Department of Surgery, Pathology*, and Clinical Pathology**, Cancer Research Center***, College of Medicine, Pusan National University

Abstract

Experimental Study on Optimal Duration of Intermittent Hepatic Vascular Clamping Mun-Sup Sim, M.D., Hae-Young Kim, M.D., Young-Tae Bae, M.D., Dong-Heon Kim, M.D., Sang-Eun Moon, M.D., Mi-Young Seol, M.D.*, Han-Chul Son, M.D.**, Kyung-Sool Kwon, M.D.***

Department of Surgery, Pathology*, and Clinical Pathology**, Cancer Research Center***, College of Medicine, Pusan National University

(Background/Aims) During partial liver resection, intermittent hepatic pedicle clamping results in less hepatocyte damage than continuous clamping. However, the optimal duration of ischemia and reper- fusion during the intermittent hepatic vascular clamping has not been determined. So, this study aimed to determine the optimal duration of ischemia and reperfusion. Methods : Using partial ischemia(70%) rat model, the maximum limit of ischemic time and minimum limit of reperfusion time were evaluated.

To assess the maximum limit of ischemic time, rats were divided into three groups for 15, 20, and 30 minutes of ischemia followed by 60 minutes reperfusion. To assess the minimum limit of reperfusion time, reperfusion following 15-minute ischemia was repeated 10 times in three groups for 5, 10, and 15 minutes of reperfusion. In the ischemic experiments, hepatic blood flow and ATP levels were serially measured. In the reperfusion experiments, serum liver enzyme, 1-month survival rates, as well as, hepatic blood flow and ATP level were serially measured and then, the 1-month survival rate was com- pared between the continuous ischemic group and intermittent ischemic groups. Results : ⑴ In the 15- minute ischemic group, the hepatic blood flow and ATP levels returned to preischemic values after 1 hour of reperfusion. But in the 20- or 30-minute ischemic groups, the hepatic blood flow and ATP levels did not return to preischemic values. ⑵ In the 15-minute reperfusion group, the survival rate and hepatic function, such as hepatic blood flow and ATP levels, were better than the 5- or 10-minute reperfusion groups. Conclusion : In 70% partial ischemic rat model, the maximum limit of ischemic time was 15 minutes. In cases of intermittent ischemia and reperfusion, there was less liver damage in the 15-minute reperfusion group compared to the 5- or 10-minute reperfusion groups.

Key Words : Intermittent hepatic vascular clamping

간헐적 간혈류차단의 적절한 주기에 관한 실험적 연구

부산대학교 의과대학 외과학교실, 해부병리학교실*, 임상병리학교실**, 암연구소***

심 문 섭 , 김 해 영 , 배 영 태 , 김 동 헌 , 문 상 은 , 설 미 영 * , 손 한 철 * * , 권 경 술 * * *

서 론

간으로 유입되는 혈류의 일시적 차단은 간부분절 제술을 시행하는 동안 출혈을 조절하기 위해 시행 하는 방법이다.

술중출혈은 수술결과에 영향을 미 칠 수 있는 중요한 예후인자중의 하나로 일시적 혈 류 차단으로 사망률과 이환율의 감소를 관찰할 수 있다. Pringle

이 hepatic pedicle을 일시적으로 차 단하여 절제된 단면에서 실혈방지를 시도한 이후 지난 수 십년간 많은 외과의들이 간절제를 시행하 는 경우 Pringle수기를 시행하여 왔고, 이에 따라 일 시적인 혈류차단의 안전성과 적절한 기간을 알아내 기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.

