것으로 사료된다.
본 실험의 결과는 황13)의 녹용약침을 사용한 실험에 서 류머티스성 관절염에 유효한 효과가 있다고 발표한 결과와 유사하게 나타났으며, 또한 이9)의 유근피를 사용한 실험에서 유효한 효과를 입증한 실험적 보고 와도 일치하여 염증성 관절질환에 대한 치료에서 각 각의 약침제제가 효과가 있음을 시사하고 있다. 이와 같은 결과를 토대로 하여 추후 각각의 약물을 배합한 혼합약제에 의한 약침제제에 대한 연구가 적극적으로
이루어진다면 더욱 우수한 치료효과가 기대된다.
Ⅴ. 결 론
紅花子油약침 처치가 CIA 유발 생쥐의 관절염에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, in vitro 실험에서 생 쥐의 윤활관절세포내에서 CIA 유발 유전자 발현변화 조사를 위한 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현억제를, in vivo 실험에서 CIA 생쥐의 윤활관절막 손상완화 여부 를 조사하였다. CIA 유발 제3일부터 제21일까지 매 일 관절염 유발 부위인 왼쪽 委中(BL40)에 CSOP를 1 ㎕/20g 시술한 후, 발의 두께 변화, 일반적인 형태 변화, 윤활관절막 내의 혈관 신생성, 섬유화, 초기 유 발 관련 cytokines 생성 억제효과, Th 1 분화 억제 효 과 및 염증 억제 효과를 관찰한 결과, 다음과 같은 결 론을 얻었다.
1. CSOP가 처리된 CIA 유발 생쥐의 윤활관절세포에 서는 초기 류머티스성 관절염 유발 관련 cytokines 인 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현이 농도의존적 으로 감소하였다.
2. CSOP가 시술된 생쥐의 발의 두께가 유의성 있 게 감소하였다.
3. CSOP가 시술된 생쥐의 무릎 윤활관절막 내 조 직 손상, 모세혈관 분포 및 섬유화가 유의성 있 게 감소하였다.
4. CSOP가이 시술된 생쥐의 초기 류머티스성 관절 염 유발 관련 cytokines의 생성 억제 효과 실험 중 MIF, TNF-α, IL-6 및 MMP-9이 유의성 있 게 감소하였다.
5. CSOP가 시술된 생쥐의 Th 1 세포 분화의 억제 효과 실험 중 IL-12와 CD28이 유의성 있게 감 소하였다.
6. CSOP가 시술된 생쥐의 염증 억제 실험 중 PPAR-γ가 유의성 있게 증가하였다.
Ⅵ. 참고문헌
1. 해리슨 내과학 편찬위원회. Harrison’s 내과학(Ⅱ).
서울 : 정담. 1997 : 1777-85.
2. 홍원식. 精校黃帝內經. 서울 : 東洋醫學硏究院. 1989 : 86-7, 259, 305.
3. 張介賓. 景岳全書(上). 서울 : 대성문화사. 1988 : 229- 35.
4. 丹波元堅. 雜病廣要. 서울 : 성보사. 1986 : 108-219.
5. 虞搏. 醫學正傳 . 서울 : 성보사. 1986 : 221-8.
6. 정경연, 김갑성. 사향·우황·웅담 복합제재(OK)약침 이 백서의 류마티스 관절염중 혈액학적인 변화 및 Collagen의 분포변화에 미치는 영향. 대한침구학 회지. 1999 ; 16(3) : 255-68.
7. 최유행, 김갑성, 이승덕. 계지약침자극이 mouse의 LPS 유발 관절염 중 세포성면역반응에 미치는 영 향. 대한침구학회지. 2001 ; 18(1) : 100-12.
8. Lee AR, Lee SD, Kim KS, Kim WY, Kim KH.
Prevention of Collagen-induced Arthritis in Mice by Deer Antler Extract(DAE). 대한침구학 회지. 2006 ; 23(2) : 125-37.
9. 양기영, 김영일, 이현. 족삼리 독활약침이 Collagen- induced Arthritis에 미치는 영향. 대한침구학회지.
2006 ; 23(3) : 191-206.
