An Inhibitory Substance of Streptomyces sp. on the Germination of Mung Bean(I) -Isolation of the inhibitory substance and the condition of its production-

Kor. J. Appl. M icrobiol. Bioeng.

Vol.ll, No. 2, 81-86( 1983)

81

S treptomyces속 균주가 생성하는 녹두발아 저해물질( 1 )

-저해물질의 분리 및 생성조건-

金光顯·徐正增

(東義大풍 生物좋科， 慶北大字校 農科大좋) (1982年9 月 16 日 수리)

An Inhibitory Substance of S treptomyces Sp.

on the Germination of Mung 'Bean ( [ )

- Isolation of the inhibitory substance and the condition of its production-

K wang Hyeon Kim and Jung Hwn Seu*

Department of Biology, Dongeui Universi ty, Busan, Korea

*Department of Food Technology, College of Agricul ture, Kyungpook National University, Oaegu, K:Jrea

(Received September 16, 1982)

A strain 01 Streptomyces sp. (At.445) which was isolated lrom soil, was able to produce a biological active substance that had a strong inhibitory activity against germination and growth 01 mung bean

The inhibitory substance was purilicd Irom culture fluid by using Dowex MW A.l ion exchange column, activated carbon column, and Dowex 50W ion exchange column

The substance was stable in the wide pH ranging lrom 2 to 11 at 100⁰C, and the activity 01 the inhibitor was not decreased even by heat treatment at 100⁰C lor 5 hrs. The inhibitor didn’t have antimicrobial activity to any mlcroorgamsms^‘

The production 01 the inhibitory substance, when peptone an 4 casein hydrolysate as nitrogen source, soluble starch as carbon source, and copper salt as metal salt were added to the basal medium, was lavorable.

자연계에는 많윤 종류의 식율이 생육되고 있 서 al ternariol'ψfusaric acid'lO. 111, malform-

고 이플 식풀들의 생리현상은 쫓흉， 쩔根， 生長 iâ ^{12. 13)} 빛 a-picolinic acid' 1씨등이 알려져 있 및 花풍로 시작되는 分化에서 종벤식을 위한 다- 이와같이 미생울 기원의 생리활성울질에관 結몇에 이르기까지 몇로 다양하다. 이와같은 생 한 연구는 대부분이 mold류와 세균류에서 유래 리의 발현기구를 ‘해명하는 것은 중요한 명제로 되었으며 放射園을 대상으로 식물생 장조절울질 서 옛부터 추구되어 왔으며， 이런 생리 현상은 을 연구한 것은 1958 년 Koaze( 15 → 7)에 의해 발 生理活性物質에 의해 제어되고 있다는 생각은 아촉진울질인 L-prolyl- L-val ine anhydride 가유

18C 후반부터 대두되었다. 현재 이들 뼈物生長 일한 것이며 생장저해작용을 나타내는 울질로

調節物質들은 식물에서 유래한 식울성 hormon녕 11 서는 약간의 항생울질( \8)이 알려져 있다. 따라 식물체내에 함유된 phen이性 울질，%) 벚 lactone 서 본 연구에서는 고등식물에 유용한 생리활성 化싼物，3>이 알려져 있고， 화학합성울질 로서는 울질을 미생울의 대사산물에서 검색하고저， 현

N'-benzyl adenine'‘ " 1.1-dimethylhydrazide''', 재까지 검색 대상에서 거의 사용하지 앓‘ 은 비

DPX1840' 7) 및 morphactin" J 등이 있 a며， 또 명원성인 放線혐흡을 대상으로 녹두종자의 딸아 한 미생울 유래의 식울생장죠절물질로서는 ph- 중에 그 생장을 억제하i는 울절을 분리하고. 그 ytotoxln의 원인물질이 되는 것이 대부분으로 생성저해울절의 영반적 성질을 검토하였다.

재료 및 방법 정한 후 ethyl acetate용액으로 추출， 감압건 조시켜 무정형의 결정성 물질을 얻었다.

균의 분리 및 선벌 저해물질의 활성측정

대구지방 근교의 둥양을 園源試料로하여 放 Petri dish 내에 일정한 크기의 탈지연 (7 x 7 線園 약 15001洙를 분리하고 각 균주의 식물종 XO.1cm) 을 넣고， 일정한 농도로 희석시킨 시 자 발아져해물질 생성능을 조사한 결과， 녹두 료액 (pH7. 이 5ml을 첨가하여 발지연을 적신 종자에 가장 강한 딸아생장저해물질을 생산하 후， 먼저 증류수로 5 회 셰척한 녹두종자를 30 는 균주 At-445를 선별하였다. 이때 사용된 배 개씩 3 반복으로하여 30 "C에서 암딸아시켰다.