일시적인 혈류차단은, 술중 출혈을 감소시킬 수 있지만 허혈기간에 비례해서 간세포의 허혈성 손상 과 장정맥의 울혈을 유발할 수 있다. 그러므로 일시 적인 혈류차단의 최대허용 한계를 결정하고 이 기 간내에서 시행하는 것이 중요하다. 지금까지의 연 구결과로는 사람에서 간절제를 시행하는 경우 건강 한 사람은 약 60분까지 허혈에 견딜 수 있다고 알려 져 있지만 간담도계를 전공으로 하는 외과의들은, 술후 간손상을 반영하는 간효소 상승이 간허혈 기 간과 직접적으로 관련있다는 연구

가 발표되어 왔 기 때문에 장기간 Pringle수기를 시행하는 것을 꺼 리고 있다. 게다가 사람에서 장기간 간혈류를 차단 하는 경우 유발되는 간세포의 허혈성 손상과 장정 맥 울혈의 상대적 중요성도 아직 정확하게 밝혀져 있지 않고 있다. 최근에는 간세포의 허혈성 손상을 최소화하기 위한 대안으로, 혈류차단을 여러번 나 누어 시행하는 간헐적 혈류차단이 제시되었는데, 여러학자들이 논문을 통하여 단기간의 간헐적 혈류 차단이 지속적인 차단보다는 간손상을 감소시킨다 는 결과를 발표하였다.

또한, Isozaki

도 동물실험 을 통하여 간혈류의 지속적 차단과 간헐적 반복차 단의 결과를 비교하여 간헐적 반복차단의 유용성을 주장하였다.

간헐적 반복차단의 이상적인 조건으로, 각각의 허 혈(ischemia)주기는 간세포의 생존능력(viability)을 보존할 수 있는 최대한의 기간이어야 하고, 각각의 재관류(reperfusion)주기는 허혈로 유발된 간세포 손상이 충분히 회복하기 위한 최소한의 기간이어야 한다. 이러한 조건을 만족시킬 수 있는 주기가 결정

된다면 보다 적극적인 치료방법으로 응용되어질 수 있을 것이다.

이에, 저자들은 혈류차단과 재관류를 반복하는 간 헐적 반복차단의 적절한 기간을 결정하기 위해 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

1. 실험재료

체중 400-500g의 외견상 건강한 흰쥐(Sprague- Dawley rat)를 성별에 관계없이 사용하였다. 허혈 기간에 관한 분석(15분-, 20분-, 30분-허혈군)과 재 관류기간에 관한 분석(5분-, 10분-, 15분-재관류군) 을 위해 군별로 각각 10마리의 흰쥐를 사용하였으 며, 1개월 생존율에 관한 분석에서도(5분-, 10분-, 15분 재관류군과 150분-지속적 혈류차단군) 군별로 각각 10마리의 흰쥐를 사용하여 실험하였다.

2. 실험계획

흰 쥐 를 실 험 12시 간 전 부 터 금 식 시 킨 후 Pentobarbital sodium(50㎎/㎏)으로 복강내 마취를 시행하고, heparin 100 Unit를 정맥주사하였다. ∩ 형 절개로 개복을 시행한 후 간문부를 노출하여 흰 쥐간의 70%를 차지하는 좌측엽(left lateral lobe)과 정중엽(median lobe)의 문맥과 간동맥, 그리고 담 관을 미상엽과(caudate lobe)과 우엽(right lobe)으 로 가는 혈관의 기시부 보다 원위부에서 작은 혈관 감자(clamp)를 이용하여 차단하였다. 흰쥐간의 30%를 차지하는 미상엽과 우엽으로 가는 혈류는 차 단하지 않았는데 이 경로를 통해 문맥혈류를 유지 함으로써 위장관계 정맥의 울혈발생을 예방하였다.

실험기간동안 체온은 30-36℃로 유지하였다.

3. 실험방법

허혈/재관류의 가장 적절한 적용시간을 평가하고,

아울러 지속적 허혈을 시행한 군과 간헐적 허혈/재

관류를 시행한 군에 있어서 생존율을 비교하기 위

해 우선, 기간을 달리하는 허혈을 적용한후 충분한

재관류를 시행하여 간세포의 생존능력이 보존되는

최대한의 허혈기간을 규명하였고, 이 결과를 토대

로 기간을 달리하는 재관류를 적용하여 허혈/관류

주기를 10회 시행하였다. 다음으로 간헐적 차단을

시행한 군과 지속적 차단을 시행한 대조군의 1 개월

생존율을 분석하여 유의성에 대한 평가를 시도하였

다.