10. 이연경 이병렬. 목방기약침이 관절염에 미치는 실 험적 연구. 대한침구학회지. 2001 ; 18(4) : 125-42 11. 辛民敎. 臨床本草學. 서울 : 영림출판사. 1989 :
467.
12. 황우량. 紅花子약침액 및 Estrogen이 실험적 골다 공증에 미치는 영향. 우석대학교 대학원 석사학위 논문. 1998.
13. 김선혁, 이준무, 금선혁. 홍화유약침이 Microcry- stalline sodium urate로 유발된 흰쥐의 통풍에 미 치는 영향. 대한침구학회지. 1998 ; 15(1) : 483-91.
14. 조민수, 안창범. 紅花子약침이 수은중독에 의한 家 兎의 급성신부전에 미치는 영향. 대한침구학회지.
1998 ; 15(1) : 503-13.
15. 박기철, 박희수. 紅花子약침의 암전이 억제와 면역 활성화에 관한 연구. 대한침구학회지. 2006 ; 23(6) : 45-60.
16. 임대정. 紅花子약침의 항염증능이 백서의 LPS 유 발 류마티스성 관절염에 미치는 영향. 동국대학교 대학원 석사학위논문. 2005.
17. Stuart JM, Townes AS, Kang AH. The role of collagen autoimmunity in animal model and human diseases. J Invest Dermatol. 1982 ; 79 suppl 1 : 121-7.
18. 김무진, 윤종화, 김경호, 이승덕, 김갑성. 류마티스
성 관절염의 침구치료에 관한 문헌고찰. 대한침구 학회지. 2005 ; 22(1) : 191-201.
19. Peter Schenck, Stefan Schneider, Rolf Miehlke, Peter Prehm. Synthesis and Degradation of Hyaluronate by Synovia from Patients with Rheumatoid Arthritis. J Rheumatol. 1995 ; 22(3) : 400-5.
20. Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Rheumatoid arthritis. Cell. 1996 ; 85(3) : 307-10.
21. 배상철. 류마티스 관절염의 최신지견. 가정의학회지.
2001 ; 22(1) : 21-6.
22. Matthew H. Ornstein and Kirk Sperber. The antiinflammatory and antiviral effects of hydroxy- chloroquine in two patients with acquired immu- nodeficiency syndrome and active inflammatory arthritis. Arthritis Rheum. 1996 Jan ; 39(1) : 157-61.
23. 홍원식. 校勘直譯 黃帝內經靈樞. 서울 : 傳統文化硏 究院. 1994 : 234-7.
24. Morand EF. New therapeutic target in inflam- matory disease. macrophage migration inhibitory factor. J Internal medicine. 2005 ; 35(7) : 419-26.
25. Onodera S, Nishihira J, Koyama Y, Majima T, Aoki Y, Ichyama H et al. Macrophage migration inhibitory factor up-regulates the express of interleukin-8 messenger RNA in synovial fibroblasts of rheumatoid arthritis patients : common transcriptional regulatory mechanism between
interleukin-8 and interleukin-1beta. Arthritis Rheum. 2004 ; 50(5) : 1437-47.
26. Morand EF, Leech M, Weedon H, Metz C, Bucala R, Smith MD. Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritis : clinical correlations. Oxford : Rheumatology. 2002 ; 41 : 558-62.
27. Feldmann M, Maini RN. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis : what have we learned?
Annu REV Immunol. 2001 ; 19 : 163-96.
28. Feldmann M. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis : what can we learn about chronic disease? Novastis Found Symp. 2004 ; 256 : 53-69.
29. Lotz M, Guerne PA, Interleukin-6 induces the synthesis of tissue inhibitor of metalloproteinase-1/
erythroid potentiating activity (TIMP-1/EPA). J Biol Chem. 1991 ; 266(4) : 2017-20.
30. Burrage PS, Mix KS, Brinckerhoff CE. Matrix metalloproteinases ; role in arthritis. Front Biosci. 2006 ; 11 : 529-43.
31. Ando O, Suemoto Y, Kurimoto M, Horikawa T, Ichihashi M.. Deficient Th1-type immune responses via impaired CD28 signaling in ultraviolet B-induced systemic immunosuppression and the restorative effect of IL-12. J Dermatol Sci. 2000 ; 24(3) : 190-202.