지의 조성은 glucose 1. 0%. peptone 1. 0%. 60시간 암발아시킨 녹두의 성장 길이를 측정하 NaCI O. 1 %. K ,HPO

‘

‘

5 cm) 하였다.

시료조제

균체를 제거하기위해 배양액을 딸지면으로여 과한 후 그 爛被을 N-HCI로 pH2.0 이 되게 조 정하여 생성된 침전물을 Toyo filter paper No. 2 로 再慮過시 켜서 anion exchanger인 Dowex M WA-1 의 column에 흉착시 켰다. 흉착된 저 해물 질을 5 % Na ，CO ，호 용출하고， 용출된 액을 N-HCl로 pH3.8 이 되도록 조정한 후 ethyl ac- etate용액무로 추출. 감압건조하고活性벚을 사 용하여 재흉착시켰다. 활성탄에 흉착된 姐害物 質은 다시 ethyl acetate로 용출시 킨 후 감압건 조하여 cation exchanger인 Dowex 50W 의 column 에 통과시켜 비흉착 부분의 용액을 pH 3.8 로조

Cul tured broth fi I tration Ion exchange column

(Dowex MW A-1) eluted with 5 % Na

,

,

extracted with EtAc at pH3.8 concentrat^lOn In vacuum Activated carbon column

eluted with EtAc Ion exchange column

I (Dowex 50W) None-absorbed fraction

I extracted with EtAc at pH3.8 concentratlon ^In vacuum Amorphous crystal

Fig. 1. Purification procedure of the inhi- biiory substance.

구로 하였다.

항균력 측정

Glucose-peptone 배지에서 disk (s6 5 mm) meth-

。d'씨로서 Gram양성 빛 음성 세균과 효모에 대 해 검정하였다.

균체량측정

균의 배 양액 을 8uchner funnel 상에서 Toy。

fi I ter paper No. 2로 여과， 칩균하여 증류수로

3 회 세척한 후 105⁰C 에서 힐量이 될때까지 乾 操시켜 평량하였-"'-며 균체량은 배양액 1 ml 당

건조균체의 mg수로서 나타내었다.

공시재료

본 실험에 사용된 종자로서 Brassica pekin- ensis (서울)와 Raphanus sativus L.(서울)은 김 해종묘상에서 . Oryza sativa L^,. (유신)과 Frit- cum aestivum L. (농림 4 호)는 경상북도 의성 군 다인연 농업협동조합드로부터 구업 하였으며 Phaseolus vidissimus T. (재래)와 Fagopyrum esculentum (보통) 은 일 반시 장에 서 시 판되 는 것 을 대상으로 하였다.

저해물질의 항균력 측정을 위해 사용된 균주 는 경북대학교 농과대학 식품가공학과 응용미 생물 연구실에 보관되어 있는 균주로서 Bacill- us megalerium IAM 8-425. Escherichia coli IAM 12119. S taphylococcus aureus IAM 1011 및 Saccharomyces cerevisiae IAM 42747~ λF 용되었다.

걸과 및 고찰

식물종자류의 발아생장에 미치는 영향 수종의 쌍자엽석불과 단자엽식풀을 대상으로 본 시료가 이들 종자 딸아생정에 미치논 영향

Vol.ll, No. 2,

을 조샤한 결과 Table 1 에서 보는 바와같이 본 시료는 사용된 종자들에 대해 비선택적으로 작용하여 그 생장을 저해하였다. 특히 단자엽 식울의 뿌리 부분은 거의 완전히 생장이 억제 되였으며 shoot 의 생장도 다소 억제되었다. 또 한 쌍자엽식울에서도 생장저해현상은 단자엽식 울에서와 마찬가지로 현저했으며 특히 녹두의 hypocotyl 의 생장저해현상이 다른 종자에 비해

가장 현저하게 나타났다.

Table.1. Effect of the inhibitory substance on the growth of various seeds.

Seeds Growth inhibition(%) Phaseolus ν idis s imus L.

Brassica pekinensis Raphanus sativus L. Fagopyrum esculentum Oryza sativa L.

Tritcum aest ivum L.