⑴ 허혈기간에 관한 분석

적절한 허혈기간을 평가하기 위해 서로 다른 허혈 시간(15분-허혈군, 20분-허혈군, 30분-허혈군)을 적 용한 후 60분간 충분히 재관류시켰다. 허혈과 재관 류를 시행하는 동안 간혈류와 ATP농도를 5분내지 10분간격으로 각 군당 10마리의 휜쥐에서 연속적으 로 측정하였다. 간혈류는 도플러초음파를 사용하여 간좌측엽 경계면에서 1㎝ 떨어진 지점에서 측정하 였고 ATP측정은 Miyamoto와 French

가 언급한 방 법으로 정량화 하였다. 이들 측정결과는 시간에 따 른 변화의 추이를 관찰하기 위해, 허혈유발전 수치 에 대한 백분율로 표기하였다. 60분의 재관류 기간 내에 사망한 흰쥐는 실험에서 제외하고 다른 흰쥐 로 다시 실험하였다.

⑵ 재관류기간에 관한 분석

가장 적절한 허혈적용기간을 분석한 후, 이를 근 거로 각 군당 10마리의 흰쥐에게 서로 다른 재관류 시간(5분-재관류군, 10분-재관류군, 15분-재관류군) 을 적용한 간헐적 허혈을 10회 시행하였다. 10회의 주기동안 허혈주기 직전에 간혈류와 ATP농도를 연 속적으로 측정하여 결과는 허혈유발전 수치에 대한 백분율로 표기하였다. 또한, 10회의 허혈/재관류시 행 1시간 후 하대정맥에서 혈액을 채혈하여 AST, ALT, LDH, ALP의 농도를 측정하였다. 이들 5분, 10 분, 15분-재관류군의 간헐적 허혈군의 1개월 생존 율을 분석하기 위해 대조군으로 150분 지속적 혈류 차단군을 추가하였다. 10회 주기내에 사망한 흰쥐 는 실험에서 제외하였고, 다른 흰쥐로 다시 실험하 였다.

4. 통계학적 처리

각군의 측정치는 평균±표준편차로 표기하였다.

1개월 생존에 관한 분석은 Fisher’s exact test로 시 행하였으며, 나머지 측정치는 Kruskal-Wallis test로 시행하였다. P<0.05일 때 유의성 있는 것으로 간주 하였다.

결과

Ⅰ 허혈기간에 대한 분석 1) 간조직 혈류

15분-허혈군에서 간혈류는 재관류 직후부터 급격 히 상승하여 10분경에 최고치에 도달되었으며 그후 일시적으로 감소한 뒤 점차 상승되어 재관류 60분 후에는 허혈유발전의 수치와 거의 유사하게 회복되 었다. 20분-허혈군에서 간혈류의 회복은 15분-허혈 군보다 다소 느리게 회복되어 재관류 20분경에 최 고치에 도달하였고 그후 서서히 감소된 후 재관류 60분 후에는 허혈유발전 수치의 70%정도까지 회복 되었다.

30분-허혈군에서 간혈류는 서서히 상승하였으며 전체적으로 회복되는 유형은 부적절하였다. 이 경 우 최고치는 출현하지 않았으며 재관류 60분 후에 는 허혈유발전 수치의 50%정도를 유지하였다. 15 분-허혈군과 20분-허혈군의 간혈류는 10분, 40분, 50분, 60분의 측정치가 유의성 있는 것으로 관찰되 었으며, 30분-허혈군과 비교한 경우 재관류 기간동 안 모두 유의성 있게 증가된 것으로 관찰되었다(Fig 1).

2) ATP level의 변화

15분-허혈군에서 ATP수치는 재관류 60분에 허혈 유발전 수치의 90%이상으로 회복되었으나 20분, 30분-허혈군에서는 각각 80%, 70%까지만 회복되었 다. 15분-허혈군의 ATP수치는 20분허혈군에 비해 재관류 60분후에 의미있게 높은 것으로 관찰되었고 30분-허혈군에 비해서는 재관류 15분, 50분, 60분후 에 의미있게 높은 것이 관찰되었다. 그러므로 20분 혹은 30분간 지속되는 허혈은, 1회를 시도하더라도 60분이내에서 간조직혈류와 ATP수치가 정상으로 회복되지 않음을 알 수 있었다(Fig 2).

Ⅱ 재관류기간에 관한 분석 1) 간조직 혈류

15분 허혈을 시행한 후 각군별로 5분, 10분, 15분 씩의 재관류를 시행하는 1회의 주기를 10회 적용한 후 간혈류변화를 허혈유발전의 수치와 비교하였다.

15분-재관류군에서는 4회의 허혈을 유발한 후에 간 조직혈류가 허혈유발전 수치의 90%를 유지하였으 며 10회의 허혈을 시도한 후에도 간혈류는 70%정 도는 유지하였다. 그러나 10분-재관류군에서는 1회 의 허혈을 유발한 이후부터 허혈유발전 수치의 90%

이하로 감소하여 10회 허혈후에는 60%이하로 유지

되었고, 5분-재관류군에는 1회의 허혈 후 부터 허혈 유발전 수치의 70%이하로 감소하여 계속 낮은 상태 로 유지되었으며 10회 허혈후에는 50%이하로 감소 됨을 알 수 있었다. 15분-재관류군의 간혈류가 5분- 재관류군에 비해 10회 허혈기간동안 모두 유의성 있게 높은 것이 관찰되었다(Fig. 3).

2) ATP level의 변화

15분 허혈을 시행한 후 각군별로 5분, 10분, 15분 씩의 재관류를 시행하는 1회의 주기를 10회 적용한

후 ATP수치를 허혈유발전의 수치와 비교하였다.

15분-재관류군에서는 ATP수치가 서서히 감소하여 10회의 허혈을 시도한 후에는 허혈유발전의 60%로 유지 되었다. 10분-재관류군의 경우 6회의 허혈까 지는 15분-관류군과 유사한 소견을 보였으나 7회 이후부터 급격히 감소하여 10회의 허혈 후에는 결 국 허혈유발전의 50%이하로 감소하였다. 5분-재관 류군에서 처음부터 ATP수치가 급격히 감소하여 결 국 10회의 허혈 후에는 허혈유발전의 40%정도로 감소하였다. 15분-재관류군의 ATP수치는 10분-재 Fig.1 Changes in hepatic blood flow after varied

single period of ischemia, followed by a 60-min reperfusion period. Hepatic blood flow is expressed as a percentage of the preischemia value. Asterisk indicates P<0.05 between 15- and 20-ischemia group

; dagger indicates P<0.05 between 15- and 30-ischemia group.

Fig.2 Changes in ATP level after varied single period of ischemia, followed by a 60-min reperfusion period. ATP level is expressed as a percentage of the pre-ischemia value.

Asterisk indicates P<0.05 between 15- and 20-ischemia group ; dagger indicates P<0.05 between 15- and 30-ischemia group.

Fig.3 Changes in hepatic blood flow during 10 period of liver ischemia, with variable periods of reperfusion. Hepatic blood flow is expressed as a percentage of the pre- ischemia value. Dagger indicates P<0.05 between 15- and 5-reperfusion group.

Fig.4 Changes in ATP level during 10 period of liver ischemia, with variable periods of reperfusion. ATP level is expressed as a percentage of the pre-ischemia value.

Asterisk indicates P<0.05 between 15- and

10-reperfusion group ; dagger indicates

P<0.05 between 15- and 5-reperfusion

group.

관류군의 ATP수치에 비해 8회의 허혈 후부터 의미 있게 높은 것이 관찰되었고, 5분-재관류군에 비해서 는 1회, 3회, 4회 그리고 8회 이후의 허혈에서 의미 있게 높은 것이 관찰되었다(Fig 4).

3) 간효소

AST, ALT, LDH, ALP의 농도는 10회의 허혈/재관 류를 시행한 뒤 1시간 후에 측정하였다. 5분, 10분, 15분-재관류군의 AST는 각각 1033±823, 947±

696, 1087±206 (IU/L)이었고, ALT는 각각 563±

396, 498±469, 481±131 (IU/L)이었으며, LDH는 각각 7927±5277, 8539±3546, 8701±3934 (IU/L) 이었다. 또한, ALP는 각각 297±96, 230±109, 214

±147 (IU/L)로 측정되었다. 그러나 5분, 10분, 15 분-재관류군에서 재관류기간과 간효소의 변화사이 에 통계적인 유의성은 관찰되지 않았다(Table 1).