68

35 38 37 48 46

The length of shoot in monocotyledon and the length of hypocotyl in dicotyledon were measured for the degree of growth inhibi tion

。f each seed. Seeds were germinated at 30⁰C for 60 hrs in dark room.

저해물질의 항균력 측정

항생물질이 식물생장에 영향을 미친다는 보 고(1 ’)가 있어 본 균주가 생산하는 저해물질이 항균력 을 함유하고 있는지 의 여부를 조사하기 위해 glucose-peptone 배지을 사용하여 Gram 양 성. Gram음성 세균 빛 효모에 대하여 disk method로 항균력을 검토해본 결과 Table 2 에서 와 같이 본 저해물질은 사용된 눈주들에 대해 향균력을 전혀 가지지 않았다.

Table 2. Antimicrobial activity test of the inhibitory substance.

sample conc. (μg/ml) "

strains ‘ )

Bacillus megaterium Escherichia coli S taphylococcus aureus - Saccharomyces cerevlswe

250 500 1000 2000

Disk method was performed for the determi- nation of antimicrobial activity of the inhibi- tory substance on the glucose-peptone medium.

Symbol: - ; negative.

83

저해물질의 농도변화에 따론 북두의 발아생장 본 저 해물질의 농도변화에 따른 녹두의 발아 생창에 래한 영향을 조사하기 위해 30⁰C 에서 6

시간 암발아시킨 결과 Fig.2 에서 보는 바와같

이 250mg/ml 농도의 시료로서 뿌리의 생장이

。

*-

....

...

>’

*‘ _엄 60

〉、

」

....

:E 40 ..c _;

Q)

을 20

<<ì Q) 여

0

。

。

1. 0 2.0 3.0 4.0 5.0

Treated time (hr)

Fig. 2. Heat stability of the inhibitory su- bstance. The inhibitory substance was treated at 100^oC.

약90% 가량 저해되었으며 고농도인 2000mg/ml 에서는 약97% 의 저해를 나타내였다. 또한 hy- pocotyl 에 대 해 서 는 250mg/ml 농도의 시 료를 사 용했을때 40% 정도의 저해현상이 나타났고 500 mg/ml이상의 농도에서는 동일하게 약65% 의저 해를 유지하였다. 다라서 이하의 결괴에서는뿌 리와 hypocotyl을 합한 전체의 생장길이로 나타 내였으며， 또한 본 저해울질의 농도에 따른 녹 우 딸아생장에 대하여 시간별로 조사해 본 결 과는 Table 3 와 같다.

저해물질의 열안정성

시료를 500mg/ml농도가 되도록 5mMphosph- ate buffer (pH7. 0)에 용해시켜 100⁰C 에서 %중時 的으로 5 시간까지 가열하면서 그 殘存活性度 를 조사한 결과 Fig.3 에서 보는 바와 갇이 본 저해울질은 열에 대단히 안정 하였다-

저해물질의 pH안정성

시료 1000mg/ml 농도의 수용액을 N-HCl 과 N-NaOH를 샤용하여 pH2.4에서 pHll. 0까지 각 단계별로 조정하여 100 "C에서 1시간동안 가열 처리한 후 본 시료의 농도를 50Gmg/ml 되도록 희석하고 이 용액의 pH도 중성으로 再調節하여 그 殘存活性度을 測定하였다. Fig. 4 에서 보는 바와같이 본 저해 물질은 失活이 거의 일어낚

。-。(-E‘\야i)---*잉

}@

〕a벼I잉--{』(]

nu

nU

nU

nU

i*

‘‘

g

”4

’_l

띠||이||에메메이

n3

。-。

”‘

”o

/。 γ

~

“ /·

•

• 10。

(。

~ 80

...

>

성 60

쩌

84

Table 3. Growth of mung bean at the conce- ntration of the inhibitory substance according to the gormination time.

。

〉、

~ 40

. ... -

.t!

l

픔 20

. -

잉

>

i

*‘ _어

-

여

Growth length(cm) Germination

time(hr. )

48 60 lnhibi tor 24

conc. (μg/ml)

8.2 0 4.5 1.2

0

10

The production of the inhibitory su- bstance on cultural time course. The cultivation was carried out on reci- procal shaked5cm. 90 strokes/min) at 30.C.

2 4 6 8

Cultural time (day) Fig. 4.