Ⅲ 간헐적 허혈/재관류 군과 지속적 허혈군에 서 실험동물의 1개월 생존율 분석

5분, 10분, 15분-재관류군의 1개월 생존율 분석 실 험기간동안 12마리가 사망하였다. 5분-, 10분-재관 류군에서 각각 6마리, 5마리, 15분-재관류군에서 1 마리였다. 1개월 생존은 5분-, 10분-재관류군보다 15분-재관류군에서 높은 것으로 관찰되었다. 대조 군으로 시행된 150분 지속적 허혈군에서 1개월 생

존은 4마리였으며 15분-재관류보다 낮은 결과를 보 였다(Table 2).

고 찰

간부분절제술을 시행하는 동안 소실된 혈액의 양 은 술후 간손상과 예후를 결정하는데 중요한 요소 이다. Pringle

이 간 수술동안 일시적으로 혈류를 차 단하여 절제된 단면에서의 실혈방지를 시도한 이래 로 혈액의 소실을 줄이기 위한 방법으로 total hepatic vascular exclusion,

hemihepatic vascu- lar occlusion

등이 발표되었고 이러한 시도로 보 다 안전한 간절제술이 가능하게 되었다.

그러나 간은 허혈에 아주 민감한 장기이기 때문에 일시적 인 혈류차단으로도 세포손상이 유발될 수 있고, 그 기간이 길어지며 사망률과 이환율이 급격히 증가하 게 된다.

허혈에 대한 내성은 종(species)마다 다 양하게 나타나는데, 일반적으로 쥐와 개는 내성이 약하고 사람과 돼지는 다소 강한 것으로 알려져 있 다. 지금까지 발표된 연구에 의하면 장정맥의 울혈 이 없는 상태에서 건강한 사람의 간은 1시간의 간혈 류 차단을 견딜 수 있다고 알려져 있으며,

간경 화와 같은 질환이 동반된 경우는 술후 간부전의 빈 도가 증가하는 것으로 밝혀져 있다.

그럼에도 불 구하고 외과의들은 술후 간효소 상승으로 반영되는 Table 1. Liver Enzyme Levels Following 10 Cycles of Intermittent Ischemia With Variable Perfusion

Time.

5-min Reperfusion 10-min Reperfusion 15-min Reperfusion P value

Group Group Group

AST(IU/L) 1033±823 947± 696 1087±206 NS*

ALT(IU/L) 563±396 498± 469 481±131

LDH(IU/L) 7927±5277 8539±3546 8701±3934

ALP(IU/L) 297± 96 230± 109 214±147

NS : nonspecific * : P values between 5-min, 10-min and 15-min reperfusion group

Table 2. 1-Month Survival & Death

150-min

5-min 10-min 15-min Continuous

Reperfusion Group Reperfusion Group Reperfusion Group Ischemia Group

Survival 6 5 1 6

Death 4 5 9 4

% 40 50 90 40

간손상의 위험성과 혈류차단 후 유발되는 허혈과 장정맥 울혈의 상대적 중요성도 위험성이 아직 정 확히 알려져 있지 않기 때문에 Pringle수기의 시행 을 꺼리고 있다.

최근에는 혈류차단으로 유발되는 허혈의 영향을 최소화하기 위해 장기간의 차단보다는 단기간의 차 단 을 반 복 시 행 하 는 시 도 가 이 루 어 지 고 있 다 . Makuchi

등은 술중출혈과 혈류차단에 의한 순환계 와 생화학적 장애를 최소화하기 위해 한쪽엽의 혈 류를 선택적으로 차단하는 방법을 개발하였는데, 간헐적 허혈(30분)/재관류(5분)를 4회 시도함으로 써 술중실혈과 술후 고빌리루빈혈증의 의미있는 감 소를 보고하였다. 또한 간혈류 차단의 안전한 방법 을 결정하기 위하여 지속적 차단과 간헐적 반복차 단을 비교하는 동물실험을 하였는데, 이 실험에서 간헐적 혈류차단을 시행한 군이 지속적 혈류차단을 시행한 군보다 간손상이 적다는 결과를 발표하였 다. 이들 연구는 지속적 혈류차단에 대한 간헐적 혈 류차단의 내성을 조사하기 위해 시도되었지만 적절 한 허혈기간과 재관류기간에 대한 언급은 없었다.