7.0

5.4

2.3 6.8

3.5 4.0

4.0

3.5 2.5 1.5 1.2

1.2

0.5 1.2 1.2 25

100 250 500 50

o 1O

(-E\벼즉) =엉 }。:*빼·%--iia 씨 때 때

M

이||에메메이||」이

닝

~ _~놔

넘

·서

『

t 。얘

4 .//

’

。/」

g//

。

10 Cultural time (day)

Fig 5. The production of the inhibitory subs tance and cell growth on cultural time

8 6 4 2

• •

s

...

>

굉 60 OS

〉、

~ 40 a *‘

를 20

잉

.... >

OS

~ 여

0 1.8

0 2 1.3 1.5

The number was taken as the means of growth length from one hundred seed of germinating mung bean.

1.3 0.2

1000 2000

。 σ

。---。

~ ... 80

“ >

*‘ _익 혀 60

〉、

‘ -

....

a 흩 40

~ >

양 20 cc: ~

course.

11. 0

pH stability of the inhibitory subs- tance. The inhibitory su뼈 tance was treated at 100.C for 1 hr. ^‘

9.0 5.0 7.0

pH 3.0

Fig. 3.

게 유지되었다. cell mass는 배양 2 일만에 ma- ximum stationary phase에 도말하였고， 저 해울.

절 생성은 stationary phase인 배양 4 일에서 cell mass 감소현상이 나타나는 5 일째 최대의 저해물질 생성을 보였다. 이때 저해울질의 활 성도 측정은 30 "C에서 60시간 암발아 시킨 녹 두의 생 장걸이를 측정 하여 산출하였다.

저해물질 생성에 미치는 탄소원의 영향 Glucose를 제외한 gl ucose-peptone 배지에 각 종 탄소원을 1 % 되게 첨가하여 본 균주플 30

℃에서 5 일간 진탕배양시켜 저해울질 생성능 을 조사한 결과 Table 4 에서 보는바와 같이 사 지 않았으므로 넓은 엄위의 pH에서 안정한

질이었다.

배앙시간에 따른 저해물질 생성

Glucose-peptone 배지 를 100ml 용 진탕 flask 에 각각 20ml 씩 넣고， 30"C에서 진탕배양 (진폭

5 cm, 분당 90왕복)하연서 배양시간에 따른 균 의 증식과 pH 변화 및 저해울절 생성과의 관계 를 조사해 본 결과， Fig.5 에서와 같이 배양시 간이 경과함에 따라 pH 는 다소 증가현상을 보 였으며 배양 8 일이후부터는 pH8 .4로서 일정하

D T E

Vol.ll,No.2,

Table 4. Effect of carbon source on the production of the inhibitory au뼈-

tance.

C-source Cell dry weight Inhibition (mg/ml) ratio (%)

none 0 0

glucose 3.09 62.9

xylose 2'.83 69.4

lattose 1. 52 71.0

sucrose 3.23 61. 3

soluble starch 3.02 90.3 The concentration of each carbon source was 1. 0%.

용된 탄소원중에 가용성 전분올 배지 내에 첨가

85

질소원으로 사용한 경우가 저해물질 생성에 가 장 좋은 결과를 얻었다. 이얘 저해물질의 활성 도는 녹두를 30"C에서 60시간 암발아시켜 그 성 장길이를 측정하였다.

저해물질 생성에 미치는 금속엽의 영향 본 저해울질 생성에 미치는 금속염의 영향을 조사하기위해 glucose 1 %, peptone 1 %, K

,

플 上記의 배지내에 첨가하여 본균을 배양했을 때 저해물질 생성이 가장 양호하였다. 이때 저 해물질의 활성도는 녹두를 30.C 에서 60시간 암 발아시켜 그 성장길이를 측정하였다.

시 켰을 경우 저해물질 생성 이 가장 양호하였다 Table 6. Effect of metal salt on the produc‘ 이때 저해물질의 활성도 측정은 30"C에서 60시 tion of the inhibitory su뼈tance.

간 암발야 시킨 녹두의 성장길이를 측정하였다 저해물질 생성에 미치는 질소원의 영향

Peptone을 제 외 한 glucose-peptone배 지 에 각 각의 질소원의 농도플 0.2%되도록 첨가하여 본 균주를 5 일간 30 "C에서 진탕배양시켜서 저해 물질 생성능을 검토해 본 결과 Table 5에서 보 는 바와같이 peptone 이 나 casein hydrolysate 를

Table 5. Effect of nitro얄n 'Source on the produetion of the inhibitory su6st- ance.