간헐적 허혈과 재관류를 안전하게 시행하기 위한 조건으로, 각각의 허혈주기는 간세포의 생존능력을 보존할 수 있는 최대한의 기간이어야 하고 각각의 재관류주기는 허혈로 유발된 간세포 손상이 충분히 회복되는 최소한의 기간이어야 한다.

비가역적 손상없이 장기가 견딜 수 있는 허혈의 한계는 분명히 존재한다. 저자들의 실험결과, 장정 맥 울혈이 유발되지 않는 70%의 혈류차단실험에서, 20분, 30분-허혈/60분-재관류 후의 간혈류와 ATP는 정상으로 회복되지 않았으나 15분-허혈/60분-재관 류에서는 간혈류와 ATP가 모두 정상으로 회복되었 다.

15분의 허혈을 적용한 뒤 5분 10분, 15분의 재관 류를 반복 시행한 실험에서, 15분 재관류를 시행한 군에서만 간기능과 생존율이 정상으로 호전되는것 을 알 수 있었다. 간헐적 허혈/재관류 반복과 지속 적 허혈에 대한 생존율분석에서 15분-재관류군은 1 개월 생존율이 90%였지만 5분-, 10분-재관류군의 1 개월 생존율은 40%, 50%였고 150분 지속적 허혈군 의 경우에서도 1개월 생존율은 40%로 유사한 결과 를 보였다.

그러나 1개월 생존율에 대한 통계적 검증은 유의 성이 없는것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 실험 대상의 개체수가 작았기 때문으로 생각되며, 보다 정확한 검증을 위해서는 좀 더 많은 실험군을 이용 하여 조사하여야 할 것으로 생각된다.

5분, 10분 재관류군과 150분 지속적 허혈군에서 1 개월 생존율이 낮게 관찰된 것은 간세포가 생존능 력(viability)을 회복하는데 필요한 혈류를 공급받지 못한 것이 원인이라 생각되며, 또한 재관류로 유발 되는 재관류손상(reperfusion injury)에 의한 간 이 외의 다른 장기 손상도 생존율을 감소시킨 원인이 라고 생각된다. 간으로 유입되는 혈류를 차단 후 재 관류를 시행하는 동안 발생할 수 있는 부가적인 손 상을 재관류손상이라고 하는데, 이러한 손상은 주 로 macrophage에서 생성된 superoxide anion과 같은 oxidants,

그리고 IL-1, TNF와 같은 cytokine 에 의해 매개되며, 간세포 뿐만 아니라 다른 장기의 세포에도 영향을 미치는 것으로 생각된다. 비록 허 혈/재관류 손상의 기전을 연구한 논문은 많으나 아 직까지 광범위하게 받아들여지는 가설은 없는 실정 으로, 앞으로 더 많은 연구가 되어져야 할 것이다.

결론

흰쥐에서 허혈과 재관류의 적절한 기간을 결정하 기 위해 위한 저자들의 실험결과, 비가역적 손상이 유발되지 않는 허혈의 최대허용한계는 15분 이었 고, 간조직의 기능이 최대한으로 회복 가능한 최소 한의 재관류기간은 15분 이었다. 이러한 실험결과 를 토대로, 더 많은 간헐적 간혈류차단에 관한 연구 를 시행하여 최소한의 간기능 저하를 초래하는 사 람에서의 허혈과 재관류기간을 결정한다면 간종양, 간손상, 간이식과 같은 간담도계 수술에서 출혈에 의한 술후사망률 및 이환률을 감소시킬 수 있는 보 다 적극적인 치료방법이 개발될 수 있으리라 사료 된다.

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