N-source Cel1 dry weight Inhibi tion (mg/ml) ratio (%)

none 0 0

NaNo, 1. 56 14. 5

(NH‘),NO, 0.44 15. 7

(NH,),CO 0.08 4.8

(NH‘),SO‘ 0.48 0

(NH‘),HPO‘ 1. 24 15. 7

peptone 1. 64 49.4

casein hydro\ysate 1.50 47.0 beef extract 0.88 13.3

asparagme 2.98 10.8

corn steep Iiquor 0.64 12.0 Zero point two percent of each ni trogen source was used.

Metal salt Cell dry weight Inhibition (mg/ml) ratio (%)

none 2.40 32

Co-acetate 3.00 38

Pb-acetate 3.08 39

MnCl, 2. 29 17

MnSO‘ 2.44 23

ZnCl, 2. 19 35

CuSO‘ 2.80 58

FeCI, 1. 95 3

FeSO‘ 2. 18 28

MgSO‘ 2.69 38

MgCl, 2.69 44

Each meta\ sal t was added wi th the concen- tration of O. 1 mM to the medium containing 1 % glucose, 1% peptone, 0.1% NaCI, and 0.05% K

,

요 약

식울종자의 발아생장에 대한 저해물질을생성 하는 S treptomyces屬 균주 At-445를 토양에서 분리하고 그 애 oo~씌으로부터 저해물질을 정제 한 과정은 다음과 같다. 즉 본 균주의 배양액 을 anion exchanger인 Dowex MWA-l column 에 흡착， 용출시 켜 pH3.8에서 ethyl acetate 로

86

추출하였다. 그후 활성 단에 홉확 추출한 후 cation exchanger인 Dowex 50W column에 서 비 흉착부분을 ethyl acetate로 추출， 강압 농축하 여 무정형의 결청성 저해물질을 얻었다.

본 저해물질은 안정성이 커서 l00"C에서 1

시간동안 가열처리해서도 산， alkali에 걸쳐 대 단히 넓은 뱅위에서 그 활성을 유지 하였으며，

100"C에서 5 시간 가열처리했어도 그 잔존활성 도는 거의 변화되지 않았다. 또한 본 저해울질 은 항균력을 가지지 않았다.

본 균주의 저해물질 생성에 대한 검토를 위 해 30"C의 incubator 내에서 5 일간 진탕배양했 을 때 가장 좋은 결과를 얻었으며， 질소원으로 서 는 peptone과 casein hydrolysate, 탄소원으 로서는 soluble starch가， 금속영은 CuSO‘흘배 지로 사용했을 때 가장 많은 저해물질을 생성 하였다.

참고문헌

1. 山下泰平 : 植物 e 生理活뾰빼質. 南江효， 12 (1975)

2. 業田承二: 生物活性物質， 똥빼훌버版삼， 20 (1978)

3. Dalvi, R. R., B. Singh and D. K. Sal- unkhe : Biochem. Biol. Interactions

,

,

(1971) .

4. Dedolph, R. R., S. H. Wittwer and V.

Tuli:Science, 134, 1075(1961).

5. Halevy, A. H., D. R. Dil\ey and S. H.

Wittwer: Plant Physiol., 41, 1085(1966). 6. Reed, D. J., T. G. Moore and J. D.

Anderson: Science, 148, 1469(1965).

7 ‘ Jr. Beyer, E. M. : Plant Physiol., 50, 322 (1972)

8. Gaither, D. H. : Plant Physiol., 52, 1002 (1975) .

9. Raistrick, H., C. E. Stickings and R.

Thomas : Biochem. J., 55, 421 (1953).

10. Stol1, r., J, Renz and E. Caumann:

Phytopath. Z" 29

,

11. Stoll, C. e.nd J. Rênz: Phytopath. Z.,

29

,

12. Ta.ka.ha.shi, N. and R. W. Curtis: Plant Physiol., 36, 30 (1961).

13. Roy, W‘ C‘ : Þlant Physiol., 36, 37(1961).

14. Shlgêo, í., N. Shigeo åhd O. Shigenobu:

?‘etγ äÌìedron Lett., 45, 3977(1969).

15. Koaze, Y.: Bull. Agr. Chem. Soc. Japan, 21, 197 (1957).

16. Koaze, Y.: Bull. Agr. Chem. Soc. Japan 22

,

17. Koa.ze

,

18. 住木짧介 : 抗生物質 (上), 東大出版삼. 785 (1961) .

19. Kavana.gh, F.: Antîbiotic' assa.ys in “Me- thods in Enzymólógy", Academic Press, New York

,

,